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摘要

背景:为了了解系统性红斑狼疮(SLE)的病理生理学，我们试图用靶向蛋白质组学方法识别外周血单个核细胞(PBMCs)的细胞表面(CS)分子谱。

方法:从5名SLE患者和5名健康供体(HLs)制备的PBMCs进行活细胞生物素化。然后用二维荧光电泳(2D-DIGE)对生物素化的CS蛋白进行分析。质谱分析发现SLE和HL组间蛋白点的强度不同。

结果:2D-DIGE共检测到468个蛋白点，其中151个(32.3%)蛋白点在两组间强度差异显著。在151个点中，两组间有137个(29.3%)点>±1.5倍的强度差异，44个(9.4%)点>±2.5倍的强度差异。在44个位点中，有17个位点的蛋白质被鉴定出来。

结论:据我们所知，我们的研究首次全面调查了SLE中PBMCs的CS蛋白谱。我们发现SLE患者的PBMCs的CS蛋白谱与hl患者的有很大的不同。我们的研究将为系统性红斑狼疮的病理生理学研究提供一种新的策略。

关键字

表面蛋白，系统性红斑狼疮，蛋白质组学

简介

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种系统性自身免疫性疾病的原型，其特征是产生各种自身抗体。SLE患者在肾脏、皮肤、中枢神经系统等多个器官均有临床表现，在实验室检查中也表现出各种异常，如抗核抗体(ANAs)和血清补体水平低。由于SLE患者的临床特征和异常差异很大，因此SLE的诊断参照修订后的狼疮1997[1]分类标准或更近的系统性红斑狼疮国际合作临床分类标准2012[2,3]。只有部分自身抗体如SS-A抗体被证实会对器官造成损害[4,5]。然而，其余大部分自身抗体在临床特征中的直接作用尚未阐明。

尽管尚未完全了解SLE自身抗体产生的机制，但B细胞和T细胞都被认为参与了自身抗体的产生[6,7]。例如，记忆B细胞的扩张已经被证实，因此，SLE被认为以B细胞激活和分化[8]的频繁周期为特征。T细胞被认为异常地辅助自反应B细胞的激活和分化。据报道，Th17群体的扩大和T细胞受体(TCR)生理和TCRs下游信号通路的扰动。然而，T细胞和B细胞改变的分子机制尚未完全了解。

一般来说，任何类型的细胞表面都有各种各样的分子。细胞表面(CS)分子接收胞外信息介导胞内信号转导。因此，CS分子的异常表达或翻译后修饰可能与SLE的病理生理直接相关。荧光激活细胞分选法(FACS)是一种分析CS蛋白的方法。事实上，FACS对SLE中PBMCs的CS蛋白异常有多种发现[10-13]。然而，FACS只能分析有限种类的CS蛋白，无法全面分析CS蛋白。基于这些背景，我们在这里尝试使用靶向蛋白质组学、活细胞生物素化和二维荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)相结合的方法综合分析CS蛋白谱，以了解SLE的病理生理。

材料和方法

临床标本

使用Ficoll-Paque Plus (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)通过密度梯度离心从5名SLE患者和5名健康献血者(HLs)的血液样本中分离出pbmc。所有样本均获得书面知情同意，本研究得到圣玛丽安娜大学医学院伦理委员会的批准。

用生物素标记法分离CS蛋白

根据制造商的说明，使用市售的CS蛋白分离试剂盒(赛默飞世尔科学公司，Waltham, MA, USA)分离CS蛋白。简单地说，活PBMCs的CS蛋白用硫- nhs - s - s -生物素进行生物素化，硫- nhs - s - s -生物素是一种细胞不渗透和可裂解的生物素化试剂。生物素化后，PBMCs被裂解，生物素化的CS蛋白被亲和素珠(Thermo Scientific NeutrAvidin琼脂糖树脂)回收。然后用还原试剂将S-S键裂解，使CS蛋白从亲和素结合的生物素中释放出来。

二维荧光差分凝胶电泳

分离的CS蛋白用2D-DIGE进行分离。按照前面[14]描述的方式执行2D-DIGE。每个CS蛋白样本都用菁染料5 (Cy5, Cy dye DIGE饱和染料;通用电气医疗保健，白金汉郡，英国)。将每种样品混合等量，制成内控“标准样品”。然后用氰基染料3 (Cy3, GE Healthcare)标记标准样品。然后将每个cy5标记的蛋白样品(2.5µg)与cy3标记的标准样品(2.5µg)混合。该混合物应用于等电聚焦(IEF)凝胶(pH值3-11,GE Healthcare)。随后，用IEF分离的蛋白通过12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进一步分离。使用图像分析仪(Typhoon 9400 Imager, GE Healthcare)对分离的蛋白质进行扫描。 Intensity of the separated protein spots was quantified by Progenesis program (PerkinElmer, MA, US). To compare protein spot intensity between the SLE patient group and the HL group, Cy5-fluorescent intensity of each protein spot was normalized by Cy3-fluorescent intensity of the identical spot. The normalized Cy5-intensity was used for the comparison.

