沙特阿拉伯阿尔费萨尔大学医学院外科学系
沙特阿拉伯阿尔费萨尔大学医学院病理学系
电子邮件:aouban@alfaisal.edu
美国南佛罗里达大学医学院病理学系
沙特阿拉伯阿尔费萨尔大学医学院外科学系
DOI: 10.15761 / IMM.1000148
claudin是细胞间紧密连接的主要封闭蛋白，在肿瘤的进展和扩散中起着重要作用。一些作者报道了结直肠癌中claudin-1表达的相互矛盾的结果。本研究的目的是同时检测结直肠癌和转移瘤组织芯片中claudin-1的表达，以评估该蛋白在结直肠癌中的预后价值。本研究通过免疫组化方法分析了99个组织样本中claudin-1的表达情况(包括33例结直肠癌，其中33例淋巴结转移灶一致，33例癌旁正常组织一致，均来自同一患者)。肿瘤包括结肠腺癌(25例)和直肠腺癌(8例)。这是第一个在结直肠癌及其转移瘤样本中同时证明claudin-1蛋白表达的研究。我们报告在大多数病例中淋巴结转移中缺失claudin-1表达。我们还报道了claudin-1在不同分级的结直肠癌中的表达差异，在高分化、低分级的肿瘤中表达最高;在大多数低分化，高级别肿瘤的病例中完全失去表达。
结肠癌，癌症，claudin-1，紧密连接蛋白，腺癌
囊结蛋白是紧密连接蛋白，它与粘附连接和桥粒一起形成细胞片。紧密连接(TJs)对细胞片的密封至关重要，从而控制细胞旁离子通量。此外，紧密连接在维持细胞极性和信号转导方面也起着至关重要的作用[1,2]。克洛丁是紧密结链的骨干，是紧密结[1]功能的重要组成部分。
通常在正常分化的组织中观察到的高度细胞组织常常在癌症中消失。随着claudin水平的变化，上皮完整性的丧失以及由此导致的胞旁渗漏的增加，在为肿瘤细胞活动提供空间和增加肿瘤细胞下方的营养供应方面起着关键作用。
一些分析紧密连接在肿瘤发生中的作用的研究揭示了claudin的表达下调或上调[3-10]。这些蛋白的下调和丢失是癌变过程中的预期事件。当细胞变恶性时，它会失去与底层基膜和附近细胞的连接，在此过程中TJs会被破坏和丢失。值得注意的是，许多其他的研究表明TJs在不同类型的癌细胞中都有过表达。这些过表达事件很可能与这些基因所起的作用有关，而不是与细胞旁密封形成[11]有关。正是通过这些“其他”功能[1,2]，TJs特别是claudin在致癌过程中发挥作用。总之，无论claudin是上调还是下调，都被证明是肿瘤发生的关键。
上述claudin在致癌和转移中的作用的一个主要例子是claudin-1。它是b -连环蛋白[12]强烈调控的基因之一。后者因其在维持细胞间粘附和最重要的介导致癌Wnt/B-catenin转导途径方面的作用而闻名。Claudin-1、claudin-3和claudin-5被证明可以促进pro-MMP2, claudin在细胞表面招募mmp以达到较高的局灶浓度，并最终激活pro-MMP2[12]。
在几种癌症中，Claudin-1的表达经常发生改变，包括上调和下调[13]。在结直肠癌中，claudin-1在肿瘤发生中起着重要作用，并已被证明具有预后价值[14]。Dhawanet al。[15]表明，claudin-1的上调有助于侵袭性和转移性表型，而它的下调导致B-catenin / Tcf /中位数信号[15]。
这项研究和其他研究证实了claudin-1的上调在结肠癌发生和转移中的作用。然而，令人遗憾的是，关于结直肠癌中claudin-1的表达，有几位作者报道了相互矛盾的结果。一些作者报道了结直肠癌中claudin-1表达的抑制，并将其与浸润深度、组织学分级和淋巴管/神经周浸润联系起来[16-21]。雷斯尼克et al。[21]进一步证实，claudin-1表达缺失是疾病复发和II期结肠癌患者生存率差的一个强有力的预测因子。另一方面，其他研究表明，CRC细胞中claudin- 1的表达增加[12,15,22-24]，通过激活基质金属蛋白酶[25]，导致肿瘤侵袭深度增加[15,23]。
