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摘要

为了研究短肽在胃裂(GS)中的作用，我们综合分析了羊水(AF)中的肽，建立了羊胃裂(GS)的胎羊模型。我们在妊娠60天的4只胎儿羊羔中创造了GS。3例GS胎和4例正常胎于足月(145天)经剖宫产分娩，采集房颤标本。用质谱法检测和鉴定AF样品中的短肽。合成了其中的一个肽，并对其功能进行了研究。在AF样品中共检测到77个肽峰。其中，有12个肽在GS组和对照组之间表现出显著的强度差异。12个多肽中有3个被鉴定出来。GS组中检测到的高强度肽是羔羊膜联蛋白7 (ANX7)的氨基酸(AA) 135 ~ 185。通过细胞因子阵列研究，人类ANX7蛋白AA168-211的合成肽与羔羊ANX7蛋白AA135-185对应，减少了间皮细胞抗炎细胞因子的分泌。 We report a unique AF peptide profile in a GS model. One of the peptides increased in GS was suggested to possess pro-inflammatory potential. These peptides would be related to the pathophysiology of GS.

关键字

胃裂，胎儿手术，肽，羊水，细胞因子，羊

简介

胃裂症(GS)是一种先天性疾病，其特征是腹壁缺损，肠通过腹壁突出。缺损几乎总是位于脐[1]的右侧。产前诊断通常是通过超声观察肠管漂浮在羊水(AF)。在过去几十年里，GS的发生频率有所增加，从1980-1984年的0.6/10,000活产增加到2000-2002年的2.33/10,000活产。GS零星发生，似乎没有遗传联系。GS的发病机制尚不清楚，但可能与生理性脐疝破裂和脐静脉[3]后退有关。最近，GS的预后已明显改善，在封闭[4]期间使用筒仓和随时可用的全肠外营养[5]。然而，与肠水肿、宫内生长迟缓、羊水过少和/或肠闭锁相关的GS预后仍然较差。在许多患有GS的婴儿中，突出的肠道被一层纤维素“皮”覆盖。宏观上可见缺血性改变和扩张。 Histologically, there is thickening and edema of the muscularis mucosae and serosal layers [7].

有几种理论被提出来解释GS的肠道炎症和“剥离”的发展，其中与房颤接触最常见的是[8]。据报道，慢性炎症的标志铁蛋白水平以及促炎细胞因子白介素(IL)-6和IL-8水平在GS[7]患者的房颤中显著升高。GS[7]患者的AF中也检测到许多炎症细胞，如巨噬细胞。在这种情况下，确定房颤中是否存在可能影响突出肠的生物活性分子将是非常有趣的。可能的蛋白质包括上面提到的IL-6和IL-8。尽管房颤中的蛋白质成分已经在人类中得到了全面的分析在活的有机体内据我们所知，尚未对GS患者的[9]、AF蛋白进行分析。

另一种重要的分子类型是短肽。短肽被认为是由前体蛋白的生理切割和各种蛋白的病理降解产生的。前者包括必要的生物活性肽，如物质P[10]和防御素[11]。作为蛋白质病理降解的例子，C3f-des-arginine (C3的一种降解产物)水平在系统性硬化中升高，C3f-des-arginine也增强了血管内皮细胞[12]的增殖。据报道，在显微镜下多血管炎中，载脂蛋白a的一种降解肽AC13水平升高。此外，AC13还能促进内皮细胞[13]产生IL-6和IL-8。然而，迄今为止，人们对这种降解介导的多肽知之甚少。据我们所知，目前还没有关于GS中AF降解介导肽的报道，因此我们试图通过GS的胎羊模型来阐明短肽的分布。

材料与方法

羊胚胎GS模型的建立和AF样本的采集

对妊娠60天的羔羊进行手术制备实验性GS。术前管理和麻醉技术已有报道[14,15]。全麻下，通过左侧切口暴露子宫，4例胎儿行横向剖宫产术。在胎儿腹壁的左上部做一个切口，通过切口轻轻将肠子送出。将胎儿放回子宫，用3-0 Biosyn分2层闭合子宫。母羊的腹壁用Biosyn或polyorb分层封闭(US Surgical, Tyco Healthcare, Tokyo, Japan)。以正常羔羊(n=4)的AF样品作为对照。

