看看最近的文章

摘要

活性己糖相关化合物(Active hexose related compound, AHCC)是从香菇菌丝体培养液中分离得到的富含葡聚糖的多糖混合物。包括免疫调节在内的多种生物活性在基础和临床研究中均有报道。这种化合物也被用作癌症的辅助治疗，但还没有研究表明AHCC是否可以通过改变药物代谢酶的表达来改变治疗药物如抗癌药物在肝脏中的代谢。在这里，我们利用DNA芯片评估了ahcc诱导的药物代谢酶基因表达的变化。

将3% AHCC溶液自由提供给ICR小鼠5天，然后切除肝脏，提取总RNA，并使用Genopal进行DNA芯片分析^®代谢芯片(195个基因)和氧化应激芯片(219个基因)代谢芯片识别出8个差异表达基因(DEGs)，其定义为表达量比对照组小鼠至少高出2.0倍。在这些deg中，有2个参与药物代谢的deg轻度上调(CYP3A11，信号强度比[SIR] = 1.15, CYP7A1, SIR = 1.02)。此外，氧化应激芯片鉴定出23个DEGs，其中5个(BCL10、BCL6、ICAM1、MAP3K5和CASP9)表现出非常强的抑制(SIR < -10)。

健康小鼠口服AHCC可改变肝脏中多个基因的表达，包括药物代谢酶的轻微上调和肿瘤坏死因子信号传导和凋亡相关基因的显著抑制。因此，AHCC可以保护肝功能免受抗肿瘤药物的不良作用，如炎症，但对药物代谢影响不大。

关键字

活性己糖相关化合物，细胞凋亡，DNA芯片，代谢酶

介绍

肝脏代谢是影响临床药物吸收、分布、代谢和排泄(ADME)的关键因素，进而影响药物疗效。代谢酶分为两组:第一阶段介导氧化和还原，第二阶段介导偶联[1]。如果这些代谢酶被其他生物活性化合物强烈诱导或抑制，例如在食品、膳食补充剂或辅助治疗中，主要药物吸收和生物利用度可能会发生实质性改变，从而导致药物与药物的不良相互作用。因此，为了评估潜在的相互作用，必须确定食品、膳食补充剂和草药中生物活性化合物对药物代谢酶的影响。

活性己糖相关化合物(AHCC)是在香菇菌丝体培养提取物中发现的一种流行的营养补充剂，已被证明可以改变肝脏药物代谢酶的表达，包括诱导CYP2D6[3]。另外，目前还没有关于AHCC口服后对ADME影响的详细报道。如果多糖是AHCC的主要生物活性成分，那么肝脏功能的改变是可能的，因为许多多糖可以被吸收和运输到肝脏完整。我们使用DNA微阵列综合分析口服AHCC后肝脏的基因表达变化，以评估药物代谢改变的潜力在活的有机体内．

DNA微阵列在疾病诊断、细菌和病毒检测、多态性[4]分析等方面有广泛的应用。由于很难分析所有基因的表达变化及其与生物学功能的可能联系，我们使用聚焦DNA微阵列对目标基因进行了缩小;Genopal^®(三菱人造丝。株式会社日本东京)。每个微阵列包含大约200个功能组内的基因探针，可高可靠性地检测基因表达变化[5-7]。

材料和方法

材料

活性己糖相关化合物(AHCC)粉剂由氨基UP化工提供。并将其溶于蒸馏水中，制成3% (W/V)的原液。

动物

六周大的ICR雄性小鼠购自日本查尔斯河公司(神奈川，日本)。在23±1°C和55±15%的湿度条件下，分别饲养于单独的笼子中，光照-暗循环12小时。适应1周后，将小鼠分为正常组和3% AHCC组，每组5只。正常组可自由接触水，3% AHCC组可自由接触3% AHCC水溶液。实验结束后，用乙醚麻醉处死动物，取肝脏标本进行基因芯片分析。