这种矛盾打击了将claudin-1作为大肠癌预后的生物标志物。如果没有可靠的结果，蛋白质生物标记物就永远不能这样使用。这是第一个同时分析结直肠癌(CRC)及其淋巴结转移中的claudin-1表达的综合研究。通过这样做，我们希望描绘出同一患者的正常、癌变和转移性样本中claudin-1表达变化的完整图景。在此过程中，我们试图为上述明显矛盾找到一些答案，并为结直肠癌中claudin-1的表达提供一些依据。
使用商用人结肠癌细胞组织芯片(目录编号:col991, Biomax, US, Rockville, Maryland)， 99个组织样本/核(包括33个结直肠癌病例，33个一致性淋巴结转移和33个一致性癌旁正常组织，每个病例一个核)，用免疫组化方法分析claudin-1的表达。肿瘤包括结肠腺癌(25例)和直肠腺癌(8例)。我们组织阵列的样本通常在手术切除后15分钟内放入福尔马林。每批组织阵列的两个组织切片进行免疫组化研究，以确保组织中保留的抗原性。我们的样品由直径从1.0毫米到1.5毫米的岩心组成。
兔抗人cladin -1多克隆抗体(rbc - 9219 - p, Labvision, Fremont, California)在抗体稀释液中稀释1:300 (Dako Co.， Mississauga, ON, Canada)，并使用亲和素生物素过氧化物酶法(vecastatin Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories, Burlingame, California)，应用于5 um厚的福尔玛固定、石蜡包埋组织标本切片。免疫组化(IHC)染色在室温下手工进行。阴性对照，忽略一抗。对正常皮肤的单独阳性对照进行试验优化和运行验证。
半定量评估Claudin-1染色强度，分级如下:弱(不存在或微弱存在，0到1)=染色强度低于正常皮肤，温和的(2) =染色与正常皮肤相似强大的(3) =染色强度高于正常皮肤。
所有组织，正常对照，癌旁组织或恶性组织，与正常皮肤染色进行比较。仅用细胞膜免疫反应性进行评价。虽然记录了细胞质和细胞核中claudin-1的表达，但仅凭其存在并不意味着任何差异治疗。免疫染色数量评估如下:0、0个细胞阳性，1、小于25%的细胞阳性，2、25% ~ 50%的细胞阳性，3、50% ~ 75%的细胞阳性，4、大于75%的细胞阳性。所有评估均由两位调查员(A.O.和RN)独立完成，然后共同商定最终评分。
患者的中位年龄为58岁(范围从20到79岁)。该小组由10名女性和23名男性组成。肿瘤分级为I级(2例)、II级(21例)、III级(7例)、IV级(3例)。包括癌旁正常组织的核心。在结直肠癌的淋巴结转移(D-2)和直肠癌的癌旁正常出现的组织(J-3)中未报告IHC染色结果，因为这两例中都缺少组织。
在我们研究的大多数高分化结直肠癌(CRC)病例中，Claudin-1的表达主要是膜性的(图1A)，尽管在其中一些病例中也可见微弱到强烈的细胞质和核染色(图1B)。总体而言，16/33例结直肠癌表达claudin-1，其中13例为II级结直肠癌(13/21)，1例为I级结直肠癌(1/2)，2例为III级结直肠癌(2/7)，0例为IV级结直肠癌(0/3)。低分化CRCs (III和IV级)大多为阴性(图1C)。33个淋巴结中有4(4)个淋巴结表达claudin-1(图1D)。4个淋巴结均为表达claudin-1的肿瘤转移灶。4个淋巴结的划分如下:1个II级转移性结直肠癌claudin1阳性，2个III级转移性结直肠癌claudin1阳性，1个I级转移性结直肠癌claudin1阳性。癌旁正常组织中无(0/33)表达claudin-1(图1E)。虽然结果没有统计学意义，可能是由于样本量小，但值得进一步研究。结直肠癌及转移病例的详细染色结果见表1。
表1。括号中红色的数字是肿瘤的等级
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图1 a。结直肠癌(CRC)的代表性切片，分化良好的区域表现为膜样的claudin-1蛋白染色，而分化较差的区域为阴性
图1 b。CRC表现为异质性形态，高分化区域以claudin-1表达突出，低分化区域无生物标志物表达。此外，在肿瘤分化良好的区域，除了膜性表达外，还有局灶性、强细胞质和核的claudin-1表达。
