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摘要

两个不朽的人幼年软骨细胞，T/C28a2和C28/I2，被用来确定重组人(rh) IL-6或rh- tnf -α增加基质金属蛋白酶9 (MMP-9)产量的程度。同时评估了rhIL-6对中性粒细胞明胶酶相关脂calin (NGAL)的影响。虽然与rhTNF- 6 (50 ng/ml)孵育的C28/I2软骨细胞可以增加MMP-9的产生，这是T/C28a2软骨细胞无法模仿的，但rhTNF-α对MMP-9的影响比与rhTNF- 6更强。rhIL-6和可溶性IL-6受体-α (sIL-6Rα)或rhIL-6和tocilizumab (TCZ)的组合，一个完全人源化的重组单克隆抗体，中和IL-6和IL-6R之间的相互作用，显著减少C28/I2软骨细胞MMP-9的产生。然而，TCZ对rhTNF-α诱导的MMP-9的产生没有影响。相比之下，虽然与对照组相比，sIL-6R显著减少了NGAL阳性细胞的数量，但与rhIL-6联合TCZ相比，rhIL-6没有增加C28/I2软骨细胞产生的NGAL，但与rhIL-6联合TCZ没有增加NGAL。综上所述，这些结果表明，在C28/I2软骨细胞系中，rhIL-6刺激MMP-9的产生，而不是NGAL的产生。TCZ或sIL-6Rα抑制hil -6诱导的MMP-9生成。

关键字

IL-6, tocilizumab, matrix, metalloproteinase-9, c28/i2永生化人软骨细胞

介绍

矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9;白明胶酶B;92 kDa白明胶酶;92kda IV型胶原酶)是介导各种关节炎进展的关键MMP[1]。MMP-9具有降解多种关节软骨细胞外基质(ECM)蛋白的能力，包括聚集蛋白、连接蛋白和II型胶原蛋白，这些蛋白都有助于维持正常的软骨生物力学功能[1]。重要的是，在各种类型的关节炎中，软骨细胞MMP-9随着滑液环境中促炎细胞因子水平的升高，基因表达显著上调，例如intereukin-6（IL-6）、IL-1β、IL-17和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）[1-3]。

来探究每一种细胞因子对MMP-9关节软骨细胞的基因表达在体外通常需要对每一种特定的抑制剂分别进行测试。在这方面，IL-1β或TNF-α阻断对MMP合成的影响以前曾有报道，结果显示IL-1受体拮抗剂或TNF-α阻断单克隆抗体抑制MMP合成[4]。然而，IL-6对培养的人软骨细胞产生MMP-9的贡献仍有待充分阐明。因此，为了实现这一目标，tocilizumab (TCZ)一种重组人源化IgG1(κ)单克隆抗体，可中和IL-6和IL-6受体-α (IL-6Rα)之间的相互作用，抑制重组人(rh) IL-6介导的MMP-9生成。这些人软骨细胞系被用于这项分析，因为它们此前已被证明表达软骨特异性细胞外基质蛋白基因[6,7]。T/C28a2和C28/I2软骨细胞也表达了真正的人类软骨细胞的其他几个分子特征，最显著的是分子特征SOX9基因，被认为是几种软骨特异性基因的“主”转录调节因子，如II型胶原(COL2A1)基因和聚集蛋白(AGRN)基因(6 - 8)。

还评估了rhIL-6对软骨细胞来源的中性粒细胞明胶酶相关脂calin (NGAL)合成的影响。分析C28/I2软骨细胞产生NGAL的基本原理来源于我们之前的报道，从人骨关节炎膝关节软骨获得的软骨细胞合成了NGAL，以响应IL-1β[9]。此外，我们发现，从终末期骨关节炎患者获得的滑膜液中发现了MMP-9复合体中的NGAL。此外，我们通过证明MMP-9/NGAL复合物能够阻止MMP-9的降解，从而保持MMP-9活性[10]，证明MMP-9/NGAL复合物能够保持MMP-9活性。