胎儿在足月(145天)时通过剖宫产分娩，用注射器收集约4毫升房颤样本，立即用干冰冷却并保存在-80℃^ºC。

本研究获得了奥塔哥大学惠灵顿动物伦理委员会医学和健康科学学院伦理委员会的批准(惠灵顿，新西兰批准号2-12)。

AF肽的检测与鉴定

用弱阳离子交换(MB-WCX;Bruker Daltonics, Ettliongen, Germany)如前所述[16]。采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS;力量Daltonics)。

为了对感兴趣的多肽进行鉴定，将esi -离子阱质谱法获得的多肽的MS/MS数据根据绵羊基因指数进行MASCOT MS/MS离子搜索(Matrix Science, London, UK)的搜索程序。当MASCOT搜索结果提供显著的分子量搜索(MOWSE)评分(p< 0.05)时，接受肽识别。

Western blot分析

由于尚无抗羔羊ANX7的抗体，因此使用兔抗人ANX7多克隆抗体(Lifespan Biosciences, WA, USA)检测羔羊annexin A7。在初步实验中，我们证实抗体对羔羊ANX7有反应(数据未显示)。从AF样品中提取的蛋白质用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在阻塞缓冲液(含有2% ECL主要阻断剂(GE医疗保健)和0.1% Tween-20的TBS)中阻塞1小时后，膜以1:500的稀释度与抗anx7抗体反应1小时。洗涤后，结合抗体与辣根过氧化物酶(HRP)偶联山羊抗兔IgG抗体(Dako, Glostrup，丹麦)和HRP底物进行反应，使用ImmunoStar LD (Wako Co.， Osaka, Japan)。最后，使用图像分析仪(LAS-3000多功能成像系统富士胶片，东京，日本)检测免疫反应带。

细胞因子的数组

合成了与人膜联蛋白A7的AA168-211相对应的肽段，命名为hA7(168-211)。hA7(168-211)区域是羔羊膜联蛋白7的AA135-185的同源部分。

成人间皮(HAM)细胞购自Zen-bio (CA, USA)。将HAM细胞接种在直径为10 cm的1型胶原包被培养皿上，在37℃培养^°在含5% CO的常氧空气中₂间皮细胞生长培养基(ZEN-bio, CA, USA)。将HAM细胞在饥饿培养基(medium 199, Life Technologies, CA, US)、2%青霉素G(10000单位/ml)/Storeptomycin (10 mg/ml) (SIGMA, UK)、10%炭葡聚糖处理的胎牛血清(Thermo SCIENTIFIC, MA, US)中培养24小时后，细胞进一步与400n mol/ml的hA7(168-211)一起孵育48小时。最后，收集细胞培养物的上清，并使用市售的人类细胞因子阵列面板a (R&D systems, Inc, MN, USA)进行细胞因子阵列分析，其中包含36种不同的细胞因子(补体成分C5a、CD40配体、G-CSF、CXCL1/GRO α、CCL1/I-309、sICAM-1、IFN-γ、IL-1 α、IL-1 β、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 p70、IL-13、IL-16、IL-17、IL-17E、IL-23、IL-27、IL-32 α、CXCL10/IP-10、CXCL11/I-TAC、CCL3/MIP-1 α， CCL4/MIP-1 β， CCL5/RANTES, CXCL12/SDF-1, Serpin E1/PAI-1, TNF-α， TREM-1)

统计分析

GS组与对照组肽离子强度的差异用Student’s t检验计算。P< 0.05为差异显著。

结果

羊胚胎GS模型的建立

我们用4个妊娠60天的羔羊胎儿创建了实验GS，如图1A所示。在足月(145天)时，4个胎儿中有3个出现GS(表1)。图1B显示了一个典型病例。剖宫产前用18G针穿刺子宫壁，采集AF标本。以健康母羊的4个足月羔羊胎为对照。GS组和对照组的胎儿冠到臀长和体重无显著差异，但GS组的平均体重略重(表1)。与对照组相比，GS组AF蛋白浓度的平均值显著升高(表1)。

