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摘要

我们设计了一种肿瘤组织诊断的彩色成像方法，并评价了其临床可行性和意义。基于光动力学诊断(PDD)理论，通过识别癌细胞在蓝光照射下发出的特定红粉色荧光，在显微镜下检测癌症。用氨基乙酰丙酸(ALA)处理组织学标本。采用三种不同类型的肿瘤细胞系作为肿瘤模型。在在体外，我们确定了含有ala的培养基溶液处理的每个肿瘤细胞在蓝光下发射红色荧光。在临床研究中，外科手术中刚采集的癌症患者标本直接浸泡在含有ala的培养基中，37℃培养一定分钟。然后在蓝光下显微镜观察。辐射红粉色荧光的样品被认为是癌症。用1% ALA/细胞培养基在37℃条件下处理30min，每个模型细胞均发出粉红色荧光。在相同条件下，未活细胞和/或凋亡细胞无荧光。用ala培养基溶液处理的临床收获的肿瘤区域也显示出粉红色荧光。我们可以在30-60分钟内鉴别出样品的恶性变化，而无需准备冰冻切片进行快速诊断。这种简单的方法是一种快速诊断癌症的临床有用工具。

关键字

组织诊断，红粉色荧光，氨基乙酰丙酸，快速癌症诊断

简介

氨基乙酰丙酸(ALA)是一种内源性氨基酸。与细胞结合的ALA被合成成原orphirin IX (PPIX)。在癌细胞中，PPIX合成明显增强，而PPIX代谢途径被抑制。PPIX因此在癌细胞中积累。PPIX在蓝光照射下发出红色荧光。基于这一现象，光动力诊断(PDD)已被临床应用[1,2]。根据这一原理，我们在实验室中使用我们的简单工具进行了一种新的光动力组织诊断(PDHD)。

材料和方法

可见的蓝光:SOLARFORCE, L2P，香港。氨基乙酰丙酸(ALA): Wako Pure Chemical Industries, Ltd日本大阪。HCT 116细胞和HeLa细胞:理研BRC细胞库，筑波，日本。HFSKF-II细胞:日本仙台东北大学生物医学研究细胞资源中心。RPMI 1640细胞培养基(RPMI): Life Technologies Corp, Grand Island, NY, USA。火腿F-12中型(火腿F-12): Gibco by life technologies，美国。胎牛血清(FBS): Gibco，由生命技术，美国。使用的其他试剂为分析级。

首先，我们在体外证实了ALA-PDD现象。1 x 10⁴在t12.5塑料瓶中单独培养模型细胞。在达到汇合后，将瓶中的培养基全部更换为含1% ala的培养基重新培养24小时。然后，在暗室的蓝光下对每一个细胞进行显微镜检查，观察红粉色荧光。我们可以清楚地识别红色荧光的时间是在重新孵育后的0、15、30和60分钟周期性测量的。

接下来，我们尝试对手术切除的结直肠癌患者标本进行临床组织诊断。将刚采集的样品立即浸入1% ALA/RPMI培养基中，37℃孵育30分钟，然后在暗室蓝光下显微镜下观察。同一外科标本的正常部分作为对照。

结果

1% ALA/培养液在37℃条件下培养30-60 min，体外培养的模型细胞明显发出淡红色荧光(图1)。非活细胞和/或凋亡细胞无荧光。

术中采集的肿瘤标本用同样的方法处理也能发出类似的荧光，用放大镜观察就能很容易地确定为癌症(图2)。未使用ALA溶液处理的肿瘤标本没有红色荧光(图3)。我们的ALA- pdhd结果与常规用苏木精和伊红(H&E)染色的病理检查结果一致。

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图1所示。在模型细胞系中发出荧光。在1% ALA/RPMI培养液中孵育30分钟后出现淡红色荧光。不仅癌细胞(HCT 116和HeLa)，增殖的良性细胞(HFSKF-II)也显示出类似的荧光。(放大X 100)。

图2。用1% ALA/RPMI混合溶液处理癌区和非癌区30min。在蓝光下，癌区特异性发出红色荧光。非癌区无荧光。两种样品在白光下都不发出荧光。(放大X 10)。