材料和方法

人软骨细胞系

永生化的人类幼年软骨细胞系T/C28a2和C28/I2来自Mary B.Goldring教授的实验室[康奈尔大学特殊外科医院/威尔医学院（纽约州纽约市）]。

PANC-1

PANC-1是胰腺癌细胞系，取自美国型培养标本(Manassas, VA)。

MMP-9/ NGAL酶联免疫吸附试验(ICC)

含抗mmp -9抗体的ELISA试剂盒购自美国Aviva Systems公司(San Diego, CA)。用于检测NGAL的ELISA试剂盒购自Pierce Biotechnology (Rockford, IL)。用于ICC的抗mmp -9抗体和抗ngal抗体购自Abcam公司(Cambridge, MA)。用于ICC的人抗MMP-9抗体是针对大鼠MMP-9催化结构域重组片段产生的兔多克隆抗体。根据制造商的说法，这种抗MMP-9抗体与前MMP-9和激活的MMP-9都有反应。对于NGAL ICC，用于产生抗NGAL抗体的免疫原是合成的肽段，对应于大鼠NGAL n端38-53氨基酸序列LQPGFWTERFQGRWFV。

重组人（rh）IL-6、rhTNF-α和可溶性IL-6受体-α（sIL-6Rα）

细胞因子、rhIL-6、rhTNF-α和可溶性IL-6Rα（sIL-6R）从不同的商业供应商处购买。

叫(TCZ)

Tocilizumab (TCZ)是通过基因泰克/罗氏集团(南旧金山，CA)和凯斯西储大学(Case Western Reserve University)之间的研究合同获得的。

人T/C28a2、C28/I2软骨细胞和PANC-1

T/C28a2或C28/I2软骨细胞维持在Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM)/F12 Medium(1:1)中，添加10% (v/v)胎牛血清(FBS)。PANC-1按照美国组织培养收藏提供的说明进行连续培养。

MMP-9/NGAL酶联免疫吸附试验和MMP-9/NGAL ICC实验条件

TC28a2或C28/I2软骨细胞(3 × 10⁵细胞/毫升,ELISA;10⁵细胞/ml, ICC)在含0.5%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)中孵育，条件如下:“无添加”(对照)，hil -6 (50 ng/ml)， sIL-6R (30 ng/ml);rhTNF-α (20 ng/ml)， TCZ (200-800 ng/ml)， rhIL-6 + TCZ, rhTNF-α + TCZ，或rhIL-6 + sIL-6R各60分钟和4小时。本研究中使用的IL-6和sIL-6R浓度基于此前发表的数据，这些数据表明:1)IL-6 (50 ng/ml)激活软骨细胞JAK/STAT和ERK-MAPK信号[11];2) sIL-6R浓度(30 ng/ml)接近据报道在RA滑膜液中发现的最大sIL-6R浓度(10-40 ng/ml)[12]。

PANC-1被用作MMP-9产生的阳性对照，因为PANC-1先前已被证明过度产生MMP-9[13]。此外，发现MMP-9在对佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）的反应中显著高于对照水平[13]。因此，将PANC-1、T/C28a2和C28/I2软骨细胞用于MMP-9 ELISA，将PANC-1和C28/I2软骨细胞用于抗MMP-9抗体ICC。对于MMP-9 ELISA，T/C28a2、C28/I2或PANC-1中的MMP-9浓度通过蛋白质裂解物的连续稀释测定。使用重复ELISA测定的平均值来计算细胞产生的MMP-9的量（pg/ml）。

对于ICC，使用Metamorph对对照组和治疗组的6个取样区域的显微照片的平均强度进行量化，枚举抗mmp -9阴性或抗mmp -9阳性的PANC-1或C28/I2软骨细胞和ngal阴性或ngal阳性软骨细胞的数量^®软件程序。然后将平均强度归一化为阴性对照，以确定在任意单位报告的MMP-9或ngal阳性细胞的数量。

