双歧杆菌属细菌的抗氧化、抗菌和抗肿瘤活性，选自人类胃肠道

摘要

乳酸菌(LAB)的拮抗特性包括双歧杆菌是众所周知的。这主要涉及各种致病性微生物，它们会导致食品变质和不同程度的人类疾病。这种特性可以用乳酸菌生产的细菌素来解释。癌症与微生物、细菌和病毒之间有一定的关系。然而，关于通过激活微生物的作用抑制癌细胞的可能性的信息实际上是缺乏的。新分离株SK1、SK2、SK8和SK11已鉴定为双歧杆菌属．具有广泛的抗氧化、抗菌和抗癌特性，抗四种菌株双歧杆菌属研究了SK和细胞试验培养。人们发现双歧杆菌属SK1, SK2, SK8, SK11完全抑制大肠杆菌В-6954,金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,沙门氏菌血清ATCC 14028，肺炎克雷伯菌b-7001.关于酪丁酸梭菌LMG抑制活性仅在SK2株中观察到。抗肿瘤活性双歧杆菌属分离物决定了它们在预防和癌症即时治疗中的应用前景。例如，作为化疗缓解期癌症患者产品恢复的基础。

关键字

抗癌，乳杆菌，生物活性微生物代谢产物，细菌素

介绍

不管经济发展如何，人们死亡的主要原因之一是癌症[1,2].现有的医疗技术只能在有限的情况下实现完全康复，而且通常是在早期诊断的情况下。康复技术在化疗期间或化疗后发挥了重要作用，副作用是一个严重问题[3,4]。开发既能进行预防又能降低癌症患者死亡和致残风险的技术至关重要。

有论文研究了癌症与微生物、细菌和病毒之间的关系[5-11]，但实际上缺乏通过暴露于微生物来抑制癌细胞的可能性的信息。乳酸菌制剂的潜在作用可考虑为在体外研究中对致病菌、真菌和酵母表现出抑制活性的乳酸菌[12-24]。

乳酸菌的主要种类有乳酸菌和双歧杆菌属，肠球菌和酵母菌[25-30]乳酸菌在食品、农业和加工业、医药、生物技术、化妆品等领域有着悠久的使用传统[31-39]。乳酸菌是一类最常用的生物，因为乳酸菌的活性决定了其作为文化保护区的可能性[40].乳酸菌的广泛抗菌、抗真菌活性决定了其在生物保护技术中应用的可能性[15,20-23,41-48]。

为了解决实际问题，需要对不同培养物进行大规模的初始筛选试验乳酸杆菌指定的质量负责。

在目前的研究中，研究了四种活性菌株，以前从人类胃肠道分离。目的是鉴定和表征它们的抗氧化和抗菌性能，确定分配的细菌素和设置这些代谢物的抗肿瘤活性。由于对人类微生物谱和细菌素对细胞和微生物培养的作用机制了解不足，因此对分离菌株进行分类鉴定和鉴定的重要性是确定的。我们研究了分离物的体外电位双歧杆菌属和它们的细菌素来抑制癌细胞的培养

材料和方法

乳酸菌分离物、培养基和培养条件

本研究预筛选出4株经鉴定为SK1、SK2、SK8、SK11的乳酸菌。它们是从不同年龄组的500名健康和癌症患者的胃肠道中分配的(俄罗斯联邦)。纯培养物以冻干形式保存在4±2℃下。在测定菌株之前，在厌氧条件下(Biostat A + MO发酵罐，Sartorius，美国)在MRS-broth中37℃预培养24小时。

采用离心(3500转/min, 30 min, 4℃)收集过夜培养的微生物，用磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)洗涤2次。将细胞浓度调整至10⁵分别为CFU/ml，将细菌加热至95℃1 h获得细胞。热处理后，用PBS洗涤细胞并在合适的培养基中重悬，以分析其活力。细胞培养物离心(3500转/min, 30 min, 4°С)进行分离。细胞颗粒被洗涤并在100ml PBS中重悬20分钟(每隔一分钟)，超声在冰水中进行(4°С)。离心(14 000转/min, 1 h)去除细胞碎片，过滤上清液杀菌(孔径为0.22 nm;Sartorious,哥廷根,德国)。

在MRS肉汤中使用指数LAB培养物作为接种物进行抑菌、抗氧化和抗癌试验:肿瘤细胞和试验细胞在含有收集的乳酸菌细胞(~10⁵CFU/ml的对数相生长的每个菌株)培养24小时，然后转入室。

试验培养基、培养基和生长条件

使用试验菌株：大肠杆菌В-6954,金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,沙门氏菌血清ATCC 14028，肺炎克雷伯菌В-7001,英诺克李斯特菌液化沼气,酪丁酸梭菌液化沼气,乳杆菌，嗜酸乳杆菌，乳杆菌，乳酸菌paracasei，发酵乳杆菌，唾液乳杆菌，干酪乳杆菌，这种乳酸菌，链球菌agalactiae，肠球菌都有效，来自克麦罗沃食品科学与技术研究所(大学)生物技术研究所的实验室收藏。采用标准营养培养基上培养的试验菌株夜间肉汤培养的浆液进行工作。在595 nm波长下采用光密度法测定悬浮液中微生物数量(效价)。

试验培养物在37°С的肉蛋白胨琼脂（MPA）上培养24小时；用微生物环收集琼脂表面的细胞，并在NaCl溶液中再悬浮10分钟⁹．37℃MRS-broth培养杆菌24 h, 2000转/min离心10 min，分离上清。对于细胞分离，上清通过Millex-GV (0.22 um, Nihon«Millipore»，美国)过滤。在培养皿中加入芽孢杆菌属各菌培养物180 ul，然后在培养皿中加入各试验菌株20 ul。37℃孵育24小时。对照:无菌MRS-broth 200 ul，纯培养基180 ul，每种病原体溶液20 ul。通过测定[31]培养过程中的光密度来监测细菌的生长。

