华沙医科大学医学生物系，波兰华沙
波兰科学院Mossakowski医学研究中心实验药理学系，波兰华沙
DOI: 10.15761 / IMM.1000146
人类角膜从供体转移到人工储存介质的过程中，伴随着细胞对环境创伤性变化的短暂应激反应。本研究的目的是在代谢水平上研究细胞应力介导的组织变化。8个来自58-67岁捐献者的人角膜在死后获得，并在+4°C的Eusol-C中保存3天。用HR MAS检测样品的每日代谢谱变化1核磁共振波谱学。
角膜中有24种代谢物。观察到保存组织与未保存组织之间ATP、丁酸、甲酸、谷氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸的代谢谱有显著差异。人类角膜从自然环境转移到储存介质中，会在保存的最初几天内产生代谢变化。进一步的研究应该解释它们是暂时的还是可能对受体的移植物存活有影响。
细胞应激，角膜生物化学，冷藏，代谢组学，核磁共振光谱学
人类细胞与自然细胞的分离在活的有机体内环境应该被认为是影响其酶系统或功能的一个非常重要的创伤因素，如果细胞是同质组织的一部分，则该组织的功能。这种创伤或相关的应激因素可能导致细胞膜完整性的短暂丧失，一些受影响的细胞可能激活不可逆的凋亡过程。在一些严重的情况下，细胞凋亡是受影响细胞的常见现象，导致整个组织的死亡[1-3]。为了防止这种现象，人们开发了模拟自然环境的存储介质。根据保存的细胞或组织类型的不同，这些人工培养基含有与所发现的浓度相对应的必要营养物质在活的有机体内并辅以进一步的储存条件，如抗生素或温度[4,5]。
尽管人工储存介质已为人所知数十年，但仍有研究在进行，目的是改进其内容或发展角膜储存的新概念(见例[6])。此外，非常成熟的存储介质也是其对移植物生化特性影响的研究对象(见例[7-9])。其他研究旨在建立储存时间或储存技术与移植结果[10]之间的联系。所有这些研究都引起了眼科医生，特别是角膜移植的研究人员的极大兴趣。如今，临床医生掌握了角膜在储存介质中保存过程中出现的形态学变化的详细信息，这些信息可用于移植手术前对移植物的评估[11,12]。不幸的是，人们仍然不太了解在储存的最初几天里，组织中立即出现的生化变化。
本研究的目的是揭示人体移植组织从自然环境转移到人工储存介质中的生化变化。来自健康供体的角膜组织和用于代谢组学分析的核磁共振波谱工具被用于此目的。
这项研究遵守了《赫尔辛基宣言》的原则和关于人体研究和使用人体组织和器官的地方条例，并已提交华沙医科大学生物伦理委员会，该委员会承认这项研究的议定书，没有提出反对意见。
8个人角膜来自10个58-67岁的供体，死后4-8小时。供体无系统性或慢性疾病，近期无药物治疗报告。这些捐献者都不是酗酒者、肝炎病毒感染者、自身免疫疾病患者或癌症患者。裂隙灯生物显微镜评价角膜质量符合欧洲眼库协会标准[11]后，切除直径10mm(卡尺测量)的角膜纽扣，去除巩膜和角膜缘缘。然后，将四分之一的角膜(披萨片)分离出来，立即在-80°C冷冻，直到分析。这些样本被认为是对照。其余组织置于+4℃的Eusol-C (Alchimia s.r.l.， Padova, Italy)储存介质中。每天将角膜的四分之一与剩余组织分离，用冷(+4℃)无菌0.9% (w/v) NaCl溶液冲洗，在- 80℃冷冻。采集角膜3天。
本研究使用的角膜由于解剖过程中造成的一些上皮损伤而不适合移植。
人力资源马斯1H NMR波谱数据是在14.1 T Avance DRX600 Bruker光谱仪(Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Germany)上采集的，工作频率为600.132 MHz。在分析之前，冷冻样品被切成小块，浸泡在冷的(+4°C) 25 mM钠溶液[2,2,3,3-d]中43 ' -三甲基硅基丙酸D2O在一个4毫米直径(50 μl容量)氧化锆转子。光谱记录在+4°C使用4毫米1H /13C MAS探针。样品在5000赫兹旋转，扫描次数为512。采用预饱和选择性脉冲进行水抑制。采用0.3 Hz的指数线展宽。Carr-Purcell-Meiboom-Gill光谱分析使用MestreNova v. 5.1.0软件(Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Spain)进行。使用绝对积分测量峰面积，并由被测样品的湿重归一化(角膜样品的重量范围;立即冷冻:7.3-12.1 mg;保存1天:7.1-12.2 mg, 2天:7.4-11.9 mg, 3天:7.3-12.0 mg)，并按照前面的方法在光谱中分配代谢产物[7-9]。