本研究符合北海道药科大学《实验动物护理和使用指导原则》(1998年出版，2001年和2007年修订)。方案批准号是H27-010。

等离子体分析

在自由接触水或3%水溶液后5天，所有小鼠处死，取血和肝样本。从PST含肝素管(BD Japan Co.， Ltd, Tokyo, Japan)的尾静脉采集血液样本。全血在12,000 rpm离心10分钟，血浆在−80℃保存。血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-Cho)、葡萄糖(GLU)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)水平采用日本富士医药株式会社(fujifilmedical Co.， Tokyo, Japan) drim - chem 4000化学分析仪测定。

RNA提取

肝脏被解剖并储存在RNAlater中^®解决方案(Thermo Fisher Scientific Inc.， MA, USA)在−80°C下使用7天。使用RNeasy脂质组织迷你试剂盒(Qiagen Co.， Ltd.， Venlo, Netherlands)提取总RNA(每个治疗组n = 2个肝脏)。根据制造商的说明，使用RNA 6000纳米试剂盒(安捷伦技术公司，CA，美国)在2100生物分析仪上评估提取的RNA的质量和数量。

DNA微阵列

从RNA中制备cDNA，根据制造商的说明，使用MessageAmp生物素增强扩增试剂盒(Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan)转录和扩增生物素标记的RNA。使用裂解试剂(Applied Biosystems Japan)将生物素化的扩增RNA (aRNA)片段化，然后在94℃下孵育7.5分钟。添加试剂盒终止液终止裂解反应。

特殊Genopal^®用于DNA微阵列的芯片分别是含有195个基因探针的代谢芯片和含有219个基因探针的氧化应激芯片。代谢芯片检测到的基因包括编码I期细胞色素P450 (CYP)物种和II期谷胱甘肽s -转移酶(GST)亚型的基因。共检测到36个参与药物代谢的基因，如表1所示。

表1。代谢芯片检测到的肝脏药物代谢相关的36个基因列表，用于聚焦DNA芯片分析

CYP(细胞色素P450) CYP1A2、CYP2E1 CYP2C29 CYP2D22 CYP3A11, CYP4A10 CYP4A12A, CYP7A1, CYP27A1 谷胱甘肽s -转移酶 GSTO1, GSTO2 谷胱甘肽s -转移酶 GSTM1基因, GSTM2, GSTM3 GSTM4, GSTM5, GSTM6 GSS(谷胱甘肽合成酶) GSS GSTA(谷胱甘肽S-transferase) GSTA1, GSTA2, GSTA3 GSTA4 谷胱甘肽s -转移酶 问题 谷胱甘肽s -转移酶 GSTT1, GSTT2, GSTT3 GSR(谷胱甘肽还原酶) GSR 谷胱甘肽转移酶 GSTZ1 谷胱甘肽s -转移酶 GSTK1 微粒体谷胱甘肽s转移酶 MGST2, MGST3 GPX(谷胱甘肽过氧化物酶) GPX1, GPX2, GPX3 NDUFS NADH脱氢酶(泛素)Fe-S蛋白8 NDUFS8 转移酶(catechol-O-methyltransferase) COMT1

杂交信号是使用带有多束激发技术的DNA微阵列阅读器获得的(Yokogawa Electric Co.， Tokyo, Japan)。

统计分析

结果以均数±均数标准误差(S.E)表示。血浆化学分析的组平均数通过方差分析和成对学生t检验进行比较。在DNA微阵列分析中，通过信号强度比(SIR, log)测量表达的2.0倍变化₂[采样信号强度/控制信号强度])，解释为微分表达式。

路径分析

将预测的靶基因与注释数据库进行比较。我们基于最新的京都基因和基因组百科全书数据库(KEGG，http://www.genome.jp/kegg）.该分析允许测定显著富集于DEGs[8]的生物途径。

结果

等离子体的生化检查

正常对照组和3% ahcc处理小鼠的血浆TG、T-Cho、GLU、AST和ALT水平无显著变化(表2)。

DNA微阵列代谢芯片

在代谢芯片检测到的195个基因中，有8个表现出显著的(>2倍)表达变化(图1)。其中5个基因表达上调:细胞色素P450家族3，亚家族a，多肽11 (CYP3A11);细胞色素P450家族7亚家族a多肽1 (CYP7A1);磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1，胞质;丝裂原活化蛋白激酶6 (MAPK6);核受体亚家族0,B组，成员2 (Nr0b2)。相反，有3个基因下调:atp结合盒，亚家族C，成员2 (ABCC2);分泌磷蛋白1 (SPP1);和肿瘤坏死因子(TNF)。表3总结了这些deg。