图1 c。低分化的CRC中缺少claudin-1表达。
图1 d。癌旁正常结肠粘膜的代表性切片，无claudin-1表达。
黑色的数字是从0到3的IHC强度评分(第一个数字)，第二个数字是从0到4的阳性细胞数量。
在我们的研究中，染色评分和肿瘤分级之间存在明显的联系，分化良好至中等的肿瘤/区域(I级和II级)表达强染色(图1A和1B)，而分化较差的肿瘤(III级和IV级)为阴性(图1C)。部分肿瘤形态异质性，呈I/II级和III/IV级混合区。有趣的是，表达该标记的分化较好的区域，而分化较差的区域沉默(图1A和1B)。
此外，表达最高的肿瘤(I级和II级)也显示局灶性、弱到强的细胞质和核claudin-1染色，除了发现的膜性染色(图1B)。
表1总结了癌旁、正常结肠或直肠黏膜的切片染色。几乎所有癌旁正常结直肠粘膜切片均无染色(0，无染色，低于正常皮肤，图1D)。其他研究也得出了类似的结果et al。[24]仅报道了4/16表达非常弱claudin-1的正常结肠黏膜病例。其余正常结肠黏膜切片(12切片)claudin-1阴性。Dhawanet al。和古板的et al。[12,15]报道结肠直肠癌患者正常结肠黏膜无claudin-1表达。
这是第一个同时报道和分析claudin-1在crc及其淋巴结转移中的表达的研究。与其他研究[12,15,22,24]一致，我们的研究确实显示，与正常结肠黏膜相比，结直肠癌中的claudin-1表达增加。这种过表达在50%的病例中可见(16/33)。我们首次报道了大多数结直肠转移瘤失去了claudin-1[12]的表达。CRC淋巴结转移中，共有16例(75%)失去了claudin-1的表达。第三，claudin-1在低级别、分化良好的肿瘤中更容易过表达，62%(62%)的II级CRCs过表达claudin-1, 29%的III级CRCs过表达claudin-1, IV级CRCs中表达为0。在所有原发肿瘤claudin-1阴性的CRC转移灶中均未见claudin-1的表达。
claudin-1在CRC发展和进展中的作用可以总结如下。claudin-1的明显过表达导致细胞旁间隙的通透性和渗漏性增加，TJ结构[26]明显紊乱。这可以从钌红[26]细胞旁渗透性的增加中看出。TJs的通透性增加是上皮性肿瘤的促进事件[27,28]。其次，Claudin-1是与B-catenin密切相关的基因之一，B-catenin介导致癌Wnt/ -catenin转导通路[12]。第三，claudin-1，以及claudin- 3和-5，被证明可以促进pro-MMP2，由此claudin在细胞表面招募mmp以达到较高的病灶浓度，并最终激活pro_MMP2[13]。
为什么在蛋白质研究中claudin-1的表达变为阴性或丢失，而在基因组表达分析工具中没有;也许基因组表达分析工具的灵敏度远远超过蛋白质分析。导致上述结果的另一个原因是，早期的研究依赖于大样本采样，许多研究报告了其样本[29]中claudin-1的异质性染色模式，这一事实证明了这一点。这种使用大样本的方法，通常包括正常的良性细胞和肿瘤细胞，将倾向于掩盖肿瘤和正常上皮[24]中mRNA和蛋白质表达的变化。由于激光显微解剖能够选择性地解剖感兴趣的细胞;基因和蛋白质组的精确表达分析现在是可行的，重点是活组织活检。我们的样本来自存活的、非坏死的区域，组织学评估证实了这一点。另一方面，其他作者认为，他们观察到的claudin-1水平下降是使用IHC或Western blot的结果，而不是mRNA表达研究[16]。在我们看来，如果证明claudin-1的实际半衰期很短，这是可能的。据了解，由于蛋白质的半衰期短，定量实时聚合酶链式反应(QRT)的结果很可能与蛋白质研究结果不一致。 So here we would like to emphasize the need for further studies exploring the half-life of claudin-1 protein.
