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摘要

MicroRNAs (miRNAs)是一类广泛的小型非编码rna，通过调节基因表达对许多生物过程的发育、分化、生长和代谢产生深远影响。3'UTR的多态性改变了几个人类基因中的miRNA结合位点，从而影响了转录后产生的蛋白质的功能。研究Cyclin D1 (CCND1) G/C1722 SNP (rs678653)位于该基因3'UTR上，利用miRDB 3.0和5.0版本进行miRNA结合位点的预测。

我们能够预测人类3'UTR上的16个miRNA/miRNA靶点CCND1基因。在16个预测的miRNA中，有11个是新的miRNA /miRNA靶点CCND1．但在人3'UTR的DNA/RNA序列上未预测到miRNA靶位点CCND1包含SNP (rs678653)的基因。因此，根据这种算法预测，SNP (rs678653)不太可能具有功能重要性。需要进一步的实验分析来验证这一计算预测CCND1变体。

关键字

miRNA, SNP, CCND1, miRDB, microsniper, rs678653, 3'UTR, miRNA靶点，microRNA, cyclin D1

缩写

MicroRNA:微;SNP:单核苷酸多态性;CCND1: Cyclin D1, UTR:非翻译区;SVM:支持向量机

简介

MicroRNAs (miRNAs)已经成为一类重要的短内源性非编码rna, 18-25个核苷酸(nt)，作为基因表达的转录后调控因子。miRNAs被认为通过调控基因表达参与多种生物过程。在各种物种中已经发现了许多mirna，还有更多的mirna有待检测。

遵循miRNA的第一个文档秀丽隐杆线虫大约20年前李写的et al。迄今为止，已有4000多个不同的mirna在脊椎动物、无脊椎动物和植物中被注释，许多与推定基因对应的mirna也已被识别。这一发现为我们理解基因表达是如何被调节引入了一个全新的维度。

在细胞的细胞质中，miRNA通常以18- 25nt长的成熟形式存在。mirna最初被转录为较长的初级转录物(称为pri- mirna)[4]的一部分。Pri-miRNA的长度约为100 bp，并形成茎环折叠结构。它被RNAse III核糖核酸进一步加工成一个约22 bp大小的成熟miRNA (MIR)，并结合到mRNA上的特定靶位点进行转录后抑制。动物MIR结合的关键区域是“种子”区(MIR 5 '端nt 2-7)，通过沃森-克里克配对[5]优先与mRNA 3'UTR的靶位点结合。

与多基因疾病(如癌症)相关的snp可以创建、破坏或修改miRNA结合位点。全基因组生物信息学分析预测，约64%的转录SNPs作为目标SNPs，可以通过>90%[6]修改(增加/减少)假定的miRNA:: mRNA双工的结合能。

以前的一些报告显示，miRNA签名正在成为一种潜在的生物标志物。许多miRNAs已经被发现与某些类型的癌症(7、8)。这些类型的研究主要集中在包括甲状腺乳头状癌和结直肠癌在内的癌症[7,9,10]，从而显示了探索miRNAs在肿瘤学领域的功能的重要性。

人们已经做了各种努力来评估SNPs在假定的miRNA靶位点上对癌症易感的影响，例如:乳腺癌[6,11]非小细胞肺癌[12]，食管癌[13]，胃癌[14]，结肠癌[15]，头颈癌[16]，胶质瘤[17]，肝细胞癌[18]，甲状腺癌[19]，前列腺癌[20]，肾细胞癌[21]和膀胱癌[22]。Nicoloso开展了病例对照人群研究et al。[6]，以评估目标SNPs对乳腺癌易感性的影响，并观察到rs799917-BRCA1和rs334348-TGFR1的种系发生率在不同乳腺癌风险人群中存在显著差异。

miRNA靶位点的预测有多种数据库，包括miRDB。它是由圣路易斯华盛顿大学医学院放射肿瘤系王晓伟实验室开发的[23,24]。这是一个用于预测动物miRNA靶位点和功能注释的在线数据库。所有的靶点都通过一种新的生物信息学工具进行预测，该工具是通过支持向量机(SVM)分析受miRNAs影响的数千个基因而开发的。与miRNA靶标结合相关的共同特征已经被识别出来，并用于预测miRNA靶标。miRDB宿主预测了包括人、小鼠、大鼠、狗和鸡在内的五个物种的miRNA靶点。

