日本圣玛丽安娜大学医学院心血管外科
临床蛋白质组学与分子医学，圣玛丽安娜大学医学院，日本
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疾病生物标志物分析和分子调控，圣玛丽安娜大学医学院，日本
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DOI: 10.15761 / IMM.1000248
我们之前报道了主动脉瓣狭窄(AS)患者主动脉瓣中富含亮氨酸蛋白多糖(slrp)之一的lumican的异常糖基化。扩大研究范围，我们在这里描述了AS瓣膜中富含脯氨酸/精氨酸末端富含亮氨酸重复蛋白(PRELP)、decorin和biglycan的其他slrp。具体地说，在8例AS患者的主动脉瓣中取样了增厚和钙化(AS- c)区域和明显非增厚和非钙化(AS- n)区域。然后比较PGNase去除n -糖基化和未去除n -糖基化的3个分子在AS-C和AS-N区的数量。结果发现，与As - n区相比，As - c区含有中量和/或低量n -糖基化的PRELP数量减少。与AS-N区相比，AS-C区含糖胺聚糖(GAG)和n -链寡糖的decorin数量均减少。此外，与AS-N区相比，AS-C区含有GAG和n -连接寡糖的biglycan数量减少，而不含GAG的biglycan数量增加。这里检测到的这三种slrp的这些定量和定性变化可能与主动脉瓣AS变化的进展有关。
主动脉瓣狭窄(AS)是最常见的心血管疾病之一，主要由退行性改变和钙化引起。AS的发病率随年龄增长而增加。宏观上，主动脉瓣不规则区域可见增厚和钙化。这种变化逐渐进展，导致瓣膜口变窄，从而引起胸痛、呼吸困难[1]等各种症状。人们普遍认为AS的发展经过脂质积累、炎症和钙化三个过程[2-5]。这些过程将瓣膜间质细胞转化为成骨细胞，导致瓣膜组织钙化[6-7]。然而，确切的病理生理学仍有待阐明。
主动脉瓣含有丰富的细胞外基质。主动脉瓣ECM的主要成分是胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖[8]。pg的特征是一个核心蛋白，其上有一个磺化糖胺聚糖(GAG)和低聚糖共价连接的侧链[9]。pg作为ECM[9]的水合剂、稳定剂和空间填充剂。
我们之前报道过lumican，一种属于小型富亮氨酸蛋白多糖(slrp)的PG，与相同AS瓣膜[10]明显非增厚和非钙化区域相比，在增厚和钙化区域糖基化不足。slrp是一组富含亮氨酸重复序列(LRR)超家族的成员，其特征是在N-和C-两端有一个中央LRR结构域，其两侧是保守的半胱氨酸基序[11-13]。到目前为止，已经报道了10多个slrp。slrp被认为通过与纤原性胶原蛋白[14]相互作用和保护胶原原纤维免受蛋白水解损伤[11]形成胶原组织框架。slrp也被报道参与调节组织炎症和钙化[15-17]。因此，我们推测lumican的异常糖基化可能参与了AS主动脉瓣增厚和钙化的发展。基于这些背景，我们在此研究了其他slrp在增厚和钙化区域与明显非增厚和非钙化区域相比是否表现出定量和/或质的差异，重点研究了三种slrp，即富含脯氨酸/精氨酸末端富含亮氨酸重复蛋白(PRELP)、biglycan和decorin。
本研究纳入了9例AS患者。在治疗性主动脉瓣置换术中获得主动脉瓣样本。所有样本均获得书面知情同意。本研究得到了圣玛丽安娜大学医学院伦理委员会的批准。9个AS瓣叶中的一个被用于图1的摄影展示。其余8个样本进行分析(3男5女，平均68.8岁，43-80岁)，8个样本中有6个与我们之前的研究[10]相同。
在8个AS主动脉瓣叶中，分别抽取增厚钙化区(AS- c)和明显非增厚钙化区(AS- n)。分别对瓣膜组织样本进行蛋白质提取(图1)。具体来说，样本在磷酸盐缓冲盐水中洗涤以消除血液污染物，然后使用HG30均质机(日立Koki株式公司，东京)在细胞裂解缓冲液(7 M尿素，2 M硫脲，4% 3-[(3-胆胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐)中切碎并均质。冷冻解冻5次，4℃离心30分钟。收集含有提取蛋白的上清液，在-80°C保存，直到使用。提取的部分蛋白经肽:n -糖苷酶F (PNGase F, Sigma, MO, USA)以每mg蛋白50单位PNGase F的比例在37℃下处理3小时去糖基化，然后进行western blot。
