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摘要

我们在体外非诱导和诱导条件下，在3D胶原凝胶支架(Cellmatrix Type I-A)上培养人骨源间充质干细胞(HMS0014:Yub621b)。常规透射电镜(TEM)观察MSCs和细胞外基质(ECM)支架的转化情况。非诱导的间充质间充质干细胞为成纤维细胞样细胞，包含不同数量的膜细胞器和质旁囊泡，其特征是伸长的细胞突起包住网状纤维;细胞基质凝胶在ECM中形成交织的纤维网络。在诱导条件下，骨髓间充质干细胞被骨诱导分化为多形性ob样细胞，延伸细长的突起，在ECM支架中形成细胞网。精细结构研究发现，骨传导始于细胞基质胶原网络上的接触成骨。在ECM支架中发现了细细胞基质原纤维被I型胶原原纤维和基质囊泡和同位胶原介导的矿化的时空替换。本研究结果表明，成熟的HMS0014 ob样细胞通过引导骨再生方法(GBR)的概念积极调节微环境沉积类骨组织。

关键字

间充质干细胞(MSCs)，细胞外基质(ECM)支架，引导骨再生法(GBR)组织

简介

先前的许多在体外间充质干细胞的培养研究_年代在钛(Ti)牙种植体(IP)上的研究表明，MSCs分化为成骨成骨细胞(Ob)样细胞，在诱导条件下，在钛(Ti)牙种植体(IP)底物表面以骨-IP直接接触(BIC)的方式开始成骨传导。成熟的ob样细胞是分泌细胞，表现为早期骨细胞表型和晚期成骨分化[1-3]。在最近的扫描电子显微镜(SEM)研究中，我们观察到小多边形人骨来源的HMS0014:Yub621b(成纤维细胞样间充质干细胞，骨，人;在骨诱导[4]培养180分钟内，细胞增殖分化为大的扁平多形性细胞，并发出许多细胞突起附着在钛(Ti)盘上。我们的组织化学研究结果显示，ob样HMS0014细胞从第1天开始被激活，启动成骨反应，因此矿化组织在实验的第7天和第14天显著沉积与钙化位点。此外，我们认识到ECM矿化显著进展，特别是在3D培养中[1,4-6]。

BIC界面的建立是通过pre-Ob细胞的成骨诱导，然后是水泥线沉积和附着性硬组织生长，从而在种植体底物表面诱导成骨现象[2,7-11]。此外，许多研究表明，在3D支架或胶原包被IPs上播下成骨MSCs可以增强细胞-生物材料相互作用，促进钛牙IPs的生长、分化和骨传导[1,5,7,12-15]。我们初步估计，细胞基质I-A型纤维成分形成了一个交织的支架网络，供MSCs在Ti-IP测试样品[11]周围形成硬组织。因此，在本研究中，我们对细胞基质I-A型凝胶3d培养的HMS0014: Yub621b细胞进行了透射电镜(TEM)检查在体外，重点关注ob样细胞的周转和ECM支架的矿化。

材料与方法

未成熟的HMS0014:Yub621b(成纤维细胞样间充质干细胞，骨，人;Riken BRC，筑波，日本)细胞过滤，离心，然后在POWEREDBY10(糖技术有限公司，札幌，日本)中孵育和维持，添加1%的抗真菌抗生素剂(100units/mL青霉素+ 100μg/mL链霉素;Nacalai Tesque，京都，日本)细胞培养75cm²烧瓶(TPP，瑞士)，37°C，在5% CO的潮湿空气中₂72 h。

MSCs在三维胶原凝胶支架上的组织工程研究

100mm塑料组织培养培养皿(IWAKI, Tokyo, Japan)铺以Cellmatrix Type I-A凝胶(基层)，铺以Cellmatrix Type I-A胶原凝胶中含有未成熟HMS0014细胞的细胞团簇(上层，细胞层)，然后覆以POWEREDBY10(添加抗坏血酸+)β甘油磷酸盐+ dexametazone;因此，在3D微环境中，细胞基质支架上的细胞被诱导成不同的成骨ob样细胞(1×10⁶细胞/毫升;湿度5% CO₂/37℃，放置21天)按“胶原凝胶包埋培养法”(http://www.nitta-gelatin.co.jp；Nitta明胶公司)，并被指定为实验组(试验组)的样品。

相比之下，本研究将HMS0014细胞在非诱导条件下(不添加成骨补充剂)与Cellmatrix共培养，并采用相同的Cellmatrix嵌入培养方法维持3天，制备为对照组(对照组)的样本。