Cyclin D1属于核心细胞周期机制，常在人类癌症中过表达。细胞周期蛋白D1在正常发育和肿瘤发生中的全部功能目前尚不清楚。

以前我们曾报道过一种潜在的保护作用CCND1印度人群宫颈癌易感性3'UTR SNP G/C1722 (rs678653)姜et al。[27]最近发表了一篇关于靶向miRNAs的作用的报告CCND1，但他们没有包括任何关联CCND1SNP在他们的研究中。

据我们所知，目前还没有关于……功能重要性的报告CCND1基因多态性rs678653位于3'UTR上。

已经确定的事实是，当snp发生在3 ' utr中时，它们通过改变聚腺苷酸化、蛋白:mRNA和miRNA::mRNA调控相互作用[6]来干扰mRNA的稳定性和翻译。人们还发现，人类蛋白质编码基因的3 ' utr(例如CCND1)含有丰富的miRNA靶位点。因此，在这个背景下，我们假设G-C核苷酸交换在3'UTRCCND1SNP rs678653产生的基因会影响miRNAs的3 '结合位点。

结果与讨论

预测新的miRNA/miRNA靶点

我们能够预测人类3'UTR上16个miRNA靶点CCND1miRDB 3.0版本。在16个miRNAs中，有11个(miR-1237, miR-548e, miR-522, miR-942, miR-548g, miR-891b, miR-1283, miR-495和miR-1281, miR-147, miR-584f)是我们在本研究中首次发现的新miRNAs，而5个miRNAs (miR-374, miR-548d, miR-219-1-3p, miR-340和miR-511)被发现与TargetScan和miRanda数据库重叠。基于2009年4月发布的数据库对3'UTR的假定绑定CCND1在16个预测miRNAs中，hsa-miR-147得分最高(87)，计算得分范围为87-53(表1)。

表1。CCND1(基因595)被miRDB中的16个miRNAs靶向

目标细节(种子位置)	目标等级	目标分数	microrna的名字	microrna的Seq1
1617年,2294年	1	87	hsa - mir - 147	GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC
1338年,1375年	2	84	hsa - mir - 548 d - 3 p	CAAAAACCACAGUUUCUUUUGC
One hundred.	3.	79	hsa - mir - 1237	UCCUUCUGCUCCGUCCCCCAG
309	4	78	hsa - mir - 219 - 1 - 3 - p	AGAGUUGAGUCUGGACGUCCCG
1623年,3149年	5	73	hsa - mir - 511	GUGUCUUUUGCUCUGCAGUCA
1074年,2050年	6	71	hsa - mir - 548 e	AAAAACUGAGACUACUUUUGCA
460	7	71	hsa - mir - 522	AAAAUGGUUCCCUUUAGAGUGU
833	8	69	hsa - mir - 942	UCUUCUCUGUUUUGGCCAUGUG
1554	9	67	hsa - mir - 548 g	AAAACUGUAAUUACUUUUGUAC
1074年,2050年	10	64	hsa - mir - 548 f	AAAAACUGUAAUUACUUUU
2477	11	63	hsa - mir - 891 b	UGCAACUUACCUGAGUCAUUGA
885年,2131年	12	58	hsa - mir - 1283	UCUACAAAGGAAAGCGCUUUCU
585	13	55	hsa - mir - 340	UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU
605年,2501年	14	54	hsa - mir - 374 a	UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG
2632	15	53	hsa - mir - 495	AAACAAACAUGGUGCACUUCUU
370	16	50	hsa - mir - 1281	UCGCCUCCUCCUCUCCC