凝胶电泳进行如上[18]所述。简单地说，在一维凝胶电泳中，蛋白质样品在还原条件下用12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。分离的蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝化纤维素膜上。在二维凝胶电泳中，使用pH值为3.0-11.0的凝胶进行等电聚焦(IEF)。用12.5% SDS-PAGE进一步分离ief分离的蛋白。用2DE分离的蛋白转移到PVDF膜或尼龙膜上。然后对膜进行WB处理。在需要时，在WB前用荧光染料(SYPRO Ruby, Invitrogen Co.， CA, USA)对膜进行染色。
WB也按照前面描述的[18]进行。简单地说，将膜与人类PRELP (abcam, Cambridge, UK)、Decorin (abcam)、Biglycan (abcam)抗体反应1小时。然后清洗膜，并与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔IgG抗体(Dako，丹麦)反应1小时。洗涤后，结合抗体用3,3 ' -二氨基联苯胺，四盐酸(Dojin，熊本，日本)或ECL select (GE Healthcare)检测。用图像分析仪测量了检测波段的强度。
统计学意义用Student 's计算t以及。的值p< 0.05为差异有统计学意义。
我们分别从同一主动脉瓣的增厚和钙化(AS- c)区域和明显非增厚和非钙化(AS- n)区域的组织样本进行采样，这9例患者均为AS患者。主动脉瓣取样的代表性照片如图1所示。然后，我们使用8个样品(其中一个用于图1中的照片展示)从定量和定性两个方面对PRELP、decorin和biglycan进行了表征。作为定性分析，我们研究了分子的糖基化条件。
图1所示。从同一瓣膜的AS-C区和AS-N区制备主动脉瓣组织样本。
我们通过1D-WB研究了PRELP在AS-C区和AS-N区蛋白样品中的表达。结果，在8例As患者的相同瓣膜中，检测到PRELP为分子量(MWs)约为60-70 kDa的宽频带(图2 (a)左)。通过对AS-C和AS-N样品中PRELP的定量比较，发现AS-C区与AS-N区相比，PRELP的含量有所下降(p=0.02，图2 (a)右)。
然后我们研究了为什么PRELP分子显示如此宽的带。由于已知PRELP具有糖基化，我们通过PNGase处理去除了蛋白样品的n -糖基化，之后我们同样通过1d - wb检测了PRELP。结果，没有检测到宽的PRELP带，而是检测到MW为~50kDa的锐带(图2 (b)左)。这说明PRELP分子具有不同程度的n -糖基化。为了进一步证实这一点，我们用2D-WB检测了PRELP分子。如图2(b)右所示，PRELP分子被检测到至少有13个点，其中MW越高的点p越低我．当我们检测到PNGase去除n -糖基化后的PRELP分子时，检测到的是单个点而不是多个PRELP点(图2(b)右)。由此可见，13个PRELP位点的存在，表明有13种不同n -糖基化程度的PRELP分子。这一结果证实了主动脉瓣组织含有不同的n -糖基化。
然后研究高糖基化的PRELP和低糖基化的PRELP是否降低。具体而言，在1D-WB结果中，我们将PRELP的宽频带划分为大小相同的3个部分(高、中、低MW-PRELP)，如图2 (c)所示，然后比较这3个区域在as - c和as - n区域的强度比。结果表明，高MW-PRELP在As - c和As - n区域的数量没有显著差异，但与As - n区域相比，As - c区域中中等和低MW-PRELP的数量有所减少，如图2 (c)所示。同样，我们测量了2D-WB中13个PRELP点的强度(图2 (d))， 4个点的mw相对较低，p较高我s显示与AS-N区域相比，AS-C区域的强度降低(图2(d))。这些结果与1D-WB的结果一致。
图2。AS主动脉瓣AS- c区和AS- n区PRELP分析。
(a)用12.5% SDS-PAGE分离2.5 mg瓣膜蛋白样品，用PVDF膜、兔抗人PRELP抗体(x 1000)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 5000)和ECL Select系统(左)进行WB检测PRELP。在AS-C区和AS-N区比较检测到的PRELP波段的强度(右)。