表1。实验羔羊和对照羔羊的胎羊的轮廓

集团	数量	体重 (g)	Crown-to-rump长度 (厘米)	GS	AF蛋白浓度 (毫克/毫升)
GS	1	3860	45	+	5.32
	2	1890	37	+	4.84
	3.	3300	45	+	1.00
	4	3472	44	-	4.40
平均数±标准差		3130.5±859.5	42.8±3.86		3.89±1.96*
控制	1	1966	34	-	0.39
	2	1966	44	-	0.87
	3.	2766	44	-	０．２５
	4	2976	37	-	0.51
平均数±标准差		2418.5±529.5	39.8±5.06		0.54±0.31

GS=胃裂，AF=羊水，SD=标准差，*= p< 0.05 (t检验)。

图1所示。羊胚胎GS模型的建立。(a)妊娠60天，剖宫产术暴露胎儿，然后切开左侧上腹壁，通过切口轻轻排出肠道(箭头)。(b)实验性GS的胎儿在足月(145天)分娩。

AF样品中肽峰的检测

然后我们用MB-WCX从每个AF样品中纯化肽段，用MALDI-TOF-MS测定AF样品在2000-10000 m/z范围内的肽段谱。在本实验中，不含GS的4号羔羊AF样品被省略。在AF样品中共检测到77个肽峰。单个羔羊胎儿的肽谱以及GS (n=3)组和对照组(n=4)组的平均肽谱分别如图2和图3所示。

图2。经MALDI-TOF/MS检测，除腹壁封闭组和对照组(n=4)外，GS组(n=3)均检出AF肽峰。M /z=质量电荷比。

图3。GS组(n=3)和对照组(n=4)的平均AF肽谱。箭头为GS组与对照组差异显著的多肽(P< 0.05)。黑色箭头=肽序列被识别。白色箭头=肽序列未被识别。M /z=质量电荷比。

GS组与对照组肽谱的比较

然后我们比较了GS组和对照组之间检测到的77个肽峰的强度。12个肽峰的强度在两组之间有显著差异(图3)。具体来说，12个肽中有9个在GS组的强度比对照组高1.5倍以上。其余3个肽在GS组中的强度低于对照组的1/1.5倍，如表2所示。

表2。GS组与对照组的肽峰分析

差异(x)	肽峰数
(折叠变化，GS/控制)	平均单	具有统计学意义
3.0 < x	15	6
2.0 < x	23	9
1.5 < x	31	9
1.5≤x≤1/1.5	24	0
x < 1/1.5	22	3.
x < 1/2.0	13	2
x < 1/3.0	6	1
总肽峰	77	12

两组间差异显著的多肽的鉴定

然后通过质谱分析和蛋白质数据库检索对这12个多肽进行了鉴定。结果，我们从12个多肽中筛选出3个，分别是ANX7的氨基酸残基(AA) 135-185、核孔糖蛋白p62 (NUP62)的AA163-218和泛素融合降解蛋白1同源物(UFD1)的AA89-153，如表3所示。

表3。鉴定出GS组与对照组之间有显著差异的多肽。

版权所有OAT。版权所有

肽 (m / z)	差*	已识别的氨基酸序列 (氨基酸位置)	理论 (m / z)	原蛋白	吉祥物 分数
5486.6	5.54	(135aa-185aa)	5487.8	膜联蛋白A7 (ANX7)	75
5447.1	4.99	ttttttttts TSTTGFSLNIKPLTPAGIPSN TAASGSAPSGPS VAAGGSGSAALT (163aa-218aa)	5449.5	核孔糖蛋白p62 (NUP62)	71
6867.3	2.22	spgprasgarlrr LPLRGGVGGPHRQRS PAQRSGRARRRRPP CSPSTCSTTR SPGSSRAASPRSTA (89aa-153aa)	6870.6	泛素融合降解蛋白1同源物 (UFD1)	65

m/z=质量/电荷比，aa=氨基酸，*= GS/Control在强度上的折叠变化

从GS胎羊模型中检测AF中完整的ANX7

如前所述，我们证实了患有GS的胎羊AF中12个肽的强度增加，并确定了其中3个肽。我们将重点放在羔羊ANX7的AA135-185中的一个肽上，扩展了我们的研究。首先，我们研究了western blotting是否增加了完整的ANX7分子数量。结果，在GS和正常AF样品中均检测到预期分子量(MW)为49.9 kDa的完整的ANX7(图4A)。完整的ANX7条带强度在GS羔羊和对照组羔羊之间没有显著差异(p=0.432)，如图4B所示。这表明，ANX7的AA135-185肽的增加可能是由于ANX7的产量和裂解量的增加。