图1所示。聚焦DNA微阵列代谢芯片鉴定的DEGs数量(2.0倍变化)

表2。比较未处理(正常)和3% ahcc处理小鼠的血浆胆固醇、甘油三酯和肝酶

		正常的		3% AHCC
TG (mg / dl)		89.4±3.8		71.4±3.8
T-Cho (mg / dl)		121.2±6.3		110.7±8.2
GLU (mg / dl)		99.3±19.4		106.2±20.8
ALT (IU / l)		29.3±2.7		27.9±8.4
AST (IU / l)		79.1±9.1		71.7±12.6

随机饮水组(正常组)和3% AHCC组(平均±S.E.) 5 d后测定血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-Cho)、葡萄糖(GLU)、谷草转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)。没有显著差异。

表3。代谢芯片在ahcc处理小鼠中表达差异的8个基因的列表

基因符号		基因名字		信号强度比(SIR)
CYP3A11		小家鼠细胞色素P450，家族3，亚家族a，多肽11 (CYP3A11)， mRNA		1.15±0.48
CYP7A1		小家鼠细胞色素P450，家族7亚家族a，多肽1 (CYP7A1)， mRNA		1.02±0.62
PCK1		小家鼠磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1，胞质(PCK1)， mRNA		1.42±0.12
MAPK6		小家鼠有丝分裂原活化蛋白激酶6 (MAPK6)，转录变体1,mRNA		1.14±0.52
NrOb2		小家鼠核受体亚家族0,B组，成员2 (NR0B2)， mRNA		1.68±0.36
ABCC2		小家鼠atp结合盒，亚家族C (CFTR/MRP)，成员2 (ABCC2)， mRNA		-1.18±0.86
SPP1		小家鼠分泌磷蛋白1 (SPP1)， mRNA		-1.80±0.33
肿瘤坏死因子		小家鼠肿瘤坏死因子(TNF)， mRNA		-2.50±0.61

差异表达定义为SIR > 1.0或< 1.0倍变化2.0倍

表1显示了CYP3A11(1.15±0.48)和CYP7A1(1.02±0.62)两个已知的药物代谢相关基因的SIR。代谢芯片检测到的其他34个与药物代谢相关的基因无差异表达(数据未显示)。

DNA微阵列氧化应激芯片

在该芯片检测到的219个基因中，23个被分类为DEG(图2)。图3显示了b细胞淋巴瘤/白血病10 (BCL10)、b细胞淋巴瘤/白血病6 (BCL6)、细胞间粘附分子1 (ICAM1)、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶5 (MAP3K5)和Caspase 9 (CASP9)的信号。在3% AHCC组中均表现出强烈的抑制(SIR <−10)。

图2。在ICR小鼠肝脏中，氧化应激芯片检测到口服3% AHCC(中间和右边通道)下调(绿色)或上调(红色)的基因分层聚类(n = 2)。使用TIGER的MultipleExperiment Viewer v4.0软件分析23个DEGs(2.0倍变化)。

图3。在氧化应激芯片检测到的23个基因中，有5个基因表达强烈下调(SIR < -10)。

图4。来自KEGG数据库的路径分析。根据通路分析，3% AHCC作用下，凋亡(A)和TNF (B)信号通路下调(红领)。

路径分析

根据代谢和氧化应激芯片对表现出强烈抑制(SIR <−2)的基因的KEGG通路分析，两个主要通路被下调:肿瘤坏死因子(TNF)信号和凋亡。

讨论

活性己糖相关化合物在亚洲是一种传统药物，在世界范围内作为一种营养补充剂的使用正在增加。关于AHCC在小鼠和人体内的生物活性和药理作用已有许多报道。据报道，其益处包括预防抗癌药物的不良作用[9,10]、免疫调节[11]、抗流感作用[12]和保护肝细胞[13]。在本研究中，我们发现小鼠自由消耗3% AHCC超过5天，血浆生化指标没有变化，特别是肝毒性指标。这一发现与之前关于AHCC安全性的报道一致，在健康大鼠(单剂量或亚急性毒性)和I期研究[14]的人类受试者中未发现严重毒性或不良反应。此外，AHCC显著抑制了两种主要的细胞毒性途径，TNF信号和凋亡的基因，但对肝脏代谢酶的影响不大。这些表达变化可能部分解释了在以前的研究中观察到的炎症和细胞保护的减少。