采用MRS培养基和溶源肉汤(LB)检测乳酸菌的拮抗活性。将培养基组分溶于1 dm³的蒸馏水中，加热至琼脂完全融化，分配到试管或烧瓶中，在121℃下消毒1小时。

细胞培养及癌细胞黏附

作为试验培养，使用了来自瑞典卡罗琳斯卡癌症中心收集的以下癌细胞：LBR2 Burkitt淋巴瘤、人乳腺癌MDAMB-231、人胰腺癌PANC-1。

细胞在37°C和СО的5%条件下培养₂在RPMI 1640培养基(PanEco, RF)中，含有10%胎牛血清(HyClone Laboratories, Logan, UK)，在56℃灭活30分钟，2 mM的L-谷氨酰胺，100 ug/ml青霉素和100 ug/ml硫酸链霉素(PanEco, RF)。使用4 AxioVision系统(Zeiss，德国)对细胞进行光镜观察。在Goryaev室用台盼蓝染料排除(PanEco，俄罗斯)测定细胞活力。

达到对数生长期的肿瘤细胞以5·10传代至96孔平板(“Costar”)⁴- 6.5·10⁴在СО条件下，预孵育24 h后加入试验生物₂5%, 37°С。获得的细胞培养物在逐渐降低的浓度范围内加入细胞培养孔(20至180 ul的细胞悬液)，共孵育48小时。对照孔加入适量0.9%氯化钠溶液(20 ul)。年底的潜伏期,活细胞的数量是确定井的MTT比色测定基于能力的脱氢酶活细胞减少3 - (4 5-dimethylthiazol-2-il) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)紫色甲瓒晶体,溶于二甲亚砜。用Multiskan MS (Labsystem, Finland)平板光度计测量二甲基亚砜有色溶液在λ = 540 nm处的光吸收。

人胃肠道乳酸菌分离物的鉴定与鉴定

为了鉴定SK1、SK2、SK8、SK11菌株的分类标准，采用生化方法[49-52]，采用API20E、API20 Ne、API Staphy Step和API (BioMerieux，法国)，按照[53,54]的建议进行鉴定，然后通过16S rRNA序列进行遗传鉴定。

LAB菌株的表型特征

已根据表型标准获得经典表型特征。[55]。通过生物显微镜AxioScope A1（德国卡尔蔡司）测定细胞株的形态，使用革兰氏染色的革兰氏集测试细胞株（莫斯科Lab Biomed），或通过催化反应，在15°C条件下，在30°C条件下连续7天，在37°C条件下连续2天，从葡萄糖和MRS肉汤中的生长能力中释放气体。

乳酸菌的分子鉴定和基因分型

使用一组反应物“PROBA-NK”从生物材料中分离DNA，从而进行DNA微生物的分离（DNA技术，俄罗斯）。

琼脂糖凝胶电泳使用水平电泳室SE-2和电源“Elf-4”(Helicon，俄罗斯)进行。为制备2%的琼脂糖，将50ml单TBE缓冲液加到1g琼脂糖中，并充分混合。将得到的溶液放入微波炉中(2-5分钟，视炉容量而定，观察悬浮液的沸腾强度)或在水浴中加热15分钟，使琼脂糖完全溶解。将熔融琼脂糖冷却至56℃，加入5 ul溴化乙锭(10 mg/ml)，并彻底搅拌。将熔融的琼脂糖和溴化乙锭倒入准备好的锅中。凝胶厚度为0.5 ~ 0.7 cm。30-40分钟后，取出梳子。成品凝胶立即使用或储存在4°c冰箱的单个缓冲液中。电泳时，2 ul的加载缓冲液和10 ul的反应混合物在一个单独的管中混合。将混合物加入凝胶孔中(缓冲液/反应混合物的比例- 2/8)。在其中一口井中加入分子量标记物(100bp)。 Filled gel was placed in the electrophoresis chamber filled with buffer. The thickness of the buffer layer over the surface of the gel was about 2-3 mm. In constant voltage mode 100 B electrophoresis lasted 70-90 minutes. For the validation of the obtained results 100 bp of DNA-marker (SibEnzyme, Russia) was placed in one of the wells. Composition of buffer for storage: 10 mM of Tris HCl (pH 8,0); 1 mM of EDTA; 50 mM of NaCl.

聚合酶链反应是使用由“Synthol”（莫斯科）特别选择和合成的引物进行的。考虑到扩增片段的长度以及所用引物的长度和组成，选择温度条件。

PCR产物采用gtg -琼脂糖(美国Lonza Rockland)分离纯化。试管与放大产品一致展示在一个三脚架，1/5的紫色晶体着色剂加入(默克，德国)和搅拌。从油层中提取20微升的样品，并将其添加到凝胶孔中，然后关闭腔盖。将直流电流连接到相机，曝光源参数(电压250V，电流100ma，持续时间7min)，然后接通正确的极性。本实验的最佳电场强度为10 V/cm。

电泳完成后，将凝胶放置在透光器上，将条带水平放置在孔上。用外科手术刀仔细切割琼脂糖凝胶道，用70%乙醇溶液进行初步处理，含所需大小PCR反应产物，尽量少抓取凝胶，并将其放入相应数量的试管中。在切割下一节之前，手术刀用70%的乙醇处理，以避免样本污染。将含有反应聚合酶链反应产物的琼脂糖凝胶切成条，放置在修剪过的200微升体积的滤嘴内。试管以最大速度离心5分钟。

对所选样本的处理质量和数量进行了评估。为此重复了水平琼脂糖凝胶电泳。根据Segnera法对分离微生物的16S RNA基因片段进行测序，使用试剂试剂盒“ABI Prism Big Dye Terminator Cycle sequincready Reaction Kits”(Applied biosystems, USA)和GS Junior sequencer 454 (Roche, Switzerland)进行测序。使用Sanger吸附剂Sephadex G50 Superfine (Biosciences, Sweden)对反应产物进行纯化。

DNA菌株SK1、SK2、SK8、SK11通过Weisburg等人[56]的方法使用引物组（Synthol Moscow）进行扩增。获得的16S rDNA-PCR产物通过GFX基因组血液DNA纯化试剂盒（Amersham Biosciences）进行纯化，DNA用作标准测序程序的模板（Macrogen Inc，韩国首尔）.编辑序列以消除结合位点的PCR引物，并手动校正序列扫描仪1.0（应用生物系统公司）使用BLAST程序与可用的核苷酸基因库数据库进行比较。使用Mega 6软件生成亲缘树，使用程序BioEdit对齐核苷酸序列，使用最近邻法（neighbor加入NJ）构建系统发育树[57]。序列为16S肉毒梭菌以菌株ELTDK 103为根。用bootstrap方法对所得到的系统发育树的稳定性进行了评价。

