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摘要

肉瘤是一种罕见的间叶细胞恶性肿瘤，具有多种临床和病理特征。虽然对肉瘤的辅助化疗带来了显著的临床效益，但需要新的抗癌药物来改善肉瘤患者的临床结果。在肉瘤中，许多酪氨酸激酶的异常调节驱动有缺陷的信号通路。我们使用20个不同组织学来源的肉瘤细胞系，研究了三种药物对肉瘤信号转导通路的抑制作用。研究了BIBF 1120对三受体激酶通路、BI 860585对mTOR信号通路、BI 836845对胰岛素样生长因子(IGF)诱导信号转导通路的影响。本研究采用骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和尤文氏肉瘤细胞系。我们的发现表明,1120年BIBF可能优先抑制滑膜肉瘤细胞系的可行性,BI 860585可能抑制影响肿瘤细胞的生存能力,与不同的组织学特性,BI 836845在尤因肉瘤可能有特定的抑制效果,和igf - 1受体可能是预测生物标志物的肉瘤。然而，进一步研究这三种抑制剂治疗反应的分子机制对于开发新的肉瘤治疗策略是必要的。

关键词

BIBF 1120, BI 860585, BI 836845，肉瘤，酪氨酸激酶抑制剂

介绍

肉瘤是具有不同组织学背景的间叶性恶性肿瘤。肉瘤的临床特征从可治愈到转移性肿瘤不等，可导致短期生存。尽管外科手术是局部疾病的首选治疗方法，但50%的高级别肉瘤往往会复发[1]20世纪70年代初开始的辅助化疗的使用，使肉瘤患者的预后有了显著改善。例如，局限性骨肉瘤[2-6]和尤因肉瘤[7-9]患者的生存率通过在手术切除肿瘤的过程中加入多药化疗，这两种药物对化疗都很敏感，从大约20%提高到70%。然而，强化化疗并未显著改善骨肉瘤[10,11]或尤因肉瘤[12,13]的临床疗效此外，在对化疗反应不佳的肉瘤中，辅助治疗的作用仍然是一个讨论的主题，因为其潜在的益处不超过其副作用。这些概念推动了一种新的治疗策略的发展，如靶向治疗[14]。

靶向药物的出现极大地促进了肉瘤治疗的最新趋势[15]。美国食品和药物管理局（FDA）已批准以下靶向药物用于软组织肉瘤的治疗：甲磺酸伊马替尼[16]、盐酸帕唑帕尼[17]、甲磺酸伊利布林[18]和特拉伯丁[19].肉瘤的治疗也引入了免疫治疗方法[20]。考虑到大量FDA批准的用于治疗其他恶性肿瘤的靶向药物，更多的靶向药物将适用于肉瘤治疗。

在本研究中，我们检测了BIBF 1120 (nintedanib)、BI 860585和BI 836845三种药物对信号转导通路的抑制作用。

BIBF 1120是一种三激酶抑制剂，可阻断血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子和成纤维细胞生长因子的受体途径[21,22].BIBF 1120抑制蛋白激酶家族成员，如Src、Lck和Lyn。除了细胞中受体介导的信号通路外，BIBF 1120还针对肺癌中癌细胞和肿瘤微环境之间的相互作用[23].一项I期研究表明，BIBF 1120对多种癌症具有抗肿瘤活性，如结直肠癌、肾癌和肝细胞癌[24]。BIBF 1120作为抗非小细胞肺癌的抗癌剂的有效性已在临床前和临床I期和II期试验中得到证实[25]最近启动了BIBF 1120治疗转移性软组织肉瘤（NCT02808247）的II期临床试验。

BI 860585是雷帕霉素复合物1（mTORC1）和mTORC2的哺乳动物靶点抑制剂。雷帕霉素（mTOR）的哺乳动物靶点是丝氨酸/苏氨酸激酶和PI3K/AKT途径的下游效应物[26].mTORC1和mTORC2是由mTOR形成的复合物。mTORC1对雷帕霉素敏感，参与mRNA翻译，而mTORC2对雷帕霉素耐药，并调节肌动蛋白细胞骨架。在许多癌症中已报道mTORC1和mTORC2的异常调节。雷帕霉素及其类似物抑制几种恶性肿瘤中的细胞生长包括骨肉瘤、横纹肌肉瘤和尤因肉瘤[27]。还报告了mTOR抑制剂在肉瘤中的可能作用[28]。正在对各种晚期和/或转移性实体瘤患者进行BI 860585的开放标签I期剂量发现研究（NCT01938846）.最近报告了研究中BI 860585的最大耐受剂量[29]。