(b)用15% SDS-PAGE分离PNGase处理过或未处理过的瓣膜蛋白样品，用WB检测PRELP，使用硝化纤维素膜、兔抗人PRELP抗体(x 200)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 1000)和3,3’-四盐酸二氨基联苯胺(DAB)。AS3 AS-N样本的代表性结果如图所示(左)。M;标记。同样，用2D凝胶电泳分离PNGase处理或未处理的瓣膜蛋白样品，并用WB检测PRELP，使用PVDF膜、兔抗人PRELP抗体(x 1000)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 5000)和ECL Select系统(右)。给出了AS8 AS-C样品的代表性结果。
(c)将(a)中所示的PRELP宽频带分为3个大小相同的部分(高、中、低MW-PRELP)。然后比较AS-C区和AS-N区3个区域的强度。
(d)用2D凝胶电泳分离PNGase处理前后的70 mg样品，然后用硝化纤维素膜兔抗人PRELP抗体(x 200)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 1000)和DAB(左)进行WB检测PRELP。测量了13个PRELP光斑的强度。给出了AS-C样品中光斑的相对平均强度。as - n样品中斑点的平均强度定义为1.0(右)。分析了4个样品(AS1, AS2, AS7和AS8)的数量足以进行2D-WB。＊p< 0.05
我们的结果表明，在AS-C区，含有中低量n -糖基化的PRELP数量减少。
其次，我们用1D-WB对AS瓣膜内的decorin进行了表征。我们检测到两个带装饰蛋白。上部主带的mw约为90 ~ 130 kDa，下部主带的mw约为48 kDa(图3 (a)上部)。如图3 (a)左下方所示，As - c区域的decorin总强度明显低于As - n区域。这种下降是由于MWs为90-130 kDa的decorin的减少(图3 (a)中下)，因为MWs为~48 kDa的decorin的强度在两个区域之间没有显著差异(图3 (a)右下)。
由于已知的decorin具有N-或o -连接的糖基化，我们从糖基化的角度对90-130kDa和48 kDa的decorin进行了表征。我们用PNGase处理去除主动脉瓣蛋白的n -糖基化，然后用同样的1D-WB检测装饰蛋白。结果，48 kDa的decorin将其MW降低到约40 kDa(图3 (b))。由于预测成熟的decorin核心蛋白的分子量为36.3 kDa[19-20]，因此我们认为40kda条带是decorin的核心蛋白。低分子量的装饰蛋白被认为是n -糖基化形式的装饰蛋白。另一方面，高MW-decorin (90-130 kDa)的MW也减少了约10 kDa(图3(b))。MWs的减少也被认为是由于n -糖基化的去除。因此，高分子量(90 ~ 130 kDa)的decorin的主要修饰不是n -糖基化，而是o -糖基化。我们得出结论，90-130 kDa同时具有n -糖基化和o -糖基化的decorin在AS-C区比AS-N区减少。
图3。AS-C和-N区装饰蛋白的比较。
(a)用12.5% SDS-PAGE分离2.5 mg瓣膜蛋白样品，用PVDF膜、兔抗人装饰蛋白抗体(x 1000)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 5000)和ECL Select系统(上)进行WB检测。在AS-C和AS-N区域(左下)比较了大约90-130 kDa波段和50 kDa波段的总强度。分别比较AS-C和AS-N区(分别为中下和右下)约90-130 kDa和50 kDa波段的强度。
(b)用15% SDS-PAGE分离PNGase处理前后的瓣膜蛋白样品，用硝化纤维素膜、兔抗人装饰蛋白抗体(x 100)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 2000)和DAB进行WB检测。给出了AS8 AS-C样品的代表性结果。
最后，我们比较了biglycan在AS阀中的应用。在1D-WB中，检测到biglycan为宽频带，MWs为80-120kDa(高MW-biglycan)和40kDa(低MW-biglycan)，如图4(a)-左上所示。与AS-N区域相比，AS-C区域的biglycan总量没有明显差异(图4(a)上部)。然而，与AS-N区相比，AS-C区高MW-biglycan与低MW-biglycan的比值有所下降(图4(a)中下和右图)。为了研究高、低MW-biglycan的差异，我们用PNGase处理biglycan去除n -糖基化。如图4(b)所示，低MW-biglycan进一步将其MW从40kDa降低到约35 kDa。这个新出现的35kDa条带被认为是biglycan的核心蛋白，因为预测成熟的biglycan核心蛋白的分子量为38.0 kDa[20-21]。另一方面，高MW-biglycan将其MW从80-120kDa下降到大约70-110 kDa。由于已知biglycan具有N或o链糖基化，我们的数据表明，高和低MW-biglycan分子都具有N-糖基化，但只有高MW-biglycan分子具有o -糖基化。总的来说，与AS-N区相比，AS-C区含有o -和n -链糖基化的biglycan减少，而只有n -链糖基化的biglycan增加。