细菌素的分离纯化

采用俄罗斯专利(no . 2492231[58])的方法分离纯化细菌素;也就是说,将培养液浓缩在中空纤维上，加入干NaCl，在摇杆上搅拌;悬挂离心机,上层清液pH值调整到3.0,由此产生的悬浮离心,沉淀被添加到水,然后添加沉淀悬浮和酒精,孵化30分钟在0°C,离心机,酒精被蒸发从解决方案中删除,添加水和活性炭,通过离心去除吸附在碳上的杂质，使水溶液通过膜。

脂质双层结构及其氧化产物

采用注射法制备脂质体[59]。为此目的，用0.25 ml所需浓度的乙醇磷脂注射器注入5 ml蒸馏水或适当的缓冲溶液，并持续剧烈快速搅拌。此外，脂质体在37℃下进行自发氧化和诱导氧化。

脂质过氧化产物被标记为：PR1为羰基化合物，PR2为与2-硫代巴比妥酸反应的物质，PR3为共轭二烯，PR4为巴豆醛。

用N-(2,4-二硝基苯)肼测定羰基化合物的浓度。用N-(2,4-二硝基苯)肼测定羰基化合物的浓度。10分钟后，在反应混合物中加入1 ml 0.75 M的NaOH。10分钟后，用紫外1800(日本岛津)分光光度计测量反应混合物在460 nm波长下的吸光度。

用[60]方法测定脂质体与2-硫代巴比妥酸反应悬浮液中物质的浓度。0.5毫升的脂质体悬浮液添加0.5毫升的0.92米的三氯乙酸和1毫升的49毫米2-thiobarbituric酸,在水浴加热15分钟,离心10分钟3000克,是浮在表面的光度学的452和532 nm分光光度计波长的紫外线1800(日本岛津公司、日本)。

用提出的方法测定脂质体悬浮液中共轭二烯的含量[61]。用2 ml庚烷- 2-丙醇(1:1)强力振荡提取0.2 ml脂质体悬浮液1 min，然后加入0.2 ml水。10分钟后，从上庚烷相收集0.2 mL，用0.2 mL乙醇稀释，在232 nm用紫外1800分光光度计(岛津，日本)进行光度测定。

采用220 nm庚烷萃取物光度法测定脂质体悬液中巴豆醛的含量。

纸片扩散法

采用琼脂盘扩散法[62,63]测定厌氧条件下双歧杆菌的抗菌活性。将试验菌株置于琼脂培养基(RPA)上，同时将草坪和草皮置于浸有微生物代谢物(10 ul/盘)的纸盘上。通过测定对试验培养物微生物的抑制带来评价其抗菌活性[64]。使用MRS培养基的椎间盘作为对照，使用抗生素环丙沙星(来自标准集)的椎间盘作为参比制剂。37℃孵育24小时。结果考虑了圆盘周围缺乏微生物生长的透明区域的存在和大小(毫米)。

乳酸菌的抗氧化性能

从肠道中分离出的微生物模型系统，在每个系列实验和脂质体氧化的每个持续时间内，所测试的化合物的抗氧化活性的有效性根据公式计算:

С在哪里₀是脂质体悬浮液中不含试验生物体（对照）的羰基化合物的浓度，С₁是含所研究微生物的脂质体悬液中羰基化合物的浓度(实验)。如果计算值>0，则认为所研究的微生物抑制脂质过氧化，如果<0，则研究中的细菌增强脂质，也就是说,它是一种促氧化剂。

实验室生物相容性

采用固体MRS共培养法进行生物相容性研究。过夜培养，在液体培养基中培养，并通过直径3mm的细菌循环在稠密的营养培养基表面进行浊度标准。液滴浸泡后，在离表面边缘1-2 mm处，其他试验培养物的液滴在相同的培养基上，以相同的体积扩散，约占第一滴的一半。在重叠部分，文化在相互存在(共培养)中发展，相互竞争。在第二个落盘干燥后，将作物倒置，在37-39°C的空气中培养，并增加二氧化碳含量。每个试验重复，改变作物的位置(以避免作物连续掉落层对共栽培区生长模式的影响)。

对照物是相同的培养液，像上面描述的那样层叠在一起。在开始孵育24和48小时后对结果进行解释。当某一作物发育不良时，两者之间的关系被认为是拮抗的，培养物本身就属于生物不亲和性的范畴。在完全“合并”点的情况下，培养物被认为是生物相容性的，或在共培养(互惠、协同、卫星)区域内菌株生长的增强。如果在共培养区域的一种作物“上升”，抑制了第二种培养的生长，不管它们的应用顺序，那么这样的选择被认为是弱拮抗。一种培养被另一种试验培养的外围点所表达的抑制区(生长迟缓)的存在被认为是一种强烈拮抗的标志。

结肠癌细胞的抗增殖作用

麻省理工化验：MTT比色法是基于活细胞将脱氢酶3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)还原为可溶于二甲基亚砜的紫甲酰胺晶体的能力。用Multiskan MS (Labsystem, Finland)平板光度计测量二甲基亚砜有色溶液在λ = 540 nm处的光吸收。根据以下公式评价所测细胞培养物的细胞毒性:

[%细胞毒性=（1-测试样品中的光吸收/对照中的光吸收）*100]。

台盼蓝色的排除化验：癌细胞（10⁶细胞/1 ml细胞悬液)加入96孔板。悬浮液37℃孵育24 h。使用台班蓝排除法检测细胞活力:

[细胞活力% =(活细胞数/总细胞数)*100]。

癌细胞的通透性：通过可渗透膜过滤器将肿瘤细胞分成两个室，研究癌细胞的渗透性[66]。癌细胞之前在这个过滤器上生长成单层，然后转移到一个腔室，其中两个腔室都含有DMEM培养基。孵育20分钟后，在有条件的“腹内”室中初步建立平衡，加入单层染料标记的台班蓝白蛋白(60 uM)。其在体外“前腹部”室的浓度通过480 nm (Specord 10, Carl Zeiss，德国)的吸光度监测。白蛋白在单层表面的流量以摩尔/(sec•cm²)表示，渗透率以系数(cm/sec)表示，该系数是基于两个室中的白蛋白浓度差异计算的。为了评估微生物代谢物对癌细胞渗透性的影响，将它们与1-100微克/毫升浓度的近期代谢物一起培养24小时，然后转移到室内。

统计分析:所有实验都有三个重复。数据处理采用数理统计的标准技术进行。当置信区间小于5%时，均值之间的差异被认为是显著的(P£ 0.05).