注意:¹miRNA种子区:7个核苷酸长。NM_053056

通过使用2014年8月发布的miRDB v.5，我们发现CCND1该基因被115个miRNAs靶向(数据未显示)。

在包含G/C1722 SNP (rs678653)的DNA/RNA序列上，两个版本的数据库都没有预测到miRNA靶点。两个miRNAs (hsa-miR-374a和hsa-miR-942)位于SNP rs678653位点的侧翼序列上。

通过在输出窗口中选择详细信息选项，显示相应miRNAs的结果。在这里，我们只展示了hsa-miR-147的信息，它在靶标列表中得分最高(87)，（补充数据1)。同样，我们获得了每个预测miRNA的详细信息，它们各自的种子区域(长7 nt)位于的3'UTR序列上CCND1(补充数据2)。

CCND1 SNP (rs678653)的功能效应预测

基于MicroSNiPer数据库的计算预测结果显示，该方法缺乏功能性效果CCND1位于3'UTR (rs678653)上的多态性。这一观察结果与miRDB的发现一致，并可以从算法结果中进一步加强，算法结果显示，在围绕多态位点的核苷酸序列上，没有任何假定的miRNA/miRNA靶位点CCND1．

在大约20年前发现miRNA之后，它们的潜在作用在不同的疾病中被显示出来，因此进一步推动了miRNA的研究[2]。miRNAs通过与3'UTR结合并抑制翻译，是mRNA表达的重要转录后调控因子[28,29]。改变真正靶位点的SNP可能具有生物学意义[5]。由于3'UTR正在发展成为病理学的热点，因此，miRNA靶位点的snp可能有助于区分各种癌症和疾病[30]。

目前，miRNA靶位点的预测可以免费使用各种数据库。大多数都是基于在线搜索，而很少需要下载才能访问。

我们选择miRDB系统进行miRNA靶位点的预测参考CCND1，因为这是一个最新的数据库免费提供作为在线搜索和他们的设计策略是基于成熟的mirna不像大多数其他平台依赖于前mirna。因为直接参与靶标下调[23]的是成熟的miRNA，而不是它们的前体。

通过比较PicTar、miRanda、TargetScan等其他流行数据库的miRDB输出，miRanda和TargetScan中通常只有两种miRNAs (miR-374和miR-548)。而在miRanda和miRDB计划中发现了三个miRNAs (miR-219-1-3p, miR-340和miR-511)重叠。然而，令人惊讶的是，在miRDB和PicTar之间没有发现一个miRNA可普遍预测(表2，图1)。

表2。的比较CCND1从不同数据库预测的mirna

数据库名称	mirna的名称
	mir - 374	mir - 548 d	mir - 219 - 1 - 3 - p	mir - 340	mir - 511
miRDB1	u	u	u	u	u
米兰达2	X	X	u	u	u
TargetScan3.	u	u	X	X	X
miRDB在本研究中预测的新miRNAs列表
miR-147 miR-1237 miR-548e miR-522 miR-942 miR-548g
miR-548f miR-891b miR-1283 miR-495 miR-1281

注意:¹目前的研究(http://mirdb.org),^2、3-江等，2009，(http://www.targetscan.org) (http://microrna.org)

图1所示。从三个不同的数据库(miRDB/miRanda/TargetScan)预测的CCND1 miRNAs的重叠

然而，很少有研究对靶点的预测给出一些启示CCND1基因。第一个验证周期蛋白D1的预测mirna的系统方法是由Jiang完成的et al。[27]。通过使用报告系统，该研究小组表明，只有一小部分预测的miRNA/mRNA相互作用在实验上是有效的CCND1．

到目前为止，还没有人努力研究CCND1这种情况下的3'UTR SNP。据我们所知，这是应用miRDB v.3/v的第一次尝试。5数据库[31]上预测miRNA的靶位点CCND1与位于基因3'UTR上的SNP (rs678653)相关。在一项研究中提到，预测的miRNA结合位点的多态性可能是有害的;它们是人类疾病[32]的因果变异的候选者。在我们之前的研究中，我们证明了这一点CCND1基因SNP (rs678653)可能对印度人群[26]的宫颈癌发展具有一定的保护作用。