在HR MAS中，所研究代谢产物的检出限相对较高(在mM范围内)1核磁共振波谱学。这些代谢物的缺失是不可能的，对于低于相应检测限的代谢物滴度使用“0”将扭曲统计分析的结果。因此，这种“无效”滴度被省略了。
代谢产物含量数据采用重复测量单因素方差分析，以角膜在培养基中存放时间为重复测量因子。然后对所有代谢物进行两两比较，Bonferroni校正(程序R, ver。2.10）
在HR MAS中指定的24个低分子量代谢物中1H NMR谱(代表性谱见图1)显示6种化合物的浓度水平在3天的储存中发生了变化。谷氨酸和苯丙氨酸均低于检出限。在Eusol-C中保存2 ~ 3天的样品中ATP、甲酸酯和蛋氨酸水平显著低于对照组。在对照样品中未检测到丁酸盐(图2)。
图1．完整人体角膜样本的代表性HR - MAS 1H NMR谱。ppm值由[2,2,3,3-d4]3 ' -三甲基硅基丙酸钠(TSP)作为参考物质在0 ppm分配。交流乙酸;阿拉巴马州丙氨酸;参数精氨酸;Asc抗坏血酸盐;三磷酸腺苷，三磷酸腺苷;但丁酸;胆固醇胆碱;Cr肌酸;为甲酸;α-、相关,α葡萄糖;β、相关,β葡萄糖;Gln谷氨酰胺;Glu谷氨酸;GPCglycerophosphocholine;他的组氨酸;Ile异亮氨酸;虫胶乳酸;低浓缩铀亮氨酸;见过蛋氨酸;m-Ino肌醇;板式换热器苯丙氨酸;苏琥珀酸;τ,氨基乙磺酸;酪氨酸酪氨酸;瓦尔缬氨酸。*推测地点但在对照组的角膜中没有检测到。
所有参与研究的角膜的内皮细胞密度(ECD)测量值在2450-2750个细胞/毫米之间2．各组样品之间没有发现显著的ECD差异。
HR MAS(高分辨率魔角旋转)1与其他方法相比，H NMR(质子核磁共振)波谱法作为分析工具有一个主要优势:它允许从单个样品中获得大量数据。然而，应该强调的是，在核磁共振波谱中指定的化合物代谢产物水平反映了整个(“完整的”)组织的平均含量，该组织由几种不同的细胞类型/层组成。此外，化合物指定在1H谱仅限于自由的，未束缚的，低分子量化合物。因此，该方法不提供任何关于可与研究组织中更大的结构或分子进行化学结合的生物化学“储备”的信息，而是强调了指定自由化合物[13]浓度随时间变化的代谢特性。
将细胞或组织从宿主环境转移到存储系统具有非常重要的意义，例如，在移植中，特别是在移植器官不能直接从供体转移到受体的情况下。保存在活的有机体内器官的属性在体外尽管有免疫特性，但条件是决定嫁接成功或失败的最关键因素之一[1,2]。角膜移植是一个例外，因为该手术的早期结果通常很好，约90%的病例在术后一年存活[14]。这在某种程度上是由于角膜组织具有免疫特权，而且随着[15]年的发展，目前的手术或眼库程序已显著改进。然而，应该强调的是，尽管[14]上面提到的所有改进，仍然有一些不明原因的拒收报告。
有两种主要类型的存储系统用于角膜银行:温暖和低温(冷)存储[16]。在本研究中使用的低温储存条件下，角膜通常在封闭系统中保存在商业可获得的2-8°C的介质中，从制备到移植。低温被认为可以减少甚至抑制细胞代谢，然后减少细胞对代谢能量和营养的需求。一般来说，这种方法的目的是保存原来的(在活的有机体内)的特性[16]。然而，储存介质对供体组织来说总是一个紧张的环境，因为任何介质的组成都不能取代天然泪液的内容，这种天然泪液是几种化合物或来自眼周组织中腺体分泌物的混合物[17,18]。