结果

乳酸菌分离株鉴定及分子分型

这些菌株的特征是革兰氏阳性、轻微弯曲或分枝、过氧化氢酶阴性、不动、不形成细菌孢子。它们不能从葡萄糖中产生气体，在37°C厌氧条件下的MRS肉汤（pH 4.3-3.9）中生长良好，可以将它们归类为放线菌类、双歧杆菌科[55].16s rDNA序列分析是目前人类胃肠道分离物鉴定研究的一个重要步骤。利用现有GenBank数据库对核苷酸序列进行BLAST分析，结果显示与SK菌株几乎100%相似双歧杆菌属种类（表1和图1）。

表1。分离物的鉴定双歧杆菌属人胃肠道16srdna序列分析。

应变	确定为：	概率[%]基于BLAST序列分析	确定爆炸分析为：
SK1	双歧杆菌属	100％	B．bifidum
SK2	双歧杆菌属	100％	b .谕令
SK8	双歧杆菌属	100％	B．longum
SK11	双歧杆菌属	99%	B．adolescentis

图1所示。基于双歧杆菌16s rDNA序列的人类胃肠道系统发育树

双歧杆菌抗氧化活性的体外研究

在脂质体氧化过程中，评估了微生物的抗氧化作用。在脂质过氧化反应过程中，研究了产物形成：PR1是羰基化合物，PR2是与2-硫代巴比妥酸反应的物质，PR3是共轭二烯，PR4是巴豆醛。结果如图所示2.所有研究菌株的微生物都会减少悬浮液中脂质体的数量，使其受到诱导氧化和产品脂质过氧化的影响，因此益生菌的抗氧化作用机制在于抑制构成细胞膜的脂质过氧化代谢物。这可能是由于自由基的结合自由基和脂氧合酶的抑制作用。

图2。抗氧化活性的有效性相对于菌株LAB (a) PR1， (B) PR2， (C) PR3， (D) PR4的氧化时间

体外双歧杆菌抗菌活性的研究

通过对试验培养物的抑制作用，研究了从人类肠道分离的微生物的抗菌活性。结果如图3所示。微生物产生的代谢物双歧杆菌属属，对试验菌株具有抗菌活性大肠杆菌В-6954,金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,沙门氏菌血清ATCC 14028，肺炎克雷伯菌В-7001。SK2菌株的抑菌活性范围最大，并具有抑菌作用酪丁酸梭菌液化沼气。

数字3.．从人体胃肠道分离的微生物合成的代谢物的抗菌特性:1为大肠杆菌b - 6954;2是金黄色葡萄球菌ATCC 25923；3是沙门氏菌血清写明ATCC 14028;4是英诺克李斯特菌LMG；5是酪丁酸梭菌LMG；6是肺炎克雷伯菌b - 7001

双歧杆菌代谢物的鉴定

乳酸菌在生命活动过程中形成醇、酸、酯、维生素、抗菌剂等。抗生素或细菌素具有抗菌性，后者的显著特点是其安全性。研究的一个重要组成部分是证明分离的双歧杆菌的代谢物与细菌素的关系。为此，对其物理、化学和生物学性质进行了研究。结果如表2所示。

表2。由分离物合成的代谢产物的理化性质双歧杆菌属

应变	代谢产物的性质
应变	分子质量	溶解度	不溶性
双歧杆菌属SK1	38.0	在乙酸乙酯中，是乙腈水溶液	在水、乙醇
双歧杆菌属SK2	35．5	氯仿、乙腈	在水里,正丁醇
双歧杆菌属SK8	38．8	在乙酸乙酯中，是乙腈水溶液	在水、乙醇
双歧杆菌属SK11	39	在乙酸乙酯中，是乙腈水溶液	在水、乙醇

细菌素的典型质量取决于物种和菌株的活性限制，尤其是一种亚种的活性限制。生产菌株对其自身细菌素的免疫力是以生产菌株作为印第安诺培养基测定的。所得结果如表3所示。从人类胃肠道分离的所有SK菌株对自身的抑制剂都具有耐药性，对一种合成物质也具有相互抗性，表明所产生物质的亲和力及其类似细菌素的性质。

表格3.．通过抑菌圈直径(mm)研究产生细菌素的微生物菌株的交叉敏感性

应变	SK1	SK2	SK8	SK11	L1	L2	L3	L4	L5	L6	L7	L8	S9	E10
应变	抑制带直径，mm
SK1	0	0	0	0	5.4	4.2	3.3	5.6	7．0	4.4	2.1	1．5	3	4.1
SK2	0	0	0	0	6．0	4.5	5.3	4.8	3.9	4	3.5	2.2	3.5	4.6
SK8	0	0	0	0	7．1	4.5	3.8	5.7	3	4.2	5.4	3.7	5	5.1
SK11	0	0	0	0	2.4	4	3.6	3.5	6．0	3.2	4.9	3.6	5.5	3.6
L1	4.7	3.6	2.9	3.8	0	0	0	0	0	0	0	0	1．7	2.8
L2	2.9	3.2	4.4	3.6	0	0	0	0	0	0	0	0	3	4.1
L3	1．5	1．7	3.5	4.2	0	0	0	0	0	0	0	0	2.6	2.9
L4	1,8	1．6	1．5	2.4	0	0	0	0	0	0	0	0	2.2	3.4
L5	5.3	7．0	3.6	4.7	0	0	0	0	0	0	0	0	1．9	2.5
L6	4.5	4.7	3.6	5	0	0	0	0	0	0	0	0	2.8	3.2
L7	3.3	2.7	1．6	4.3	0	0	0	0	0	0	0	0	1．8	2.2
L8	2.7	4.4	2.2	3.6	0	0	0	0	0	0	0	0	4.3	5.1
S9	4.5	3.9	5.1	6．0	3.2	2.7	3.1	4.7	2.5	3.6	4	3.5	0	4.7
E10	3	4.2	1．9	2.5	2.9	3.4	5.1	6．3	4.2	4	3.6	2.8	2.9	0