图4。GS组和对照组AF样本中ANX7完整检测。(A)用抗人ANX7多克隆抗体western blot检测完整羔羊的ANX7。在初步实验中，我们证实该抗体对羔羊ANX7有反应。(B)用图像分析仪计算出ANX7的相对强度。“对照”的相对强度平均值定义为1。将强度与GS组和对照组进行比较。NS=不显著。

人ANX7肽对HAM细胞分泌细胞因子的影响，该肽对应于羔羊ANX7的AA135-185

然后我们检测了ANX7中AA135-185羔羊的区域是否影响细胞功能。为此，我们合成了人类ANX7蛋白AA168-211的肽段(hA7(168-211))，该肽段与羔羊ANX7蛋白AA135-185的区域相对应，并检测了合成肽段对HAM细胞分泌各种细胞因子和可溶性因子的影响。

我们培养含有或不含hA7(168-211)的HAM细胞，然后将培养上清应用于细胞因子阵列。结果，10个可溶性因子(sICAM-1, IL-Ra, CXCL-1, IL-6, IL-8, IL-13, IL-27, MCP-1, MIF和serpin E1)在hA7(168-211)刺激或非刺激面板中阳性检测到。(图5)。在10个可溶性因子中，IL-1Ra、sICAM-1、IL-27和MIF 4个因子变化大于1.5倍或小于1/1.5倍。经hA7(168-211)刺激后IL-1Ra的强度显著降低(0.34倍)。sICAM-1、IL-27和MIF的表达强度较低(分别为0.66、0.63和0.66倍)。这表明，一个ANX7片段，hA7(168-211)，影响细胞分泌的细胞因子和可溶性因子的概况。

图5。hA7(168-211)对培养间皮细胞分泌细胞因子的影响。(a)在饥饿培养基中培养24小时的人成年间皮细胞，在加入或不加入hA7(168-211)的情况下进一步培养48小时。然后收集细胞培养物上清，进行细胞因子阵列分析，其中包含36种不同的细胞因子重复。上图中下划线点表示有可检测表达水平的细胞因子。A1, A10和E1:检测阳性对照点。E19和E20为阴性控制点。(b)测量(a)中各细胞因子的斑点强度。在10个可检测到表达水平的细胞因子上，它们在hA7(168-211)的刺激下发生了双重变化。它们的名称、点在(a)中面板中的位置以及它们的折叠变化描述为“名称(点位置/折叠变化)”。

讨论

在本研究中，为了阐明某些GS婴儿“剥落”的病理生理学，我们建立了一个GS胎儿羊模型，并综合分析了AF的肽段。到目前为止，尚未有关于人类和实验动物模型中GS AF肽段的报道。我们的研究结果如下:首先，在尝试创建GS的4个GS中，有3个在学期时显示了GS。第二，在检测到的77个AF肽中，有12个肽的强度在GS组和对照组之间存在显著差异。第三，12个肽中有3个被鉴定为ANX7的AA135-185、NUP62的AA163-218和UFD1的AA89-153。第四，正常组与正常组之间，完好的ANX7水平无显著差异。

在第一点上，我们尝试用4个羔羊胎儿建立一个GS模型，并不是所有的手术胎儿都在足月出现GS。这表明，在早期妊娠羊胎的腹壁上的一个简单切口可以愈合，除非有足够的肠道通过缺陷。在GS患者中观察到的腹壁缺损可能涉及维持腹壁缺损和GS的另一个因素。或者，创建实验GS的时间可能很关键。在这里，实验GS是在妊娠60天时创建的，作为我们的第一次试验，因为我们成功地在妊娠的同一天创建了一个梗阻性尿病羔羊模型，之前[17]。然而，如果我们在妊娠后期进行手术，可能会更成功地创造出GS。这一点应该在以后的试验中得到澄清。

第二点，在检测到的77个AF肽中，有12个肽的强度在GS组和对照组之间存在差异。这表明AF中含有的蛋白质是降解肽的来源，在GS中是倾斜的。或者，可以改变实际产生降解肽的蛋白酶的概况。考虑到有报道称在GS[7]患者中AF中的蛋白质数量增加，以及在我们的研究中，尽管ANX7的完整水平不变，但ANX7的AA135-185却增加，这两种机制可能与GS患者AF中蛋白质的异常降解有关。