DNA微阵列可以用于基因表达的综合分析，但基因表达的变化可能与下游蛋白表达的变化及相关信号转导不平行。尽管如此，TNF-和凋亡相关基因的强大抑制强烈表明，这些途径的破坏是AHCC的细胞保护作用的基础。此外，我们为Genopal的效用提供了证据^®事实上，这些DNA微阵列促进了与特定途径相关的基因的有效功能分析。

本研究使用的代谢芯片包括36个用于检测I期和II期酶的DNA探针，包括多种细胞色素P450 (CYP)物种和谷胱甘肽s -转移酶(GST)家族。其中，AHCC组中仅诱导了两个与药物代谢相关的基因CYP3A11和CYP7A1，且水平相对较小(SIRs均接近+1)。小鼠CYP3A11与人肝脏代谢酶CYP3A5同源，该酶参与免疫抑制剂如他克莫司[15]的代谢，因此是这些药物的疗效和药物-药物相互作用的主要决定因素。已知CYP7A1是将胆固醇分解为胆汁酸[16]的限速酶。然而，我们发现对血浆T-Cho没有显著影响，可能是因为上调幅度不大。这些结果表明，包括AHCC在内的联合治疗的不良事件发生的可能性极小。

此外，我们使用氧化应激芯片(含探针识别219个基因)进行分析，发现5个基因(SIR <−10)被口服AHCC显著抑制(BCL10, BCL6, ICAM1, MAP3K5和CASP9)。BCL10通过NF-κB信号[17]参与TNFα、IL -1β等炎症因子的释放。MAP3K5，也被称为凋亡信号调节激酶1 (ASK1)，已被报道在炎症、氧化应激、肿瘤发生和凋亡[18]中发挥主要作用。AHCC还能抑制Apo-1/CD95 (Fas, SIR =−2.7)(数据未显示)和CASP9，表明它在肝[19]中具有强烈的诱导凋亡抑制作用。ICAM1与血管内皮[20]炎症相关，BCL6参与免疫细胞[21]的分化和相互粘附。

综上所述，这些结果为AHCC的抗炎和肝保护作用提供了可能的分子机制。另一方面，Malletet al。[22]报道TLR2和TLR4作为AHCC配体，提示AHCC可能激活先天免疫。然而，我们发现AHCC也抑制了TLR4下游的ASK1。因此，AHCC对免疫功能的影响可能取决于宿主当前的免疫状态。

致谢

我们感谢Dr. Naoyuki Togawa(三菱丽阳生物设备研究小组)。在研究期间提供了DNA微阵列分析的技术信息。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益