*L1-植物L.plantarum，L2 -嗜酸乳杆菌，L3 -喂食,L4 -l . paracaseiL5 -发酵乳杆菌，16种-l．唾液链球菌，L7-干酪乳杆菌，18 -l．这种，S9-无乳杆菌，E10 -大肠都有效

将获得的数据(表2和3)与参考文献数据[67-71]进行比较可知，从人类肠道分离的微生物中鉴定出的代谢物为细菌素。

体外双歧杆菌抗肿瘤活性的研究

研究从人胃肠道分离的双歧杆菌细菌素对癌细胞培养的可能抑制作用双歧杆菌谕令，抗菌活性最高。

微生物代谢产物的影响双歧杆菌谕令在Burkitt淋巴瘤LBR2、人乳腺癌MDAMB-231和人胰腺癌PANC-1的细胞系上研究了细胞膜通透性的影响。癌细胞存活率和肿瘤细胞通透性的测定结果双歧杆菌谕令微生物代谢产物分别如图4和图5所示。双歧杆菌谕令代谢物会降低Burkitt淋巴瘤LBR2、人乳腺癌MDAMB-231和人胰腺癌PANC-1癌细胞的存活率。在存在双歧杆菌谕令代谢产物的生长抑制率不超过40.0%，而48小时后这种抑制率为67.6-71.1%。此外，通过双歧杆菌谕令代谢产物导致膜对白蛋白的通透性增加。与未经处理的细胞相比，细胞膜的通透性增加10.0-30.0%。

图4．癌细胞在影响下存活双歧杆菌谕令代谢产物:1 - LBR2 Burkitt淋巴瘤细胞;2 -人乳腺癌细胞MDAMB-231;3 -人胰腺癌PANC-1细胞。细胞存活率为100%，生长无双歧杆菌谕令代谢物

数字5．治疗后癌细胞白蛋白单层通透性变化的动力学双歧杆菌谕令代谢物：1-未经处理的细胞；伯基特淋巴瘤细胞LBR2的代谢产物处理双歧杆菌谕令；2-用代谢产物处理的人乳腺癌MDAMB-231细胞双歧杆菌谕令；3 .人胰腺癌PANC-1细胞的代谢产物双歧杆菌谕令

讨论

本研究从人体胃肠道中分离出具有抗菌和抗氧化活性的双歧杆菌。以人类胃肠道为代表的多种微生物群，结合其营养与环境的鲜明特点，使研究与人类微观世界相关，其中以乳酸菌为代表。乳酸菌的种类和品质的特点，扩大了乳酸菌对人类有益和健康的使用能力。这套方法(测序结合系统发育分析)允许在特定附件范围内以足够的置信度将SK1、SK2、SK8和SK11分离株(表1和图1)鉴定为双歧杆菌(误差概率不超过0.05，对应统计误差)。现有的生物化学研究方法(API分析使用APILAB软件)信息[20,72,73]并不总是具有足够的准确性，涉及适当的测试生物体，并需要使用系统发育分析的最后阶段，我们选择这一阶段的主要研究。分析16s rDNA序列可唯一鉴定出SK1、SK2、SK8、SK11菌株为代表种双歧杆菌，短双歧杆菌，长双歧杆菌，青少年双歧杆菌(为了明确16s rDNA一致序列相似性的准确性类型，需要[74])。爆炸分析显示与双歧杆菌bifidum应变（L22），双歧杆菌谕令菌株（BB4GZU），双歧杆菌longum应变(写明ATCC 15707),双歧杆菌adolescentis菌株（Ru424）。

益生菌对免疫系统有积极影响，因为胃肠道菌群可减少诱变剂和致癌物的影响。体外实验表明，所研究的微生物菌株可减少脂质过氧化量，因此，益生菌的抗氧化作用机制是抑制g构成细胞膜的脂质过氧化代谢物。本研究中证明的新专用SK1、SK2、SK8、SK11实验室菌株的抗氧化能力证实了已经发表的双歧杆菌数据[75-77]，并促进其作为化疗或放疗后患者康复基础产品的使用机会。与其他乳酸菌一样，双歧杆菌用于治疗和预防各种疾病，包括胃肠道疾病和美容[78-83]。

四个独立双歧杆菌属菌株SK1、SK2、SK8、SK11表现出广谱的抗菌活性。在我们的体外研究中，我们使用MRS作为培养基，而传统病原体作为试验培养物，既能引起食物的活跃变质，又能导致严重的人类疾病[88,85]。

采用琼脂盘扩散法对试验双歧杆菌进行了实验，证实了该菌对某些腐烂微生物的生长有抑制作用。菌株的双歧杆菌属SK1、SK2、SK8、SK11均被抑制大肠杆菌B-6954，金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,沙门氏菌血清ATCC 14028，肺炎克雷伯菌B-7001，仍能耐受英诺克李斯特菌液化沼气。一种分离的菌株双歧杆菌谕令SK2还抑制了细胞的生长酪丁酸梭菌液化沼气(86、87)。

乳酸菌的细菌素是一种具有抗菌特性的蛋白质或多肽，在食品工业中以生物防腐剂和医药的形式作为抗生素的潜在替代品[46,47,63-71,86,87]。乳酸菌是细菌素的新产物，其性质和特性一直受到人们的关注。细菌素的抗菌、抗氧化、抗真菌活性是众所周知的[12-15,17-23,47,48,64,69,75-77,88,89]。但也许还有一些品质是人类没有研究过的。我们试图确定其抑制作用不仅是针对自身相似的细菌，而且也针对癌细胞培养。因此，确认从人体胃肠道分离的双歧杆菌的代谢物是代谢物，并在确定事实后获得对癌细胞抑制作用的证实是很重要的。