图4。AS-C和AS-N区域的biglycan比较。
(a)用12.5% SDS-PAGE分离阀门蛋白样品(2.5 mg)，用PVDF膜、兔抗人biglycan抗体(x 1000)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 2000)和ECL Select系统(上)进行WB检测。*箭头所指的条带不认为是biglycan，因为在阴性对照中也检测到了这些条带(数据未显示)。
(b)经PNGase处理或不经PNGase处理的瓣膜蛋白样品(5 mg)用15% SDS-PAGE分离，用硝化纤维素膜、兔抗人biglycan抗体(x 500)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 1000)和DAB进行WB检测。AS5的AS-N样本的代表性结果显示。
我们在这里描述了AS瓣膜中PRELP、decorin和biglycan的三个slrp。AS-C区域的三个slrp与AS-N区域的slrp在数量和/或质量上都存在差异。
我们首先发现，在AS-C区，含有中量和/或低量n -糖基化的PRELP的数量减少。据报道，PRELP具有多种功能。从结构上看，PRELP已被证实可将基底膜固定在结缔组织[22]上。在炎症方面，有报道称PRELP可抑制补体膜攻击复合物C5b-9[23]的形成。有报道称，补体系统在动脉粥样硬化病变中被激活，该激活与动脉粥样硬化的发病机制密切相关[24-27]。AS瓣膜中补体系统的激活也有报道。C5b-9复合物已经在早期AS瓣膜中发现，复合物的沉积在晚期狭窄瓣膜[28]中增加。C3aR和C5aR在狭窄瓣膜[28]中强烈表达。如上所述，结合这些报道和我们的结果，n -糖基化降低的PRELP可能通过失去对C5b-9复合物形成的抑制来促进补体激活。需要进一步的研究来澄清这一点。
接下来，我们在这里展示了90-130 kDa同时具有n -糖基化和o -糖基化的decorin在AS-C区域比AS-N区域减少。Decorin在其N端区域具有一个N-或o -连接的硫酸软骨素(CS)/硫酸皮聚糖(DS)链和多个N-连接的低聚糖[29]。Decorin最初被认为是ECM的一个结构成分，但被发现在炎症、钙化和细胞增殖等多方面发挥作用[30]。从钙化的角度来看，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP-9)是ECM降解和骨矿化的关键成分之一[31,32]。据报道，MMP-9在AS瓣膜和腹主动脉瘤中增加[33,34]。此外，MMP-9被认为参与骨外矿化[35,36]。根据这些报道，MMP-9可能参与了AS瓣膜的钙化过程。最近，decorin被报道可以抑制血管平滑肌细胞[33]中MMP-9的分泌。因此，decorin的生理作用之一可能是通过抑制MMP-9来保护主动脉瓣免受ECM降解和矿化。在此检测到的高糖基化的decorin的减少可能失去保护功能，导致AS瓣膜的矿化进展。
最后，我们发现了biglycan的异常糖基化。Biglycan由一个42 kDa的核心蛋白，两条由DS或CS组成的GAG链和n -连接的低聚糖[37]组成。Biglycan通过核心蛋白和GAG链[38]与胶原原纤维相互作用。人关节软骨[39]中无GAG的Biglycan随年龄增加而增加。Biglycan被认为在骨矿化中发挥作用[40,41]。此外，biglycan被认为可以促进先天免疫，增加促炎细胞因子[42]的产生。在我们的研究中，加GAG的biglycan与不加GAG的biglycan在AS-C区比例降低。虽然糖基化在矿化和炎症中的作用尚不清楚，但糖基化降低的大多糖可能促进AS瓣膜的炎症和矿化。需要进一步的研究来澄清这一点。
我们在此报道了在AS瓣膜钙化和增厚区域，PRELP、decorin和biglycan的数量和糖基化情况发生改变。这些改变可能从炎症和矿化方面促进主动脉瓣AS改变。
一个也没有。
伊凡痛风
伦敦大学学院
研究文章
收稿日期:2016年10月15日
录用日期:2016年10月26日