我们的计算分析表明，SNP (rs678653)位于3'UTR上CCND1没有为表1中列出的16种预测miRNAs中的任何一个提供目标位点。然而，仅靠计算算法并不能得出可靠的结论。因此，为了证实这一生物信息学数据，有必要进一步的实验验证，以研究的事实功能相关性CCND1SNP (rs678653)转录后的。

总的来说，这个基于算法计算证据的集合预测CCND1变异提示该基因3'UTR位点上的SNP (rs678653)不太可能具有功能重要性。这可能是处理的作用的报告有限的原因之一CCND1SNP (rs678653)与SNP (rs9344) G870A相比，后者因其功能意义而在各种癌症和其他疾病中被广泛研究。

结论

在本研究中，我们通过miRDB鉴定了11个新的miRNA /miRNA靶位点，但在人类3'UTR的DNA/RNA序列上未发现miRNA结合位点CCND1包含SNP (rs678653)的基因。因此，该多态性似乎没有任何功能影响，但仍然需要进一步的实验分析来验证这一计算预测CCND1从文献中可以明显看出，预测和验证的miRNA靶位点的比例非常低。

方法

利用miRDB预测miRNA靶位点

研究假定的人类功能后果CCND1位于该基因3'UTR上的SNP rs678653，利用2009年4月发布的miRDB 3.0版本，利用硅内分析(生物信息学方法)预测miRNA结合位点(http://mirdb.org)，最后更新于2010年8月26日。本研究采用的方法学示意图如图2所示。

图2。方法流程图

miRDB使用MirTarget 2预测工具和miRBase 13.0作为miRNA源。miRDB 3.0版本包含2295个miRNAs，针对5个物种，包括人、小鼠、大鼠、狗和鸡的58,953个独特基因。具体来说，对于智人来说，它有703个miRNAs，靶向16,856个独特的基因。所有预测的mirna和它们的靶位点通过免费的在线数据库进行搜索。miRDB v 3.0显示了一个web查询界面，有两个选项——第一个是miRNA名称，第二个是基因目标。我们使用基因靶点(也就是说,CCND1)作为网页查询，结果按预测目标分数降序显示。

我们还使用最新的miRDB 5.0版本(最后一次修改是在2015年3月10日)进行了分析。

目标分数解读

所有预测目标的目标预测得分都在50到100之间。这些分数由新的计算目标预测算法分配。分数越高，我们对这个预测就越有信心。这就是为什么搜索结果是按预测分数排序。预测分数为>80的预测目标最有可能是真实的。如果评分低于60分，则应谨慎，并建议有其他支持证据。

比较公认的CCND1不同数据库预测的mirna

miRDB的输出结果与其他流行的数据库如PicTar (http://www.pictar.org),米兰达(http://microrna.org)及TargetScan (http://www.targetscan.org)(表2、图1)。

功能效果的预测CCND1SNP (rs678653)

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用于预测功能效果CCND1利用MicroSNiPer软件对该基因3'UTR上16个已知microRNA靶点的SNP (rs678653)进行了计算分析。这是一种基于网络的工具，用于预测miRNA靶位点上单核苷酸变异的功能意义，该工具最近由Barenboim提出et al。[33]。该数据库查询3'-未翻译区域，并预测目标位点内的SNP是否会破坏/消除或增强/创建microRNA结合位点。MicroSNiPer计算这些位点，并实时探索snp的影响。MicroSNiPer免费访问http://cbdb.nimh.nih.gov/microsniper．

确认

作者承认miRDB (http://mirdb.org)及MicroSNiPer (http://cbdb.nimh.nih.gov/microsniper)，用于预测新的miRNAs/miRNA靶点和SNP的功能效应。本研究得到了NICPR (ICMR) Noida的支持。

补充信息

全长3'UTR序列显示的miRNA /miRNA靶位点CCND1作为补充资料，网上有。可用性：miRDB v.3 / v。5database is freely accessible at(http://mirdb.org)．补充资料(1):预测MicroRNA和靶基因的代表性描述
补充资料(2):3' UTR序列显示所有16个miRNAs的预测靶位点CCND1。

公开声明

没有竞争性的经济利益报告。

辅助数据视图

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