BI 836845是一种治疗性抗体，对人胰岛素样生长因子（IGF）-1和IGF-2具有高度特异性亲和力。BI 836845抑制IGF诱导的信号转导激活[30]。IGF控制细胞增殖以及生物体的生存和生长[31,32].在许多临床前癌症模型中，IGF-1和IGF-2可刺激肿瘤生长[33]。血液中IGF-1的浓度对癌症具有预后价值[34,35]。此外，在荟萃分析中报告了肉瘤中IGF-1R表达的预后价值[36]。IGF信号通路被视为肉瘤治疗的一个靶点。例如，抗IGF-1R已被证明在尤因肉瘤的治疗中有效[37]。2015年12月完成了一项关于BI 836845在各种实体癌中使用的I期开放标签剂量递增试验（NCT01403974）。

目的研究BIBF 1120、BI 860585和BI 836845对20株肉瘤细胞的抗肿瘤作用。我们的结果将有助于考虑三种抑制剂作为分子靶向药物治疗肉瘤。

材料和方法

BIBF 1120、BI 860585和BI 836845由勃林格·英格尔海姆（德国英格尔海姆）提供。

肉瘤细胞系

研究中使用了20个具有不同组织学背景的肉瘤细胞系。表1显示了细胞系的亚型和来源，以及研究中使用的培养基。还显示了每个孔培养的细胞数。通过检查短串联重复模式验证了细胞系。支原体通过监测培养条件培养基中支原体特有的DNA排除污染。

生长抑制试验与分析

细胞悬浮在表1的培养基中，并以足够数量的单个细胞系被放置在96孔板中，培养过夜。然后用抑制剂或载体孵育细胞72小时，之后使用细胞计数试剂盒8 (Dojindo Molecular Technologies Inc, Kumamoto, Japan)评估细胞活力。在450nm处测定吸光度。使用GraphPad Prisom7软件(GraphPad software, La Jolla, CA, USA)构建4参数logistic曲线，评估酪氨酸激酶对细胞活力的抑制作用。然后计算各药物的半最大有效浓度(EC50)，以评价各药物的抑制效果。

转录组数据分析

尤文肉瘤细胞系的基因表达数据来自公共基因表达综合数据库（GEO）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)（表3）。A673、RD-ES和W-ES细胞系的数据之前已有报告[38,39].使用R软件和Bioconductor项目的其他软件包进行基因表达数据分析，如下[40,41]。使用Bioconductor affy软件包[42]中的MAS5.0标准化DNA微阵列数据，然后使用全局中值居中法。

表2。总结了BIBF 1120、BI 860585和BI 836845对肉瘤细胞株的半最大有效浓度(EC50)值

肉瘤亚型	细胞系名称	欧共体50(μM)
		BIBF 1120	BI 860585	BI 836845
骨肉瘤	14	2.7	0.11	>10
	MG63	3．7	0.04	>10
	SJSA-1	3．3	０．４０	>10
	U2OS	2.8	0.36	>10
	HS-OS-1	2.6	0.03	>10
	霍9 n2	5.7	0.49	>10
	霍3N1	3．4	0.08	>10
	10号	2.3	0.05	>10
	居屋	3．1	0.39	>10
	MNNG-HOS	2.7	0.07	>10
滑膜肉瘤	SYO-1	0．41	0.15	>10
	1273/99	5.4	０．３３	>10
	YaFuSS	0.7	0.13	8.83
	HS-SY-2	０．３３	0.04	6.67
横纹肌肉瘤	KYM-1	3．4	0.07	>10
	SJCRH30	3．8	０．５２	>10
	研发部	3．1	0．24	>10
尤因肉瘤	A673	3．5	0.18	>10
	RD-ES	6.7	0.08	0.02
	W-ES	5.9	0.06	0.19

表3。尤文肉瘤细胞系的mRNA表达数据

A673	ArrayExpress	E-MTAB-37	Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列	A-673_SS271873_HG-U133_Plus_2_HCHP-167936_.CEL
RD-ES	地理位置	GSE8596	Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列	GSM213308
W-ES	地理位置	GSE8596	Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列	GSM213312