数据分析

ELISA分析:C28/I2软骨细胞产生的MMP-9或NGAL (pg/ml)的数量使用各自ELISA重复测定的平均值计算。卡方检验(www.socscistatistics.com/tests/chisquare/default2.aspx)用于计算单独使用rhIL-6（50 ng/ml）和rhIL-6加TCZ处理的C28/I2软骨细胞在不同浓度下产生的MMP-9量之间的差异显著性，卡方2×2表中使用的各组之间的预期差异为Δ=+/-20%。

国际刑事法庭的分析:根据计算机生成的抗MMP-9抗体/抗NGAL抗体ICC结果计算对照组（n=5）或各治疗组（n=5）中MMP-9阳性或NGAL阳性细胞的频率。结果显示为“任意单位”然后通过确定对照组的方差是否相等进行分析。然后使用单向方差分析计算器（turner.faculty.swau.edu/mathematics/math241/materials/ANOVA）计算F值为了计算p值，采用Student t检验对方差相等的组进行比较，其中p<0.05被认为是显著的。

结果

rhIL-6和rhTNF-α增加MMP-9的生成：sIL-6R和TCZ的作用

MMP-9酶联免疫吸附测定的标准曲线表明，MMP-9浓度与OD呈正相关_450海里为线性(图1)。该标准曲线用于计算T/C28a2或C28/I2软骨细胞或PANC-1细胞产生的MMP-9 (pg/ml)的量，直接插值OD_450海里对各种细胞裂解液进行测量。

培养C28/I2软骨细胞，而不是T/C28a2软骨细胞，rhIL-6增加MMP-9的产生。当rhIL-6与sIL-6R或TCZ联合时，MMP-9的产生减少(图2)。虽然rhIL-6也增加了PANC-1细胞中的MMP-9，但rhIL-6与TCZ联合并没有抑制MMP-9。值得注意的是,rhTNF -α的影响MMP-9生产T / C28a2或C28 / I2软骨细胞与rhIL-6更健壮(图2)。然而,rhTNF -α和TCZ没有影响MMP-9生产T / C28a2软骨细胞而rhTNF -α和TCZ MMP-9生产减少了Δ= -10% C28 / I2软骨细胞。

孵化PANC-1细胞rhIL-6增加MMP-9相似程度作为C28 / I2软骨细胞被发现(图2)。然而,而结合rhIL-6 + sIL-6R减少MMP-9 C28 / I2软骨细胞无法检测到的水平,结合rhIL-6 + sIL-6R MMP-9由PANC-1没有影响。

相比之下，与dmso对照组相比，与PMA (30.7 ng/ml)孵育的PANC-1细胞作为MMP-9产生[13]的阳性对照，MMP-9的产生显著增加(图2)。

图1。MMP-9 ELISA标准曲线

图2。MMP-9 ELISA检测T/C28a2, C28/I2软骨细胞和PANC-1细胞产生MMP-9的情况。MMP-9生产:%改变OD_450海里相对于"不添加"控制组。各组细胞因子、抑制剂或其他因子浓度为rhil -6- 50ng /ml;sIL-6R-30 ng / ml;tcz - 200 ng / ml;rhTNF -α-20 ng / ml;pma - 30.7 ng / ml。T/C28a2软骨细胞与rhTNF-α或rhTNF-α + TCZ或PMA孵育的pan -1细胞产生的MMP-9值超过350 pg/ml。

TCZ浓度对C28/I2软骨细胞产生MMP-9的影响

接下来，我们研究了在200 ng/ml和800 ng/ml之间改变TCZ浓度对C28/I2软骨细胞对rhIL-6 (50 ng/ml)产生MMP-9的影响。虽然MMP-9 ELISA重复检测的平均值显示TCZ (200 ng/ml)在1小时后降低了rh -6诱导的MMP-9的Δ = -16%(图3)，但这一差异没有达到统计学意义。然而，浓度从400 ng/ml到800 ng/ml的TCZ在1小时后显著降低了MMP-9(图3)。此外，rhIL-6和TCZ联合使用后，MMP-9的降低持续了4小时(图3)。浓度大于200 ng/ml的TCZ在1小时(图3)或4小时(图3)时均未增加其对MMP-9产生的抑制作用。所有组比较的卡方分析结果总结在表1中。