版权所有OAT。版权所有虽然我们同意claudin的丢失和由此产生的细胞运动性和侵袭性的增加在致癌过程中起作用[16,30];我们还认为，这种表达缺失是由相关蛋白的早期过表达引起的。有研究报道结肠腺瘤细胞中claudin-1[31]表达增加。结合在I级和II级中claudin-1表达增加以及在更高级的级别中claudin-1表达减少的结果[8,15,24和本研究]，以及我们在转移性淋巴结病变中claudin-1表达缺失的研究结果，所有这些都表明，该蛋白的过表达是CRC发展的早期事件，对于下一步，即通过基质金属蛋白酶(MMPs)系统的激活侵袭底层组织是必要的。一旦侵袭完成，claudin-1的表达就消失了，这在我们的淋巴结转移病灶研究中很明显。我们在这项研究中的发现与之前在口腔鳞状细胞癌[32]上所做的工作相似，在那里我们很清楚，claudin-1的表达是一种“强化”机制，即鳞状细胞癌原位细胞经历claudin-1表达的增加，随后基底膜的入侵。一旦入侵完成，claudin-1的表达就会消失。转移性黑色素瘤也是如此。科恩et al。[33]报告原发性黑素瘤中claudin-1表达与Clark水平/Breslow浸润深度之间有很强的相关性，而转移性黑素瘤在绝大多数病例中没有claudin-1表达。宫颈瘤变也是如此。Claudin-1的表达随着病变从正常到低级别鳞状上皮内病变到高级别上皮内病变的进展而逐渐增加，然后在浸润性癌中消失[34,35]。
综上所述，结直肠癌中claudin-1过表达似乎是肿瘤侵袭的前奏，一旦侵袭完成，肿瘤细胞在大多数情况下会失去该表达。因此，我们在此建议使用claudin-1染色包括原位癌(CIS)病变和发育不良腺瘤性息肉以及结肠中的浸润性/转移性病变。
总之，在本研究中，我们发现约50%的结直肠癌中claudin-1蛋白过表达，75%的结直肠癌淋巴结转移性CRC病变中claudin-1表达缺失，且在高分化和低分化肿瘤中claudin-1表达存在差异。在低分化和转移性肿瘤中，claudin-1的过度表达和最终丢失可能对CRC的诊断和预后有帮助。我们对claudin-1在上皮肿瘤发生中的确切功能和作用的理解正在增加，并且在肿瘤条件的诊断和预测中应用我们的研究结果具有重要的潜力。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年6月1日
录用日期:2015年6月19日
出版日期:2015年6月22日
©2015 Al Kattan W.这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可条款发布，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Al Kattan W, Ouban A, Nawab R, Al- obaid O(2015)结直肠癌及其转移中claudin-1表达的表征和分析:一项初步研究。整合分子医学2:DOI: 10.15761/ im .1000148。
沙特阿拉伯利雅得，11416,Al Sulaimaniah区，Dabab街，Xenel大楼，Alfaisal大学医学院病理学系，电话:+966566029107
电子邮件:aouban@alfaisal.edu
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图1 a。结直肠癌(CRC)的代表性切片，分化良好的区域表现为膜样的claudin-1蛋白染色，而分化较差的区域为阴性
图1 b。CRC表现为异质性形态，高分化区域以claudin-1表达突出，低分化区域无生物标志物表达。此外，在肿瘤分化良好的区域，除了膜性表达外，还有局灶性、强细胞质和核的claudin-1表达。
图1 c。低分化的CRC中缺少claudin-1表达。
图1 d。癌旁正常结肠粘膜的代表性切片，无claudin-1表达。