实验组和对照组的组织学

在非诱导培养皿(对照:第1天和第3天)和诱导培养皿(实验:第3、7、14和21天)培养条件下培养的含有3d培养的HMS0014细胞的样品被解剖并制备用于本研究。

从对照组和实验组解剖的组织都是浸泡前固定(½Karnovsky固定剂)，后固定(1.0% OsO)₄)并嵌入EPON 812 (TAAB, Berkshire, UK)。epon包埋样品为半薄(1-2 μ m厚度)和超薄(70-90nm厚度)，用玻璃或金刚石刀用ultratome (ultrtome;LKB，斯德哥尔摩，瑞典)，并准备了测量光显微镜(LM)和常规TEM。

在玻片上取半薄片，用0.5%孔雀石绿(80℃，60-100sec)、0.5%甲苯胺蓝(80℃，30sec)和0.5%碱性品红(室温，10sec)染色。标本浸泡在雪松油中，埋入覆盖玻璃下，然后在安装有奥林巴斯FX380 3CCD数码相机系统的奥林巴斯BX41 LM下观察和拍照(奥林巴斯，东京，日本;操作系统:Windows XP，微软，CA，美国)。另一方面，超薄切片被采集在150目铜网格上;用醋酸铀酰和柠檬酸铅对标本进行电子染色，然后用日立H-7100 TEM(日立，东京，日本)按照常规方法进行检查和拍照。

目前的GBR方法在3D胶原支架内诱导人MSCs成骨，以积极调节开始骨传导的稳态微环境在体外．

结果与讨论

b样HMS0014细胞和细胞层内的ECM

1控制（第1天和第3天标本):非诱导型HMS0014细胞为球形、多边形(尺寸:10µm×40µm)的MSCs，其特征为树突状假足，延伸出许多细长的胞浆突起，包覆由ⅲ型胶原纤维和基质物质[16]组成的网状纤维(直径(d)=1 ~ 3μm);MSCs因此相互连接，在细胞层的疏松结缔组织中形成细胞网(图1a-1c)。成纤维细胞样间充质干细胞核质比(N/P)高，核呈椭圆形，内含杂染色质和正染色质。细部结构检查显示，非诱导条件下活性MSCs的胞浆中含有丰富的核糖体，胞浆中含有发育良好的高尔基复合体、布满电子致密物质的粗面内质网(ER)、丰富的传统形态的细长线粒体和少量的吞噬体溶酶体(图1b)。

图1所示。　LM & TEM of non-inducing HMS0014 cells cultured with Cellmatrix scaffold (day 3 control). 1a) LM of the MSC clusters. 1b) TEM indicates that the MSCs are fibroblast-like cells representing immature type of osteogeneic cells (N: nucleus, P: cytoplasm, ER: endoplasmic reticulum, M: mitochondrion, L: lysosome, G: Golgi apparatus). 1c) The MSCs have long and thin cytoplasmic processes to ensheath the reticular fibre (RF) containing thin collagen fibrils (cf) and amorphous materials. 1d) Cellmatrix collagen fibrils (▲: thin fibrils d≒10nm, indistinct band interval, ◆: thick fibrils; d=15-30nm, band interval=20nm ) are distributed in the ECM.

在ECM中，我们观察到细胞基质胶原蛋白网络主要由薄的(d≒10nm，带间隔=模糊)原纤维和少量厚的(d=15-30nm，带间隔d≒20nm)原纤维组成(图1d)。

结果表明，在Cellmatrix Type I-A凝胶中3d培养3天的非诱导MSCs是分泌细胞系细胞，但尚未被激活启动成骨反应或分化成成骨细胞(Ob)s(图1a-1d)。

实验(第3天至第21天标本)

TEM显示，骨诱导的HMS0014 oblike细胞胞质呈鼓鼓囊囊状(30µm×90µm - 100µm×200µm)，胞质丰富，N/P比低。细胞延伸出许多扁平的片状足和树突状的丝状足，结构表面修饰有许多微绒毛;细胞内连接紧密。细胞质中含有丰富的核糖体和形态浆，如内质网和高尔基体发育良好的膜质细胞器，许多线粒体表现出正常的结构，内室充满丰富的电子致密基质(图2a-2b)。此外，在细胞膜附近和细胞膜上分布着光滑表面的小胞浆旁囊泡(d≒150nm)，并观察到许多胞浆旁囊泡与特征电子密集溶酶体密切相关。膜质结构被认为是支持成熟ob样细胞的泡状运输(运输)机制的稳定和成熟模型的形态质。除了囊泡出芽外，基质囊泡(mv;d=30-300nm)显示在细胞膜上(图2b)。

图2。第7天实验组HMS0014细胞的LM和TEM观察。2a) LM显示细胞基质网中有ob样细胞。2b)骨诱导的HMS0014 ob样细胞胞体鼓胀，细胞质丰富，N/P比低。(N:细胞核，P:细胞质，ER:内质网，G:高尔基体，M:线粒体，L:溶酶体，PV:质旁囊泡)。两个基质囊泡(MV;d=40-300nm)和胶原介导的矿化事件发现在ob样细胞附近(圈出的区域)。