表1。χ²TCZ对C28/I2软骨细胞产生MMP-9的影响

团体	(TCZ)	60分钟	4小时
1	200纳克/毫升1	χ2=0.38; p=0.54	χ2= 9.6;p = 0.002 *
2	400纳克/毫升2	χ2= 10.1;p = 0.001 *	χ2= 18.7;P = 1.5 × 105 *
3.	600毫微克/毫升3.	χ2= 3.96;p = 0.046 *	χ2= 17.6;P = 2.6 × 105 *
4	800毫微克/毫升4	χ2= 5.16;p = 0.02 *	χ2= 17.6;P = 2.6 × 105 *

[TCZ]与[rhIL-6]的比值:¹4:1;²8:1;^3.12:1;⁴16:1

*p-值为显著性<0.05

图3。TCZ对C28/I2软骨细胞产生rhIL-6介导的MMP-9的影响。rhIL-6浓度为50ng/ml，TCZ浓度为200ng/ml～800ng/ml。

C28/I2软骨细胞和PANC-1产生MMP-9的ICC分析

通过ICC分析MMP-9的产生，使用抗MMP-9抗体，该抗体与MMP-9前和激活的MMP-9都有反应。图4A显示C28/I2软骨细胞MMP-9阴性对照的外观。该图像是通过处理细胞ICC而不应用一抗mmp -9抗体得到的。其他显微照片(图4B)显示了来自Metamorph鉴定的“无添加”对照组的C28/I2软骨细胞^®如MMP-9阳性（箭头所示），覆盖层滑动的6个区域包括ICC分析所列举的微观区域。

图5显示了抗mmp -9抗体阳性C28/I2软骨细胞经hil -6 (50 ng/ml)处理24小时后的ICC，并与“无添加”对照组或10%胎牛血清对照组的C28/I2软骨细胞进行了比较。定量分析显示，与“不添加”对照组相比，rhIL-6显著增加了抗mmp -9抗体阳性软骨细胞的数量[即。DMEM/F12(1:1)含0.5%胎牛血清;(p = 1.23 × 10^－７)]. 为了进一步确定rhIL-6对C28/I2软骨细胞MMP-9生成的特异性，还将PANC-1细胞与rhIL-6（50 ng/ml）孵育24小时。rhIL-6对MMP-9阳性PANC-1细胞的数量没有显著影响（“无添加”对照，任意单位，17.3±0.28；rhIL-6，15.5±0.78；平均值±标准差，n=5；p=0.67）。

C28/I2软骨细胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)中维持24小时后，与含0.5%胎牛血清的“不添加”对照组相比，mmp -9阳性软骨细胞数量增加(p<2 × 10)^－3)．这一结果为在0.5%胎牛血清中维持C28/I2软骨细胞以测定不同处理组中MMP-9的生成提供了充分的理由。

虽然与“不添加”对照组相比，单独与rhIL-6孵育的C28/I2软骨细胞mmp -9阳性软骨细胞数量显著增加，但与sIL-6R组合也显著增加mmp -9阳性软骨细胞数量(p = 3.1 x 10)^－5)(图6)，而与rhIL-6相比，单独sIL-6R显著减少mmp -9阳性软骨细胞的数量(p = 2.2 × 10)^－4)．与rhIL-6相比，rhIL-6 + TCZ组也是如此(p = 9.7 × 10)^－4)(图6)。重要的是，与rhIL-6相比，TCZ单独对软骨细胞mmp -9阳性没有显著影响(p = 0.07)。

图4。抗mmp -9抗体介导免疫细胞化学(ICC)。

面板:C28/I2软骨细胞阴性对照(─= 100 μm)。
面板B:箭头为mmp -9阳性软骨细胞(─= 100 μm)