结果和讨论

图1-4说明了BIBF 1120、BI 860585和BI 836845对20个肉瘤细胞系的活性的影响。肉瘤由多种组织学上不同的间充质瘤组成。每种肉瘤亚型都有独特的分子背景；因此，根据临床和病理特征制定治疗策略每个肉瘤的病理特征[43]骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和尤因肉瘤是主要的肉瘤亚型。我们研究了肉瘤的组织学亚型和细胞系，它们对抑制剂的治疗表现出良好的反应。图1-4显示了三种药物对每种细胞系生长的logistic曲线e从曲线中获得的数据用于计算EC50值（表2），图5中的热图显示了EC50值。

图形1.BIBF 1120、BI 860585和BI 836845对骨肉瘤细胞的抑制作用的剂量响应曲线。

图形2.剂量反应曲线显示BIBF 1120、BI 860585和BI 836845对滑膜肉瘤细胞系的抑制作用。

图形3.BIBF 1120、BI 860585和BI 836845对横纹肌肉瘤细胞的抑制作用的剂量响应曲线。

图形4.剂量反应曲线显示BIBF 1120、BI 860585和BI 836845对尤文肉瘤细胞系的抑制作用。

图形5.BIBF 1120、BI 860585和BI 836845对20种肉瘤细胞亚型的半数最大有效浓度（EC50）值。不同颜色对应表示各自EC50值的数值数据。表2中总结了数据。

BIBF 1120对SYO-1、YaFuSS和HS-SY-2细胞系的EC50值低于其他肉瘤细胞系（图5，表2）因此，与其他研究的肉瘤细胞系相比，SYO-1、YafuSS和HS-SY-2细胞的共同分子背景值得研究。三种细胞系之间的共同分子背景可能包括用于辅助诊断的生物标记物。我们的结果表明，BIBF 1120的可能指征是滑膜肉瘤。然而，本研究中未使用的肉瘤细胞系也值得研究。

在20种肉瘤细胞系中，BI 860585的EC50值相似(图5，表2)。在骨肉瘤[44]、滑膜肉瘤[45]、横纹肌肉瘤[46]和尤文氏肉瘤[47]的研究中，已经报道了mTOR通路的激活及其在新疗法中的可能应用。我们的数据可能支持mTOR抑制剂对这些肉瘤的适应症;但BI 860585对其他肉瘤细胞系的抑制作用值得研究。

BI 836845对两种尤文肉瘤细胞系（RD-ES和W-ES）显示最低的EC50值；然而，对A673细胞系的EC50值超过了本研究的计算极限（图5，表2）。IGF-1R通路被认为是治疗尤文肉瘤的一个靶点[48,49]我们观察到BI 836845对Ewing肉瘤细胞活力的抑制作用与之前的报道一致。为了探索RD-ES、W-ES和A673细胞系对BI 836845治疗的不同反应的可能机制，我们比较了IGF-1、IGF-2、IGF-2和A673的表达水平使用公开的DNA微阵列数据，我们发现在A673细胞中IGF-1R的表达水平最低（图6）等据报道，抗IGF-1R抗体的抗增殖活性与横纹肌肉瘤细胞中的IGF-1R水平呈正相关[50]。因此，IGF-1R的表达水平可能是BI 836845治疗肉瘤预后的候选预测性生物标志物。然而，这一假设应该使用具有不同IGF-1R表达水平的各种细胞系进行检验。此外，细胞系对BI 836845处理的反应应该不同。

图形6.尤因肉瘤细胞系中胰岛素样生长因子（IGFs）的表达水平。

结论

我们检测了BIBF 1120、BI 860585和BI 836845对20种肉瘤细胞系的抗增殖作用。我们的结果表明，BIBF 1120可能优先抑制滑膜肉瘤细胞系的生长，BI 860585可能对具有不同组织学特征的肉瘤细胞的存活率有抑制作用，BI 836845可能具有以下作用：尤因肉瘤的特异性抗增殖作用和IGF-1R可能是肉瘤的预测性生物标记物。然而，研究细胞系对三种治疗反应的分子背景对于开发新的肉瘤治疗策略是值得的。

确认

这项工作得到了勃林格殷格翰公司提供的研究经费的支持。

利益冲突

这项研究是与勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)合作进行的。

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