透射电镜观察到，第21天ob样细胞的胞浆中充满了发育良好的细胞骨架网络，由微丝(d=3-6nm)、中间丝(d=≒10nm)和微管(d=20-25nm;图3 c)。第21天ob样细胞核膜核孔扩张，核周池腔充满电子凝聚物;崩解的核膜包裹着一些浓缩染色质斑块和许多扩大的自噬液泡(图3a)。组织学显示，生长中的组织工程组织中的ob样细胞进入自噬变性的终末期，这是21例非凋亡程序性细胞死亡的一种类型^圣实验日。连接退行性细胞和相邻细胞的缝隙连接(GJS)明显(图3a-3b)。

图3。第21天实验HMS0014细胞的透射电镜。3a) 21个ob样细胞的核膜显示核孔扩张，核周池腔内充满电子凝聚物(L:溶酶体，M:线粒体，PV:质旁囊泡，▲:核周池腔，■:核孔扩张，*:自噬液泡)。3b) TEM显示GJS连接退化的第21天实验ob样细胞。3c)第21天ob样细胞的胞浆中充满了发育良好的细胞骨架网络(↑)。

诱导条件下培养的LM显示，在实验标本中，基底层的细胞基质胶原凝胶发出分支与细胞(上)层的ECM支架融合。细胞层分布有多形性细胞延伸出细长的突起，微染的细纤维和基质物质(图4a;第7天，图4b;另一方面，透射电镜观察到分布在基底层外围的细胞基质胶原凝胶分支被分为胶原翘和胶原纬(纤维;d≒1µm)，进一步展开细纤维扩散到细胞层(图4a, 4c-4f;第7天和14天)。细胞基质纤维由纤维胶原蛋白(d=10-40nm，带间距=模糊到20nm)和非晶基质组成，非晶基质与ECM混合，封闭相邻ob样HMS0014细胞之间的空间。此外，第3天至第14天的实验标本的透射电镜显示，在质膜附近有基质囊泡(MVs)分布和向细胞间ECM中央延伸的I型胶原纤维(d=25 ~ 40nm，带间距=50 ~ 60nm)的积累。精细的结构结果表明形成了连接基底层和细胞层的三维ECM支架。

图4。诱导条件下培养的第21天实验HMS0014细胞的LM和TEM。4a)显示第21天实验样品的基层和细胞层的半薄片的LM;在细胞基质支架(☆)周围发现水泥线(▲)沉积。4b)透射电镜显示，细胞层呈多形分布，细胞延伸细细长突起。4c-e) TEM显示在Cellmatrix支架(☆)的周边有纤维胶结线沉积(▲)和ECM中胶原介导的矿化(◆)，因此可以在Cellmatrix Type I-A三维支架上获得组织工程组织的直接成骨。4f)在中央ECM中，TEM显示与细胞基质I-A型胶原相关的矿化(■)。

在ECM支架的细胞基质纤维周围，发现了水泥线的沉积和胶原介导的矿化有助于接触成骨现象的发生)。相比之下，MV-和胶原蛋白介导的矿化事件(d=100-280nm)、针状晶体沉积和随后的钙化球石吸积以及钙化位点(尺寸=1.0µm×1.0µm到2.0µm×5.0µm)均通过成核现象在空间/结构部位形成。在实验的第3天至第14天，在细胞层的ECM中显示，它发生在ob样细胞附近和沿着胶原原纤维(细胞基质支架和ob样细胞分泌的胶原原纤维)。目前的TEM还显示在实验第21天的标本的ECM支架中有MV和胶原介导的钙化。然而，在第21天的标本的ECM中几乎没有发现细胞基质纤维或原纤维(图6)。

图5a-b和65a-b)第7天实验组TEM。5a)观察到胶原介导的矿化和钙化位点(↑)的形成与细胞基质I-A型胶原支架网络密切相关。5b)在细胞间ECM的中心区域，可见细胞基质I-A型胶原原纤维的分布(●:d=15-48nm，平均20nm)，带不明显(20nm带)。

图6。第21天实验组透射电镜观察。在ECM中发现基质囊泡(MV)-和I型胶原(★:d=30-40nm，带=60- 70nm)介导的钙化;细胞基质纤维或原纤维在ECM中几乎未被发现。