出版日期:2016年10月28日
©2016 Furukawa H.这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可条款发布，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
古川H, Chikada M，横山MK, Arito M，黑川MS等。(2016)主动脉瓣狭窄患者主动脉瓣中富含亮氨酸的小蛋白多糖的表征。整合摩尔医学3:DOI: 10.15761/ im .1000248。
圣玛丽安娜大学医学院心血管外科，川崎，神奈川，宫面，216-8511，电话:+81-44-977-8111
图1所示。从同一瓣膜的AS-C区和AS-N区制备主动脉瓣组织样本。
图2。AS主动脉瓣AS- c区和AS- n区PRELP分析。
(a)用12.5% SDS-PAGE分离2.5 mg瓣膜蛋白样品，用PVDF膜、兔抗人PRELP抗体(x 1000)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 5000)和ECL Select系统(左)进行WB检测PRELP。在AS-C区和AS-N区比较检测到的PRELP波段的强度(右)。
(b)用15% SDS-PAGE分离PNGase处理过或未处理过的瓣膜蛋白样品，用WB检测PRELP，使用硝化纤维素膜、兔抗人PRELP抗体(x 200)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 1000)和3,3’-四盐酸二氨基联苯胺(DAB)。AS3 AS-N样本的代表性结果如图所示(左)。M;标记。同样，用2D凝胶电泳分离PNGase处理或未处理的瓣膜蛋白样品，并用WB检测PRELP，使用PVDF膜、兔抗人PRELP抗体(x 1000)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 5000)和ECL Select系统(右)。给出了AS8 AS-C样品的代表性结果。
(c)将(a)中所示的PRELP宽频带分为3个大小相同的部分(高、中、低MW-PRELP)。然后比较AS-C区和AS-N区3个区域的强度。
(d)用2D凝胶电泳分离PNGase处理前后的70 mg样品，然后用硝化纤维素膜兔抗人PRELP抗体(x 200)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 1000)和DAB(左)进行WB检测PRELP。测量了13个PRELP光斑的强度。给出了AS-C样品中光斑的相对平均强度。as - n样品中斑点的平均强度定义为1.0(右)。分析了4个样品(AS1, AS2, AS7和AS8)的数量足以进行2D-WB。＊p< 0.05
图3。AS-C和-N区装饰蛋白的比较。
(a)用12.5% SDS-PAGE分离2.5 mg瓣膜蛋白样品，用PVDF膜、兔抗人装饰蛋白抗体(x 1000)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 5000)和ECL Select系统(上)进行WB检测。在AS-C和AS-N区域(左下)比较了大约90-130 kDa波段和50 kDa波段的总强度。分别比较AS-C和AS-N区(分别为中下和右下)约90-130 kDa和50 kDa波段的强度。
(b)用15% SDS-PAGE分离PNGase处理前后的瓣膜蛋白样品，用硝化纤维素膜、兔抗人装饰蛋白抗体(x 100)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 2000)和DAB进行WB检测。给出了AS8 AS-C样品的代表性结果。
图4。AS-C和AS-N区域的biglycan比较。
(a)用12.5% SDS-PAGE分离阀门蛋白样品(2.5 mg)，用PVDF膜、兔抗人biglycan抗体(x 1000)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 2000)和ECL Select系统(上)进行WB检测。*箭头所指的条带不认为是biglycan，因为在阴性对照中也检测到了这些条带(数据未显示)。
(b)经PNGase处理或不经PNGase处理的瓣膜蛋白样品(5 mg)用15% SDS-PAGE分离，用硝化纤维素膜、兔抗人biglycan抗体(x 500)、hrp标记的山羊抗兔IgG (x 1000)和DAB进行WB检测。AS5的AS-N样本的代表性结果显示。