实际上，科学文献中并没有乳酸菌及其代谢物对癌细胞培养物的抑制作用的数据[28,29,34,36,38,39,90-92]。细菌素对癌细胞生长的部分抑制作用短双歧杆菌在用代谢物处理12小时后，菌株已经被观察到，在处理36小时后，不超过一半的细胞培养保留。另外，根据癌细胞的种类，治疗10 ~ 25%后，60小时后，从12.5 ~ 31.25%的细胞膜通透性逐渐增加。结果不仅是积极的，而且为这种疾病的新治疗技术打开了可能性。

实验发现，一株分离的代谢物SK2处理Burkitt淋巴瘤LBR2、人乳腺癌MDAMB-231和人胰腺癌PANC-1的癌细胞存活率降低，细胞膜通透性增加，抑制P. claviforme的生长(图4和5)。

结论

在这项研究中，四个是2021年版权OAT。copyright reserved from human胃肠道，have been identified as双歧杆菌属具有良好的抗氧化、抗菌和抗肿瘤活性(双歧杆菌谕令)．新分离物的抗氧化活性鉴定为双歧杆菌属，包括它们在各种食品技术中的潜在用途，包括用于缓解期患者康复的产品。对于乳酸菌代谢产物在癌症治疗和预防中的可能应用，目前所取得的研究结果尚属初步和不足。目前还没有完整的机制对癌细胞培养的影响，需要进一步的研究，无论是在大量微生物的扩展方面，还是在研究它们的特性方面。

致谢

俄罗斯联邦教育和科学部在第14.586.21.0002号国家合同的框架内，以及卡罗琳斯卡研究所（瑞典斯德哥尔摩）微生物、肿瘤和细胞生物学系的研究伙伴，为本研究提供了财政支持。