蛋白质识别

从2D凝胶中切除的感兴趣的蛋白质点被胰蛋白酶消化，如前所述[15]。将制备的多肽进行基质辅助激光解吸电离飞行时间/飞行时间质谱分析(MALDI-TOF/TOF-MS) (Ultraflex, Bruker Daltonics Bremen, Germany)。对确定的肽质量进行编译，以便使用Mascot软件程序(Matrix Science, London, UK)对国家生物技术信息中心(NCBI)的蛋白质数据库进行搜索。

结果

2D-DIGE分析SLE和HL患者PBMCs的CS蛋白

为了确定PBMCs的sles特异性CS蛋白谱，我们利用细胞表面生物素化分离的CS蛋白的2D-DIGE，综合比较了5名SLE患者和5名HLs患者PBMCs的CS蛋白。5例SLE患者的临床特征见表1。

表1 .临床资料登记的SLE患者

*显示抽样当日的结果和药物。

结果，共检测到468个确定蛋白点(图1A)。然后我们比较了SLE患者组和HL组之间的468个蛋白点的强度。我们发现，在468个蛋白点中，有151个(32.3%)蛋白点的强度在两组间有显著差异(表2)，其中137个(29.3%)蛋白点的强度在两组间有>±1.5倍的差异。此外，44个点(9.4%)显示>±2.5倍的强度差异(表2)。本研究显示，与hl患者相比，SLE患者PBMCs的CS蛋白谱严重倾斜。

图1所示。．2D-DIGE分析SLE和HLs患者PBMCs CS蛋白。A)从5例SLE患者和5例HLs患者的PBMCs中提取CS蛋白，然后进行2D-DIGE。每个标记有Cy5的蛋白质样品和标记有Cy3的内部对照“标准样品”混合并应用于IEF凝胶上。蛋白样品在pH为24 cm的3-11非线性IEF条带上分离，用12.5% SDS-PAGE进行分离。结果显示SLE (Cy5, SLE1-5)和HLs (Cy5, HL1-5)患者。MW,分子量。B) 44个在SLE患者组和HL组之间显示明显不同强度的蛋白点进行MS/MS分析，以识别蛋白质。44个蛋白点中有17个蛋白被鉴定出来，如表3所示。二维凝胶上的17个点的位置用带点号的圆表示。

表2。在SLE患者组和HL组之间显示明显不同强度的蛋白点数量

在SLE患者组和HL组之间具有显著强度差异的蛋白鉴定:对44个强度差异为>±2.5倍的蛋白质点进行MS/MS分析，以确定蛋白质名称(图1B)。结果，在44个位点中，有17个位点的蛋白质被鉴定出来，如表3所示。

表3。从SLE患者组和HL组之间强度有显著差异的蛋白斑点中进行蛋白鉴别。用胰蛋白酶在凝胶内消化后从17个蛋白点中回收的多肽进行MALDI-TOF/TOF-MS分析。兆瓦;分子量,p我;等电点,盖子;激光离解

17个确定的斑点中有13个在SLE患者组比HL组表现出更高的强度。髓母细胞素的649号。cyclin-L1的899,no。白细胞弹性蛋白酶抑制剂485号。dna定向RNA聚合酶II亚基RPB11-b2, no. 897。POTE锚定结构域家族成员F的编号为900，肌动蛋白的编号为651、582、734、913、560、914、637和621)(图2中上部)。其余4个点在SLE组的强度低于HL组。减数分裂1号阻滞蛋白的421号。异质核核糖核蛋白H的376号。391的丙酮酸激酶PKM和no。 356 of tubulin alpha-4A chain) (Figure 2, lower).