尽管低温会使细胞代谢最小化，但在euol - c中储存的最初几天内，ATP水平会下降(图2)。我们无法解释这一结果，只能认为为了保护细胞/组织免受损伤，多余的ATP作为能量来源被取代，以维持初级的，至少是保护细胞的酶系统。ATP的消耗与它的生产不相平衡，可能是由于储存介质的温度较低。本研究中观察到的ATP水平的变化证实了Redbrake之前的报告等．[19]表现出类似的能量变化模式，并随着损伤内皮细胞在组织中储存数量的增加而增加。甲酸盐水平的变化可能支持与保护相关的ATP消耗升高的论点(图2)。这种生化化合物是一种抗氧化剂，保护细胞免受氧化损伤[20]。它在组织中的剥夺可能表明细胞对自由基种类的暴露增加，并间接证实了能量利用的增加。
图2．贮藏时间对指定低分子量代谢物含量的影响。数据为HR MAS的均值±SEM1H NMR峰积分除以组织湿重。* - p < 0.05vs。控制;X -在各自的核磁共振光谱中没有检测到代谢物峰。代谢物标签见图1图例。
有趣的是，蛋氨酸的浓度变化模式与ATP和甲酸酯相同，而谷氨酸和苯丙氨酸在保存的样品中下降到甚至无法检测的浓度水平(图2)。对这种现象的解释有几种可能:例如，细胞蛋白质的周转或合成增加，细胞中某些酶系统的故障或细胞膜完整性的短暂丧失导致氨基酸外流到培养基中。鉴于之前关于冷藏过程中角膜细胞死亡增加的报道[19,21-23]，应特别考虑后一种选择。此外，本研究的结果也支持这一生物化学化合物在角膜中的剥夺机制。游离丁酸盐是一种短链脂肪酸，形成酯，是细胞膜和额外能量来源[24]的组成部分，在保存的角膜样品中达到了可检测的水平(图2)。另一方面，euusol - c虽然是一种非常基本的介质，但包含了其他氨基酸[25]。那么，从死亡或死亡细胞释放的代谢物到邻近组织或储存介质中以及从储存介质中运输化合物到组织中都应该被考虑在内。
氧化应激或任何代谢失衡从来不被认为是角膜移植资格的重要因素。在过去和现在，更多的关注是免疫因素、传染性病原体的存在以及组织的细胞或结构完整性等[11,12]。人们应该意识到，细胞和组织的解体通常开始于分子水平，当一种代谢化合物超过正常水平或从细胞空间消失，导致，例如，个体或多个代谢途径的故障。如果这种紊乱持续存在，而没有任何代谢补偿机制能够有效地扭转这种不平衡，那么生化异常就会不断累积，直到达到导致细胞死亡的不可逆变化的水平。问题是，从扰乱代谢途径到出现细胞死亡的最初症状，有时还有很长的路要走。可能，在人工培养基中储存期间开始的过程可能在移植手术后继续。然后，受者可能会面临突如其来的移植物排斥反应，临床描述为“未知原因”，这种情况有时会发生在角膜移植中[14]。这一问题有待进一步研究。
作者感谢Anna midelfaart和Jozef Langfort的宝贵建议、支持和技术支持。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年6月1日
录用日期:2015年6月09日
发布日期:2015年6月12日
©2015 Kryczka T.这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Kryczka T(2015)将人角膜从体内转移到体外环境后的细胞应激:一种代谢组学方法。整合分子医学2:DOI: 10.15761/ im .1000146
华沙医科大学医学生物系，Ul。noogrodzka 73，波兰华沙02-018，电话:+48 604315103;传真:+48 226253223。
图1．完整人体角膜样本的代表性HR - MAS 1H NMR谱。ppm值由[2,2,3,3-d4]3 ' -三甲基硅基丙酸钠(TSP)作为参考物质在0 ppm分配。交流乙酸;阿拉巴马州丙氨酸;参数精氨酸;Asc抗坏血酸盐;三磷酸腺苷，三磷酸腺苷;但丁酸;胆固醇胆碱;Cr肌酸;为甲酸;α-、相关,α葡萄糖;β、相关,β葡萄糖;Gln谷氨酰胺;Glu谷氨酸;GPCglycerophosphocholine;他的组氨酸;Ile异亮氨酸;虫胶乳酸;低浓缩铀亮氨酸;见过蛋氨酸;m-Ino肌醇;板式换热器苯丙氨酸;苏琥珀酸;τ,氨基乙磺酸;酪氨酸酪氨酸;瓦尔缬氨酸。*推测地点但在对照组的角膜中没有检测到。
图2．贮藏时间对指定低分子量代谢物含量的影响。数据为HR MAS的均值±SEM1H NMR峰积分除以组织湿重。* - p < 0.05vs。控制;X -在各自的核磁共振光谱中没有检测到代谢物峰。代谢物标签见图1图例。