工具书类

Murray CJ, Lopez AD(1996)《全球疾病负担:1990年和预计到2020年疾病、伤害和危险因素造成的死亡率和残疾的综合评估》。波士顿:哈佛大学公共卫生学院，代表世界卫生组织和世界银行，1996年。
Hjartåker A, Weiderpass E, Bray FI(2008)癌症死亡率。见:Heggenhougen K, Quah S(编)，国际公共卫生百科全书，学术出版社452-464。
Anttila A，Lönnberg S，Ponti A，Suonio E，Villain P等（2015年），通过改进监测和评估以及癌症登记处的更多参与，在欧洲更好地实施癌症筛查。欧元J癌症51: 241 - 251。［Crossref］
Von Karsa L，院长PB，Arrossi S，Sankaranarayanan R（2014）筛选-原则。在：斯图尔特BW，野生CP，编辑。2014年世界癌症报告。国际癌症研究机构：里昂322-329。
Eslick GD(2010)食管癌的感染原因。传染病诊所北Am24: 845 - 852。［Crossref］
Porta C，Riboldi E，Sica A（2011）病原体相关炎症和癌症的联系机制。癌症列托人305: 250 - 262。［Crossref］
De Martel C, Plummer M, Franceschi S(2014)癌症感染:世界负担和预防潜力。公共卫生论坛22日:12 e1-12e4。
Velázquez E，Peix A，Gómez-Alonso A（2011年），《微生物与癌症：科学证据和新假设》。圆形的Esp89: 136-144. [Crossref］
高淑娟，王志强，王志强(2011)病毒与人类癌症的关系:从检测到因果关系。癌症列托人305: 218 - 227。[交叉参考]
Read SA, Douglas MW(2014)病毒诱导炎症和癌症发展。癌症列托人345: 174 - 181。[交叉参考]
Irigaray P, Newby JA, Clapp R, Hardell L, Howard V, et al.(2007)生活方式相关因素和环境因素导致癌症:综述。生物医学Pharmacother61: 640 - 658。[交叉参考]
Bianchini A(2015)乳酸菌作为抗真菌药物。见:发酵食品与饮料研究进展，爱思韦尔科学，伍德黑德出版社333-353。
O'Bryan CA，Crandall PG，Ricke SC，Ndahetuye JB（2015）乳酸菌（实验室）作为食品中的抗菌剂：分析方法和应用。摘自：《食品安全和质量天然抗菌剂手册》，爱思唯尔科学出版社，Woodhead出版社137-151。
Iranmanesh M，Ezzatpanah H，Mojgani N（2014）从传统伊朗乳制品中分离的乳酸菌的抗菌活性和胆固醇同化作用。LWT-Food Sci抛光工艺58: 355 - 359。
Inglin RC, Stevens MJ, Meile L, Lacroix C, Meile L(2015)乳酸杆菌菌种抗菌和抗真菌活性的高通量筛选试验。J Microbiol方法114:每股26到29。［Crossref］
Aguirre L，Hebert EM，Garro MS，de Giori GS（2014）乳酸杆菌菌株对大豆蛋白质的蛋白水解活性。LWT-食品科技59: 780 - 785。
Cizeikiene D, Juodeikiene G, Paskevicius A, Bartkiene E(2013)乳酸菌对食品中病原微生物和腐败微生物的抑菌活性及其在小麦面包中的控制。食品控制31日:539 - 545。
García-Ruiz a，Requena T，Peláez C，BartoloméB，Moreno Arribas MV等（2013年）乳酸菌素3147对酿酒乳酸菌的抗菌活性。与其他抗菌药物的联合作用。食品控制32: 477-483.
Shori AB(2013)牛乳和骆驼乳制成的大豆酸奶中乳酸菌的抗氧化活性和活力。Taibah科学大学7: 202-208.
trocheva R, Nikolova D2, Evstatieva Y2, Danova S3(2014)从传统乳制品“katak”中分离的乳酸菌的抑菌活性及鉴定。厌氧菌28: 78-84.[交叉参考]
(1)意大利腊肠中乳酸菌的抗真菌活性。微透镜271: 245-250.[交叉参考]
Magnusson J, Ström K, Roos S, Sjögren J, Schnürer J(2003)环境分离的乳酸菌具有广泛而复杂的抑菌活性。微透镜219: 129-135.[交叉参考]
Schnürer J, Magnusson J(2005)作为生物保留剂的抗真菌乳酸菌。食品科技趋势16: 70-8.
Burns AJ，Rowland IR（2000）益生菌和益生元的抗致癌性。当前发布的Interest Microbiol1: 13-24.[交叉参考]
Russell DA，Ross RP，Fitzgerald GF，Stanton C（2011）双歧杆菌的代谢活性和益生菌潜力。国际食品微生物学杂志149: 88-105.[交叉参考]
Nami Y，Abdullah N，Haghshenas B，Radiah D，Rosli R等（2014年）新分离阴道分泌物的益生菌潜力和生物治疗效果嗜酸乳杆菌36YL菌株对癌细胞的作用。厌氧菌28: 29-36。［Crossref］
Arici M，Bilgin B，Sagdic O，Ozdemir C（2004）从婴儿粪便中分离出的乳酸杆菌的一些特征。食物Microbiol21日:19到24。
Gonet Surowka AK，Strus M，Heczko PB（2007）乳酸杆菌益生菌菌株对结肠癌细胞系凋亡的影响。Int J抗微生物剂29日:343 - 344。
Thirabunyanon M, Boonprasom P, Niamsup P(2009)从发酵乳中分离的乳酸菌对结肠癌细胞增殖的益生潜力。Biotechnol列托人31: 571-576.[交叉参考]
朱燕，杨玉华(2011)肠道微生物群和益生菌在结肠肿瘤发生中的作用。癌症列托人309: 119 - 127。[交叉参考]
王志强(1991)人体医学中的益生菌。肠胃32: 439 - 442。[交叉参考]
Goldin BR, Gorbach SL(2008)益生菌的临床指征综述。临床感染性疾病46: s96 - 100。[交叉参考]
Darsanaki RK, Issazadeh K, Pahlaviani MRMK, Aliabadi MA(2012)抗诱变活性乳酸菌从新鲜蔬菜中分离抗叠氮化钠和2-硝基芴。J Pure applmicrobiol6: 1677 - 1682。
come D, Hughes R, Shortt C, Rowland I(2005)益生菌抗致癌作用的潜在机制。Mutat Res591: 276 - 289。[交叉参考]
Maragkoudakis PA, Zoumpopoulor G, Miaris C, Kalantzopoulos G, Pot B, et al.(2006)乳制品中分离的乳酸菌菌株的益生菌潜力。Int乳制品J16: 189 - 199。
de Moreno de LeBlanc A, Matar C, Perdigón G(2007)益生菌在癌症中的应用。营养素98附录1:S105-S110。[Crossref］
Pennacchia C、Ercolini D、Blaiotta G、Pepe O、Mauriello G等（2004年）从发酵香肠中选择乳酸杆菌菌株作为益生菌。肉Sci67: 309 - 317。［Crossref］
Rafter J(2003)益生菌与结肠癌。胃肠道最佳临床实践17: 849-859. [Crossref］
Saikali J，Picard C，Freitas M，Holt P（2004）发酵乳，益生菌培养和结肠癌。营养癌49: 14 - 24。［Crossref］
Gaggia F, Di Gioia D, Baffoni L, Biavati B(2011)保护菌和益生菌在食品和饲料中的作用及其对食品安全的影响。食品科技趋势22: s58 - 66。
(2014)谷物真菌感染、真菌毒素和乳酸菌介导的生物保护:从作物种植到谷物产品。食物Microbiol37: 78-95. [Crossref］
Plockova M，Stiles J，Chumchalova J，Halfarova R（2001）通过控制霉菌生长乳杆菌VT1和这种乳酸菌牛奶琼脂平板上的CCM 3625。捷克J食品科学19: 46-50.
(1)利用乳酸菌生产苯乳酸:一种有助于食品质量和保藏的菌株选择方法。微透镜233: 289 - 295。［Crossref］
DaliéDKD，Deschamps AM，Richard Forf（2010）乳酸菌-控制霉菌生长和真菌毒素的潜力：综述。食品控制(4): 370 - 80。
Delavene E、Ismail R、Pawtowski A、Mounier J、Barbier G等（2012）乳酸杆菌菌株作为酸奶生物保护培养物的评估。食品控制30: 206 - 13所示。
Lacroix C（2011）《食品和饮料生物保护用保护性培养物、抗菌代谢物和噬菌体》，爱思唯尔科学出版社，Woodhead出版社。
Ravi V，Prabhu M，Subramanyam D（2011）从芒果果肉中分离产生细菌素的细菌及其抗菌活性。微生物生物技术研究1: 54 - 63