图2。具有代表性的蛋白点，在SLE患者组和HL组之间表现出明显不同的强度。

显示了899、649和391号的代表性结果。利用Progenesis程序(左图)构建蛋白质斑点(编号为649、899、391)的三维图像。比较SLE患者组和HL组(右图)斑的归一化强度。HL组归一化蛋白点强度的平均值定义为1.0。条形图表示每组归一化蛋白点强度的平均值。

讨论

我们的研究显示，SLE患者中PBMCs的CS蛋白谱与hl患者有很大的不同。在不同表达的CS蛋白中，从17个蛋白斑点中鉴定出10个蛋白。

一般用FACS对CS蛋白进行分析。在FACS中，用荧光偶联靶特异性抗体标记活细胞的靶向CS蛋白，然后测量结合荧光的强度。FACS是分析CS蛋白的一种非常有效的工具。事实上，FACS常被用于SLE的病理生理学分析[10-13]。然而，FACS只能分析有限种类的CS蛋白(通常1-4种，最多8种)。FACS无法全面分析CS蛋白。相比之下，本文采用的CS蛋白生物素标记结合2D-DIGE可以全面检测和定量CS蛋白。这是我们方法的一大优点。与FACS不同的另一点是，与生物素化的CS蛋白结合的蛋白质也与CS蛋白本身隔离在一起，即使它们本身不存在于细胞膜外。在这方面，这里使用的方法也足以分析蛋白质从细胞质或细胞核到质膜的易位，反之亦然。 Our strategy and FACS should be differently used depending on aims of studies.

我们的研究显示，大约三分之一(32.3%)的检测到的蛋白斑点在SLE患者组和HL组之间表达有显著差异。这表明SLE患者PBMCs的CS蛋白谱非常广泛地倾斜。在44个强度差异较大(>±2.5倍)的蛋白点中，鉴定出17个蛋白点，由10种蛋白质组成。

首先,没有现货。649在SLE患者组的表达强度是HL组的5.85倍，被鉴定为成髓细胞素。它也被称为蛋白酶3 (PR3)。PR3是一种丝氨酸蛋白酶，主要位于中性粒细胞和嗜酸性粒细胞[16]颗粒中。PR3也被认为是抗中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)[17]的靶点。据报道，与HL[18]相比，SLE患者单核细胞中PR3的mRNA增加。此外，有报道称，在SLE患者的中性粒细胞和anca相关血管炎患者的单核细胞中，TNF-￣刺激可增加细胞表面PR3的数量[19,20]。此外，据报道，血清TNF-水平在SLE[21]患者中升高。结合我们的数据和这些报道，在SLE患者的PBMCs中，PR3的表达及其向质膜部分的易位都将增加。增加在SLE发病机制中的作用有待进一步研究。

第二,发现没有。899在SLE患者组的表达强度是HL组的2,53~ 3.24倍，被鉴定为细胞周期蛋白L1。细胞周期蛋白L1通常位于细胞质中。有报道称cyclin L1参与了mRNA的剪接[22,23]。据报道，在SLE患者的T细胞中，TCR zeta链剪接异常[24,25]。我们的数据和他们的报告表明，cyclin L1的易位可能参与了SLE患者T细胞的异常剪接。这一点今后也应该进行详细的研究。

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第三，将560、582、621、637、651、734、913、914号斑分配给肌动蛋白家族成员，其强度在SLE患者组比HL组高2.53~3.24倍。多个斑点的存在表明肌动蛋白的不同亚型和/或不同的翻译后修饰。由于肌动蛋白是细胞骨架的重要组成部分，SLE患者的PBMCs会改变细胞骨架的结构，反映淋巴细胞的功能异常。肌动蛋白改变与淋巴细胞功能异常之间的关系有待进一步研究。

结论

总之，据我们所知，我们的研究首次全面调查了SLE患者PBMCs的CS蛋白谱。我们发现，SLE患者PBMCs的CS蛋白谱与hl的CS蛋白谱有很大的不同。我们的研究将为系统性红斑狼疮的病理生理学研究提供一种新的策略。