在第三点和第四点，我们成功识别了12个肽中的3个。这项研究中的识别率低于我们在人体研究中通常的识别率。这可能是由于羔羊的蛋白质数据库比人类的小得多，这将阻碍有效的蛋白质识别。

这三种多肽的亲本蛋白之一是ANX7。在人类中，ANX7的产生在肝脏、肾脏、脾脏和胎盘[18]中被证实。因此，在这里检测到的AF中的ANX7被认为来自羔羊的胎盘。在功能上，在人类[19]中，ANX7通过磷酸化激活促进胞吐。因此，siRNA降低ANX7可以减少SW982细胞[20]中IL-8的分泌。此外，据报道，在类风湿性关节炎患者的滑膜细胞中，总和磷酸化的ANX7都增加了。抗anx7抗体能抑制II型胶原诱导的小鼠[20]关节炎。从这些报道来看，ANX7可能促进炎症。然而，我们在这里证明，ANX7本身的数量在GS组和对照组之间没有显著差异。因此，AF中完整的ANX7不太可能作为独立因素导致GS中的肠道炎症。

在我们的研究中，我们证实了ANX7的AA135-185的增加。在这种源于ANX7的肽的生产过程中，一定的内肽酶参与了在Gly135和Val185之间切割ANX7。因此，我们使用MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/)程序搜索这样的内肽酶。然而，我们没有发现通过ANX7的裂解产生肽的内源性肽酶(数据未显示)。生产AA 135-185的机理有待进一步研究。另一个兴趣是ANX7的AA135-185肽是否具有生物活性。我们此前证实，载脂蛋白A的c端13AA对应的AC13增强了内皮细胞[13]中IL-6和IL-8的分泌，而C3f的16aa长肽des-Arg-C3f增加了真皮微血管内皮细胞[12]中转化生长因子1的生成。我们推测，ANX7的AA135-185肽可能与GS中所见的“剥离”的病理生理有关。因此，我们进行了细胞因子阵列研究，以阐明肽的功能。我们在这里使用的是火腿细胞和hA7(168-211)而不是羊羔ANX7的AA135-185。 It was because no lamb cell line was available and the final goal of our research was elucidation of biochemical mechanisms for GS in humans. In GS, the serous membrane derived from mesodem is exposed to AF. Thereby we selected a human mesothelial cell line of HAM cells as target cells. Among detected the 10 soluble factors, no factor showed more than1.5-fold changes and 4 factors of IL-1Ra, sICAM-1, IL-27, and MIF showed less than1/1.5-fold changes. The most decreased by the stimulation with hA7 (168-211) was IL-1Ra, an antagonist for the IL-1β receptor, which possesses anti-inflammatory activities by inhibiting the binding of IL-1β to its receptor [21]. Similarly, sICAM-1 has been thought to have protective functions from inflammation [22]. IL-27 has been reported to show anti-inflammatory activities by suppressing pro-inflammatory cytokines [23]. Thereby, the down-regulation of IL-1β, sICAM-1, and IL-27 by hA7 (168-211) would contribute to the inflammation of the bowel in GS. Of course, since the stimulation with hA7 (168-211) increased the level of MIF, an inflammatory mediator, and this cytokine array assay was rather simple screening, the contribution of hA7 (168-211) to the inflammation should be confirmed by future studies.

另外两个鉴定肽的亲本蛋白为NUP62和UFD1。NUP62是核孔复合体[24]的重要组成部分。然而，NUP62及其降解肽在GS中的作用尚不明确。UFD1参与泛素化蛋白质的代谢。UFD1的功能在很大程度上是未知的。其降解肽在GS中的作用完全未知。我们计划在不久的将来对此进行调查。

综上所述，我们在本研究中建立了一种GS胎儿羊模型。与对照组相比，我们检测到AF样品中增加的12个肽，并鉴定出3个肽。其中一个增加的AF肽hA7(168-211)的人类同源物被发现具有促炎潜能。在GS模型中增加的多肽可能参与了GS中所见的“剥离”的病理生理学过程。

利益冲突

作者没有披露与本研究有关的经济利益冲突。

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