De Muynck C1，Leroy AI，De Maeseneire S，Arnaut F，Soetatert W等（2004）选定乳酸菌产生食品相容性抗真菌代谢物的潜力。Microbiol Res159: 339 - 346。［Crossref］
Colwell RR，Grigorova R（1987）《微生物学方法》。第19卷：微生物分类和鉴定的当前方法。伦敦：学术出版社，爱思唯尔科学出版社。
Murray PR，Baron EJ，Pfaller MA，Tenover FC，Yolken RH（1995）《临床微生物学手册》，第6版，华盛顿，ASM出版社，DC。
Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA(2013)医学微生物学。桑德斯/爱思唯尔。
Jorgensen JH(1993)抗菌药物敏感性测试系统的选择标准。中国Microbiol31日:2841 - 2844。［Crossref］
Jorgensen JH, Tunridge JD, Washington JA(1999)抗菌药物敏感性试验:稀释法和纸片扩散法。在:临床微生物手册。第7版。华盛顿特区:美国微生物学会。
Kandler O, Weiss N(1986)常规，非孢子革兰氏阳性棒。在:Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG，编辑。伯吉的系统细菌学手册。巴尔的摩:威廉斯和威尔金斯出版社1208-34页。
Bergey 's Manual of Systematic细菌学(1985)Book Review Int J of Syst Bact。
Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ(1991)用于系统发育研究的16S核糖体DNA扩增。J Bacteriol173: 697 - 703。［Crossref］
Saitou N，Nei M（1987）邻接法：重建系统发育树的新方法。另一个星球杂志4: 406 - 425。［Crossref］
СуровцевВИ,БорзенковВМ,ХатюшинЮИ,ВеревкинВВ,КрасильниковаВМ(2013)俄罗斯专利№2492231。
陈志强，陈志强(2003)单双分子层脂质体的制备。Biochim Biophys学报298: 1015 - 1019。［Crossref］
酯类脂质过氧化产物丙二醛和4-羟基壬烯醛的测定。方法Enzymol186: 407 - 421。［Crossref］
УшкаловаВН,ИоанидисНВ,КадочниковаТД,ДееваЗМ(1993)Контрольперекисногоокислениялипидов。Новосибирск:изд——воНГУ。
Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M(1966)用标准化单片法进行抗生素敏感性测试。J临床病理45: 493 - 496。［Crossref］
木村H，生原T，松崎H，声本K，石崎A（1998）的新细菌素片球菌属ISK-1从陈年发酵米糠床中分离得到。Ann N Y academy Sci864: 345-348. [Crossref］
Shillinger U, Lücke FK。肉制品清乳杆菌的抗菌活性研究。J: Microbiol1989;70: 473 - 478。
Eloff JN(1998)一种灵敏、快速的测定植物提取物对细菌最低抑菌浓度的微板法。足底地中海64: 711 - 713。［Crossref］
Noll T, Wozniak G, McCarson K, Hajimohammad A, Metzner HJ等(1999)因子XIII对内皮屏障功能的影响。J Exp地中海189: 1373 - 1382。［Crossref］
研究表明益生菌对肠道上皮细胞屏障功能的影响。Am J理疗师胃病学家肝脏理疗师298: g807 - 819。［Crossref］
Martinez FA，Balciunas EM，Converti A，Cotter PD，de Souza Oliveira RP（2013）双歧杆菌产生细菌素的综述。生物技术公司31日:482 - 488。［Crossref］
关键词:双歧杆菌，细菌素类物质，抗菌活性米克罗比奥Z74: 32-42。［Crossref］
Renye JA Jr，Somkuti GA（2013年）BlpC在中国监管细菌素的生产乳酸链球菌。Biotechnol列托人35: 407 - 412。［Crossref］
Rossi F, Marzotto M, Cremonese S, Rizzotti L, Torriani S(2013)多样性乳酸链球菌在细菌素生产中；嗜热基因的抑制谱和出现。食物Microbiol35:即。［Crossref］
(in chinese)[王静，陈旭，刘伟，杨敏，张华(2008)利用传统方法和分子方法鉴定葡萄乳杆菌。]Eur Food Res Technol227(5): 1555 - 1561。
Delétoile A, Passet V, Aires J, Chambaud I, Butel MJ, et al.(2010)通过多位点测序揭示了四种双歧杆菌的物种划分和克隆多样性。Res Microbiol161: 82 - 90。［Crossref］
Bevilacqua L, Ovidi M, Di Mattia E, Trovatelli LD, cananella F(2003)从人类粪便中分离的双歧杆菌菌株的筛选及其对潜在致病菌的拮抗作用。Microbiol Res158: 179-185. [Crossref］
(in chinese with chinese abstract)[沈强，张斌，徐锐，王颖，丁旭，李鹏(2010)富硒植物含硒蛋白体外抗氧化活性研究动物双歧杆菌厌氧菌16: 380 - 386。
徐R1，尚楠，李鹏(2011)体外和在活的有机体内提取物胞外多糖组分的抗氧化活性动物双歧杆菌厌氧菌17: 226 - 231。［Crossref］
Chang OK，Seol KH，Jeong SG，Oh MH，Park BY等（2013）酪蛋白水解双歧杆菌longumKACC91563及其衍生肽的抗氧化活性。J乳品科学96: 5544 - 5555。［Crossref］
Watson RR, Preedy VR，编辑(2010)促进健康的生物活性食品:益生菌和益生元。伦敦:学术出版社。
Barrons R，Tassone D（2008）使用乳酸杆菌益生菌女性细菌性泌尿生殖道感染：综述。中国其他30: 453 - 468。［Crossref］
Abdin AA, Saeid EM(2008)利用益生菌治疗溃疡性结肠炎的实验研究嗜酸乳杆菌有或没有“奥沙拉嗪”。克罗恩结肠炎2: 296-303. [Crossref］
Patel AR，Shah NP，Prajapati JB（2014）益生菌在治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染中的免疫调节作用。生物医用营养素4: 81-84.
Hamilton-Miller JM(2003)益生菌在治疗和预防疾病中的作用幽门螺杆菌感染。Int J抗微生物剂22: 360-366. [Crossref］
Falagas M，Betsi GI，Athanasiou S（2007）用于治疗细菌性阴道病妇女的益生菌。临床微生物感染13: 657 - 664。［Crossref］
Filtenborg O, Frisvad JC, Thrane U(1996)食品腐败中的霉菌。国际食品微生物学杂志33: 85-102. [Crossref］
Delavene E、Ismail R、Pawtowski A、Mounier J、Barbier G等（2012）乳酸杆菌菌株作为酸奶生物保护培养物的评估。食品控制30: 206 - 13所示。
刘庚，任磊，宋智，王聪，孙乙（2015）双歧霉素A的纯化及性质动物双歧杆菌BB04来自百岁老人的肠道。食品控制: 889 - 895。
Gänzle MG, Hertel C, van der Vossen JM, Hammes WP(1999)产细菌素乳酸菌对小鼠存活率的影响大肠杆菌和李斯特菌在胃和小肠的动态模型中。国际食品微生物学杂志48: 21-35。(Crossref］
Lahtinen SJ, Jalonen L, Ouwehand AC, Salminen SJ(2007)从老年人中分离的特异性双歧杆菌菌株抑制金黄色葡萄球菌的生长。国际食品微生物学杂志117: 125 - 128。［Crossref］
Cheikhyoussef A，Pogori N，Chen W，Zhang H（2008）从双歧杆菌获得的抗菌蛋白化合物：从生产到应用。国际食品微生物学杂志125: 215 - 222。［Crossref］
Kittakoop P（2015）《天然产物激发的抗癌药物和潜在抗癌药物线索》。载：天然产物化学研究44:251–307。
Collado MC, González A, González R, Hernández M, Ferrús MA，等(2005)抗菌肽是双歧杆菌产生的拮抗代谢产物之一幽门螺杆菌．Int J抗微生物剂25日:385 - 391。［Crossref］
(1)石川，石野，柴原森等双歧杆菌bifidum发酵的牛奶幽门螺杆菌和人类血清胃蛋白酶原水平。J乳品科学90: 2630 - 2640。［Crossref］