确认

我们感谢横山MK女士的技术支持。

的利益冲突

作者无利益冲突。

参考文献

1. Tan EM, Cohen AS, Fries JF, Masi AT, McShane DJ等(1982)1982年修订的系统性红斑狼疮分类标准。关节炎感冒25日:1271 - 1277。(Crossref)
2. Yu C, Gershwin ME, Chang C(2014)系统性红斑狼疮诊断标准述评。J Autoimmun49:三分。(Crossref)
3. Petri M, Orbai AM, Alarcon GS, Gordon C, Merrill JT，等(2012)系统性红斑狼疮国际合作临床分类标准的推导和验证。关节炎感冒64: 2677 - 2686。(Crossref)
4. Miranda-Carús ME, Askanase AD, Clancy RM, Di Donato F, Chou TM，等(2000)抗ssa /Ro和抗ssb /La自身抗体结合凋亡的胎儿心肌细胞表面，促进巨噬细胞分泌tnf - α。J Immunol．165: 5345 - 5351。
5. Cozzani E, agnooletti AF, Pappalardo F, Schiavetti I, Torino A, et al.(2016)女性结缔组织疾病患者中抗ro /SSA和抗p200抗体的高发证实了妊娠期间筛查先天性心脏传导阻滞相关自身抗体的重要性。拱北京医学Res．308: 139 - 143。
6. Mak A, Kow NY(2014)系统性红斑狼疮中T细胞的病理。J Immunol Res2014: 419029。(Crossref)
7. Shlomchik MJ, Craft JE, Mamula MJ(2001)从T到B再回来:系统自身免疫性疾病的正反馈。Nat Immunol牧师1: 147 - 153。(Crossref)
8. Anolik JH (2013) B细胞生物学:对系统性红斑狼疮治疗的意义。红斑狼疮22日:342 - 349。(Crossref)
9. Kow NY, Mak A.(2013)系统性红斑狼疮的共刺激途径:生理学和潜在的治疗操作。中国Dev Immunol16: 245928。
10. Hase K, Tani K, Shimizu T, Ohmoto Y, Matsushima K，等(2001)活动性系统性红斑狼疮中CCR4表达增高。J Leukoc70: 749 - 755。(Crossref)
11. 王晓燕，王晓燕，王晓燕，等。(2005)早期系统性硬化症患者外周血单核细胞肿瘤坏死因子α转化酶表达上调的研究．安大黄说64: 1165 - 1173。
12. 中野生，森本生，铃木J，野泽K, Amano H，等。(2008)活动性系统性红斑狼疮中B细胞toll样受体9产生致病自身抗体的作用。风湿病学(牛津)47:145 - 149。
13. Herrada AA, Llanos C, Mackern-Oberti JP, Carreño LJ, Henriquez C，等(2012)系统性红斑狼疮患者单核细胞血红素加氧酶1表达改变。免疫学136: 414 - 424。
14. Onodera H, Arito M, Sato T, Ito H, Hashimoto T，等。(2013)蛋白质组学方法揭示依达拉avone对人脑微血管内皮细胞的新作用。大脑Res1534: 87 - 94。(Crossref)
15. Fujisawa H, Ohtani-Kaneko R, Naiki M, Okada T, Masuko K，等。(2008)蛋白质组学分析发现神经元可塑性相关蛋白翻译后修饰与痛觉过敏的关系。蛋白质组学8: 1706 - 1719。
16. Kettritz R(2016)中性粒细胞的中性丝氨酸蛋白酶。Immunol牧师273: 232 - 248。(Crossref)
17. van der Geld YM, Limburg PC, Kallenberg CG(2001)蛋白酶3，韦格纳氏自体抗原:从基因到抗原。J Leukoc69: 177 - 190。(Crossref)
18. Ohlsson S, Hellmark T, Pieters K, Sturfelt G, Wieslander J，等。(2005)小血管炎中蛋白酶3基因单核细胞转录增高。中国Exp Immunol141: 174 - 182。(Crossref)
19. van Rossum AP, Huitema MG, Stegeman CA, Bijl M, de Leeuw K，等(2007)膜蛋白酶3表达的标准化评估。anca相关血管炎的分析及对照。安大黄说66: 1350 - 1355。
20. Hattar K, Bickenbach A, Csernok E, Rosseau S, Grandel U, et al. (2002) Wegener肉芽肿病:抗蛋白酶3抗体诱导单核细胞细胞因子和前列腺素释放-自分泌细胞激活作用。J Leukoc71: 996 - 1004。(Crossref)
21. 韦克尔·切，Mangale D, Franek BS, Kelly JA, Kumabe M，等。(2012)系统性红斑狼疮患者肿瘤坏死因子α水平的大规模分析。关节炎感冒64: 2947 - 2952。
22. 陈海红，王永春，范美梅(2006)参与选择性剪接调控的CDK12/cyclin L1复合体的鉴定和表征。摩尔细胞生物26日:2736 - 2745。
23. Loyer P, Trembley JH, Grenet JA, Busson A, Corlu A，等(2008)细胞周期蛋白L1和L2与CDK11相互作用的表征及剪接因子:细胞周期蛋白L异构体对剪接位点选择的影响。J临床生物化学．283: 7721 - 7732。
24. Tsuzaka K, Onoda N, Yoshimoto K, Setoyama Y, Suzuki K等人(2002)系统性红斑狼疮患者的外周血T细胞中主要产生具有选择性剪接3’非转译区域的T细胞受体ζ mRNA。国防部Rheumatol12: 167 - 173。
25. Tsuzaka K, Nozaki K, Kumazawa C, Shiraishi K, Setoyama Y，等(2006)在系统性红斑狼疮患者外周血T细胞中观察到tcr3 mRNA剪接变异形式。施普林格Semin Immun28日:185 - 193。