此前，我们研究了在诱导条件下不同表面底物修饰的Ti测试样品上培养的MSCs，结果显示未成熟的MSCs在180分钟内成骨诱导，在培养3天内分化为成熟的ob样细胞[1,4,5,10,11]。在本研究中，我们在细胞基质I-A型凝胶上3d培养HMS0014 MSCs，并特别研究了在诱导条件下细胞的周转和ECM支架。研究结果表明，HMS0014间充质干细胞是细胞间连接的成纤维细胞样细胞簇，代表一种更不成熟的成骨类型;在非诱导条件下(对照组)，MSCs分布在含有细胞基质胶原纤维的细微原纤维(d≒10nm，带间隔不清楚)和少量较厚原纤维(d=15-30nm，带间隔d≒20nm)的无定形基质物质中[16-18]。诱导培养实验的TEM观察结果表明，细胞基质凝胶制备了复杂的胶原纤维网络(d≒1µm)，胶原纤维分为原纤维/微原纤维(d=10-40nm，带间距=模糊到20nm)，分散在骨诱导的b样细胞分泌的也含有I型胶原的细胞间隙中，从而形成了含有混合胶原纤维的ECM支架。另一方面，我们发现在由纤维胶原蛋白和无定形基质组成的细胞基质纤维的外围，骨水泥线的沉积促进了接触成骨。同时，透射电镜显示，MV和胶原介导的矿化事件发生在ob样细胞附近，并沿着分布在ECM中的I型胶原和细胞基质纤维混合发生。结果表明，混合纤维的矿化现象和活跃的ob样细胞分泌的I型胶原增多导致ECM支架中纤维成分的变化。ECM支架中的细胞基质胶原被I型胶原所取代;在第21天的实验标本中，细胞基质纤维/原纤维不明显。

另一方面，TEM研究显示，成熟的3-21天ob样HMS0014细胞具有发育良好的细胞骨架和结构正统的特定线粒体中丰富的膜细胞器，以及与溶酶体空间密切相关的包被囊泡和核内体分布。在ECM中，我们观察到细胞膜附近/表面光滑的小泡出芽，以及细胞膜周边新生/薄的胶原原纤维的积累和MVs的微顶分泌;细胞内形态是与成骨ob样细胞的囊泡运输和转运机制有关的细胞器和副质[19-22]。

许多研究报道细胞内肌动蛋白丝皮层维持和调节细胞形态和细胞迁移中机械力的产生[6,22]。此外，皮质结构的应力纤维与局灶性粘附斑块耦合，以传导力到基质和支架，因此局灶性粘附处发生的化学和物理信号被传输到细胞，随后通过细胞间连接与邻近细胞共享[23-26]。综上所述，这些组织学研究结果表明，细胞内的细胞骨架元件组织成一种承载张力的结构，为进行细胞运动提供了三维结构支持，并传递有关细胞微环境的信息/信号[22,27,28]。我们之前的SEM研究表明，在诱导条件下，ob样细胞在ti基测试样品表面能很好地扩散[4,5,10,11]。在本研究中，我们观察到骨诱导的ob样HMS0014细胞在细胞体和外周细胞质中含有许多微丝、中间丝和微管。我们推测F-actin细胞骨架的分布与肌动蛋白应力纤维的分布相对应，肌动蛋白应力纤维有助于局部粘连的形成，这与我们之前在诱导条件下培养的HMS0014细胞的荧光免疫显微镜中F-actin和CD51的表达共定位[4,5,10,11]。

在本研究中，我们观察到一些第21天ob样细胞的超微结构特征是细胞质中分布着大量溶酶体，核膜解体，包围着浓缩染色质的斑块和许多电子密集的自噬液泡。组织学显示发生了非凋亡程序性细胞死亡，并指示在第21天3d培养的GBR组织中存活的成骨细胞发生了进行性自噬变性[29,30]。许多研究表明，自噬通过溶酶体降解途径的循环功能在本质上维持了内稳态和细胞的生存[30-32]。本研究发现，实验细胞通过GJS通道相互连接，通过传播和调节细胞杀伤信号，并在接触细胞之间引起旁观者效应，使得电脉冲在相邻细胞之间的传输在协调ob样细胞周转和能量稳态中发挥重要作用[23-28,33-35]。

它已经被一些2021年版权OAT报道。通过将间充质干细胞放置在生物可降解支架中，可减少骨缺损部位成骨细胞的招募需求[36-38]。我们此前曾报道，KUSA/A1小鼠MSCs gbr工程在3D细胞基质I-A型凝胶胶原网络有助于接触成骨提供直接BIC与钛牙科IPs[1,4,6,8]。目前的TEM研究显示，活性ob样HMS0014细胞含有提供囊泡运输和运输机制的形态质，并显示了与细胞和ECM之间的周转和相互作用有关的组织学发现，这些相互作用增强了ECM支架的骨传导。此外，我们发现gjs的配置与自噬介导的在矿化骨样组织中存活的ob样细胞的程序性细胞死亡相关[20,30-32,34]。

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