图5．0.5%胎牛血清、10%胎牛血清或含rhIL-6 (50 ng/ml)的DMEM/F12(1:1)对C28/I2软骨细胞(= 100 μm)产生MMP-9的影响。

值为平均值±SD (n=6个微观场)

图6不同培养条件对C28/I2软骨细胞产生MMP-9的影响：抗MMP-9抗体介导的ICC。数值为平均值±SD（n=5）

* p = 2.2 × 10^－4；** p = 3.1 × 10^－5；*** p = 9.7 × 10^－4

C28/I2软骨细胞产生NGAL的ICC分析

ngal阳性细胞数量明显减少(F = 48.86;P = 4.3 x 10^－4)通过sIL-6R与“不添加”对照组比较，以及通过重组人白细胞介素-6加TCZ的组合（F=19.00；p=4.7×10^－3)(图7)。相比之下，其他孵育条件均未改变NGAL产量(图7)。值得注意的是，与rhIL-6相比，rhIL-6加TCZ未能显著降低NGAL。总的来说，不同治疗组NGAL阳性软骨细胞的ICC分析与NGAL ELISA得到的结果一致(数据未显示)。

图7．不同培养条件对C28/I2产NGAL的影响

软骨细胞:抗ngal抗体介导的ICC。在各种孵育条件中，只有sIL-6R (p = 4.3 × 10^－4)和rhIL-6 + TCZ组合(p = 4.7 × 10^－3)与“不添加”N/A对照组相比，显著减少NGAL阳性细胞的数量。然而，与单独使用rhIL-6相比，rhIL-6与TCZ联合使用并没有减少NGAL阳性细胞的数量。数值为平均值±标准差（n=5）

细胞Immunol(S6:001)

讨论

本研究的主要目的是1）确定rhIL-6刺激永生化人幼年软骨细胞系产生MMP-9和NGAL的程度；2）确定sIL-6R或TCZ是否为完全人源化的IgG1（κ）单克隆抗体，其中和IL-6和IL-6Rα之间的相互作用，增强或抑制MMP-9和/或NGAL。

MMP-9 ELISA的主要结果是，单独使用rhIL-6刺激C28/I2产生MMP-9，而不是T/C28a2不朽的人软骨细胞。在MMP-9 ELISA中，rhIL-6和sIL-6R的结合显著降低了C28/I2软骨细胞中MMP-9的生成，最重要的是，与rhIL-6相比，rhIL-6和TCZ的结合也降低了MMP-9。在分析MMP-9 ELISA和抗MMP-9 ICC结果时，我们发现rhIL-6和TCZ的联合降低了MMP-9，但与rhIL-6相比，TCZ本身对软骨细胞来源的MMP-9没有影响。这些数据强烈提示TCZ可以中和rhIL-6和IL-6R之间的相互作用在体外减少C28/I2软骨细胞MMP-9的生成。然而，TCZ在何种程度上是抑制关节软骨细胞产生MMP-9的有效治疗策略仍有待确定在活的有机体内．这应该首先在经过充分验证的类风湿性关节炎和骨关节炎动物模型中进行测试。尽管TCZ是IL-6介导的JAK/STAT激活[5]的有效抑制剂，可以减少MMP-9的产生，但TCZ将无助于分辨三个潜在的IL-6途径(即。IL-6Rα/gp130, mIL-6R, sIL-6R)被TCZ改变，因为TCZ不能选择性地抑制IL-6Rα/gp130通路[14]。

即使我们使用MMP-9 ELISA和anti-MMP-9基于抗体的ICC定量分析,我们无法确定任何程度的各种治疗组改变或pro-MMP-9和/或激活MMP-9因为anti-MMP-9抗体用于国际刑事法庭分析并不区分两种酶的形式。因此，我们认识到这是本研究的一个重要局限性。