参考

1. Tibbitts J, Canter D, Graff R, Smith A, Khawli LA(2016)影响治疗蛋白ADME特性的关键因素:药物发现和开发中对ADME特性的需求。马伯8(2): 229 - 245。［Crossref］
2. (in Chinese)[陆涛，苏丽丽，季东，顾伟，毛春青(2015)CYP450酶与中药代谢的相互作用及酶活性测定。]中国中药杂志40(18): 3524 - 3529。［Crossref］
3. Mach CM, Fugii H, Wakame K, Smith J(2008)评价活性己糖相关化合物的肝代谢及其与化疗药物相互作用的潜力。J Soc积分6: 105 - 109。(Crossref)
4. Marzancola MG, Sedighi A, Li PC2 (2016) DNA微阵列诊断。方法杂志1368: 161 - 178。(Crossref)
5. 王志强，王志强，王志强，等。(2010)Genopalâ "ⅳ:一种用于聚焦微阵列分析的新型中空纤维阵列。DNA Res17: 369 - 379。(Crossref)
6. Niwa M, Nagai K, Oike H, Kobori M(2009)在重建的人类表皮模型上使用DNA微阵列评估皮肤刺激。生物制药的公牛32: 203 - 208。(Crossref)
7. Motojima H, O Villareal M, Han J, Isoda H(2011)黄烷酸对KU812细胞立即型过敏反应的微阵列分析。Cytotechnology63: 181 - 190。(Crossref)
8. 陈绍良，王志梅，胡佐英，李冰(2015)低剪切应力诱导人脐静脉内皮细胞长链非编码rna的全基因组分析。中国摩尔地中海2: 276 - 289。
9. Yanagimoto H, Satoi S, Yamamoto T, Hirooka S, Yamaki S, et al.(2016)活性己糖相关化合物(AHCC)对不可切除胰腺导管腺癌患者化疗相关不良事件的缓解作用。减轻癌症68(2): 234 - 240。
10. Ito T, Urushima H, Sakaue M, Yukawa S, Honda H, et al.(2014)化疗期间，一种蘑菇产品，活性己糖相关化合物(AHCC)的不良反应减少——化疗期间唾液中HHV-6 DNA水平作为替代生物标志物的重要性。减轻癌症66(3): 377 - 382。
11. Vetvicka V, Vetvickova J1(2014)灰树花(Grifola frondosa)和香菇(香菇)提取物的免疫增强作用。安Transl地中海2: 14。(Crossref)
12. Roman BE, Beli E, Duriancik DM, Gardner EM(2013)短期补充活性己糖相关化合物可提高B型流感疫苗的抗体应答。减轻33: 12 - 17。(Crossref)
13. 田中勇，Ohashi S, Ohtsuki A, Kiyono T, Park EY, et al.(2014)腺苷:活性己糖相关化合物中肝保护成分的鉴定及其对iNOS的抑制机制。一氧化氮40: 75 - 86。
14. Ulbricht C, Brigham A, Bryan JK, Catapang M, Chowdary D, et al.(2013)自然标准研究合作组织对活性己糖相关化合物(AHCC)的循证系统综述。我的饮食10(3): 264 - 308。［Crossref］
15. Nair SS, Sarasamma S, Gracious N, George J, Anish TS, et al. (2015) CYP3A5基因多态性及其对他克莫司血药浓度的影响。Exp中国移植13增刊1:19 7-200。(Crossref)
16. Hebanowska A1(2011)[胆汁酸生物合成调节机制——胆汁酸的自动调节]。Postepy物化学57: 314 - 323。(Crossref)
17. 赵辉，朱敏，杜国刚，赵辉，朱斌，等。(2014)BCL10在DNA损伤反应中调控RNF8/ rnf168介导的泛素化。细胞周期13: 1777 - 1787。(Crossref)
18. 何鹏，曾波，张晓丽，方东东，周晓q2，等。(2016)凋亡信号调节激酶1抑制剂对小鼠肝损伤的保护作用。亚洲太平洋医院9: 283 - 287。(Crossref)
19. Lu EP, McLellan M2, Ding L3, Fulton R2, Mardis ER4, et al. (2014) Caspase-9在小鼠正常造血发育和防止烷基化剂诱导的DNA损伤中是必需的。血124: 3887 - 3895。(Crossref)
20. [樊晓军，赵宏辉，余刚，钟晓莉，姚辉，等(2015)炎症反应在人脑动脉瘤发病中的作用。]麝猫摩尔Res14: 9062 - 9070。(Crossref)
21. Oestreich KJ, Read KA, Gilbertson SE, Hough KP, McDonald PW, et al. (2014) Bcl-6直接抑制糖酵解途径的基因程序。Nat Immunol15: 957 - 964。(Crossref)
22. Mallet JF, Graham É， Ritz BW, Homma K, Matar C(2016)活性己糖相关化合物(AHCC)促进BALB/ C小鼠和初级肠上皮细胞培养中涉及toll样受体TLR-2和TLR-4的肠道免疫反应。欧元J减轻55(1): 139 - 146。［Crossref］