图3。单独用RPMI培养基溶液处理30分钟的癌症和非癌症区域的发现。在蓝光下未观察到荧光。(放大X 10)。

讨论

我们的新彩色成像方法为快速诊断提供了临床有效的方法。术中标本采集后30-60分钟内可诊断为癌或非癌。

这种新方法可以识别癌症或非癌症，而不能区分标本的病理类型。因此，我们认为这是常规冰冻切片快速诊断的辅助工具，尤其值得在癌症患者的术中转移淋巴结检测中进行微创手术。

在制备用于ALA诊断的组织学样本时，标本应该是可行的，因为从ALA到原卟啉IX (PPIX)的生物代谢途径对这种光化学诊断是绝对必要的。因此，手术采集的标本应在短时间内用ala培养基处理。为保持手术标本的细胞活力，我们使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行细胞培养液，在细胞培养液中加入1% ALA/生理盐水溶液作为光敏剂，体积比为1:1。制备的混合物的pH值为ph5。据报道，ALA溶液在pH值接近5时是最稳定的，当pH值高于7时，它变得不稳定。推荐在pH为5的氯化钠溶液中加入0.1-2%的ALA作为临床使用[4]。由于我们自己的1% ALA-RPMI混合溶液的pH值为5，因此适合制备这种方法的处理方法。

在这方面，我们比较了用1% ALA/RPMI溶液处理的临床标本和同时用1% ALA/生理盐水处理的临床标本的荧光强度。在孵育30分钟的情况下，观察到两者之间的荧光强度没有显著差异。我们认为RPMI溶液用于制备PDHD，孵育30分钟对荧光的外观几乎没有影响。而在孵育60分钟的情况下，ALA/RPMI溶液处理的细胞比ALA溶液处理的细胞显示更清晰的红色荧光。由于荧光强度代表了细胞的活力，因此我们认为，与单独使用ALA溶液相比，使用RPMI溶液处理可以更稳定地维持手术中收集的组织的术后活力。含rpmi的培养基溶液在保持细胞活力方面起着重要作用。根据这些数据，我们建议PDHD法应在30- 60min内用含rmi的ALA溶液处理术中标本。

在常规的术中快速诊断中，需要准备临床标本的冷冻切片。为准备这种组织学可检测切片，通常需要30-60分钟。此外，有经验的病理学家总是被要求用冷冻切片进行精确诊断，以避免在复杂的制备过程中由于处理不当而导致材料变性爆发后的误诊。

在PDHD中，只有检测到红色荧光才能发现肿瘤病变。我们认为组织病理经验对PDHD的诊断并不总是必要的。

我们实际上可以用这种方法检测胆道癌。在本例中，根据我们的常规方法，从经PTCD管获得的不足10 mL胆汁中获得的沉淀用3 mL 1% ALA-RPMI混合溶液处理30分钟。将处理过的材料离心制备涂片样品，在蓝光下显微镜下观察。我们可以在处理过的切片中发现红粉色荧光，术前可以诊断为胆道癌[5]。切片也用帕氏染色处理，发现是癌症。经常规细胞学检查，本病例诊断为胆道炎症伴非典型性退变细胞。常规涂片检查未见进一步病理发现。

在这种情况下进行的程序可以称为光动力细胞诊断(PDCD)。PDCD对腹水和/或胸腔积液中的癌症也有快速诊断的前景。PDHD和PDCD都值得在临床快速诊断中使用ALA和rmi培养基进一步研究。

参考文献

1. Navone NM, Polo CF, Frisardi AL, Andrade NE, Battle AM(1990)人类乳腺癌模拟“体外”研究中血红素的生物合成和一些血红素酶活性水平。Int J物化学22日:1407 - 1411。［Crossref］
2. Baumgartner R, Fisslinger H, Jocham D, Lenz H, Ruprecht L，等(1987)早期癌症内镜检测的荧光成像装置的仪器和实验研究。Photochem Photobiol46: 759 - 763。［Crossref］
3. 加德马尔，莫莫J, Scheie，等。(2002)5-氨基乙酰丙酸在溶液中的稳定性。J Photochem PhotobiolB 67: 187 - 193。［Crossref］
4. De Blois AW, Grouls RJ, Acherman EW, Wijdeven WJ(2002)光动力治疗用5-氨基乙酰丙酸腔内注射稳定溶液的研制。激光医学科学17: 208 - 215。［Crossref］
5. Ito N, Sugitachi A, Takahashi M, Makabe K, Kanno S，等(2013)胆道癌的光动力学诊断与术前化疗。癌症化疗40: 1641 - 1643。［Crossref］