众所周知，IL-6在许多细胞类型[5]中激活JAK/STAT通路，包括软骨细胞[4,11]。在这方面，以前只有两篇发表过在体外研究旨在关联MMP-9的产生本身STAT蛋白磷酸化。在其中一项研究中，迪琼et al。[15]表明两者之间存在“强”的关系MMP-9原发性乳腺癌标本中酪氨酸磷酸化STAT3 (STAT3c)的基因表达和水平。在另一项研究中，Kothariet al。[16]显示il -6诱导巨噬细胞MMP-9基因表达主要依赖于p-ERK1/2MMP-9基因表达也受到jak依赖产物IL-10的抑制。鉴于这些结果，未来在体外实验应该确定rhIL-6激活STAT蛋白与激活pro之间的精确关系-MMP-9基因活性，以及识别任何辅助因子，也可能参与亲MMP-9基因表达[17]。在这方面，人们普遍认为，这些研究将必须采用定量PCR进行评估MMP-9基因表达以及明胶浸渍酶谱，以确定在各种培养条件下pro-MMP-9被激活的程度。事实上，在分析mmp -9激活[18]的过程中，“明胶酶谱”将是这个评估的关键。这是由于潜在的mmp -9细胞内加工可以产生不同形式的活性明胶酶，分子大小从64 kDa到82 kDa不等。

最后，rhIL-6未能刺激C28/I2软骨细胞产生NGAL。这一结果与先前获得的人骨关节炎软骨细胞对rhIL-1β[9]应答产生NGAL的结果形成对比。这种差异可能仅仅代表了人类软骨细胞对IL-1β和IL-6的不同反应，或者人类OA软骨细胞和C28/I2人类软骨细胞之间的差异。

值得注意的是，Zer2021版权归OAT所有。版权所有人保留了正常成人关节软骨或气管软骨中NGAL蛋白的任何证据，也保留了由培养的大鼠胚胎软骨细胞产生的NGAL蛋白的任何证据。然而，脂多糖（LPS）可在大鼠软骨细胞培养物中诱导NGAL蛋白合成[19]，表明NGAL基因被LPS和其他促炎介质上调。

在用rhIL-6 + sIL-6或rhIL-6 + TCZ处理C28/I2软骨细胞后，也评估了NGAL产生的变化。因此，虽然与单独使用rhIL-6相比，rhIL-6和TCZ组合抑制MMP-9的产生，但抗NGAL抗体ICC的结果显示，与rhIL-6相比，rhIL-6加TCZ并没有显著影响NGAL的产生，尽管与“不添加”的对照组相比，rhIL-6加TCZ显著降低了NGAL。

最后，结果是在体外这项研究可能对潜在应用TCZ来调节各种关节炎条件下关节软骨的rhil -6诱导的MMP-9和/或NGAL产生具有实质性意义。由于MMP-9与NGAL形成复合物，且MMP-9/NGAL复合物维持MMP-9处于激活状态[10]，TCZ无法有效调节C28/I2软骨细胞NGAL生成的推测可能对未来的翻译研究具有重要意义。尽管与“不添加”对照组相比，sIL-6R以及rhIL-6 + TCZ组合显著抑制了NGAL的产生，总的结果表明，在关节炎疾病中使用治疗水平的TCZ可能是调节软骨细胞NGAL水平升高的最有效的方法，当NGAL是在响应与关节炎相关的其他促炎细胞因子(包括IL-1β [4]， TNF-α[4])的联合作用下过度产生时，IL-17A[20]和OSM[21]。

确认

这项研究得到了基因泰克/罗氏集团、首席研究员Charles J.Malemud博士和Case Western Reserve University（CWRU）之间合同的支持，由NICHD R01-069819-01A1，首席研究员；Sam Mesiano博士和NEI P30-EY11373，CWRU视觉科学核心中心赠款；联合首席研究员Eric Pearlman和Irina Pikuleva。我们感谢Scott Howell博士对ICC分析的支持。

利益冲突陈述书

作者声明没有利益冲突。

参考

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