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摘要

Ftibamzone（FBZ）已知对引起生殖器疱疹的单纯疱疹病毒有效，但FBZ的溶解性差降低了其治疗效果。我们研究了各种纳米粒子与FBZ的水溶性配合物，以改善其溶解性并增加其吸收。利用相溶解度技术，我们测量了形成常数（K_1:1和K_1:2)值在室温pH 7缓冲液中。通过将FBZ或FBZ包埋的纳米颗粒溶解在磷酸盐缓冲液中并调整pH至不同的pH范围(2-12)来测定溶解性。然后将溶液平衡24小时，然后使用HPCL进行过滤和分析。采用纳米沉淀法制备纳米颗粒，并用共聚焦显微镜测定纳米颗粒的细胞摄取率。从pH 2到10,FBZ的溶解度没有明显的变化，但我们注意到从pH 10到12,FBZ溶解度迅速增加，FBZ溶解度为950µg/ml。日志D对pH值资料显示,FBZ酸药物从工会组织的特点是主要以低博士FBZ与甲基-β环糊精(mβCD)络合/纳米粒子的溶解度FBZ FBZ相比,虽然络合常数测定K_1:1和K_1:2是7.06 x 10^－３和8.98 x10^－8毫米^－１分别地只有FBZ壳聚糖纳米粒对MDCK细胞有毒性。研究表明，与单独使用FBZ相比，FBZ-PLGA纳米粒可显著提高FBZ的溶解度和吸收，并有望成为治疗生殖器疱疹的有效给药系统。

关键字

ftibamzone，生殖器疱疹，纳米颗粒，单纯疱疹病毒，溶解度

介绍

生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒引起的一种性传播疾病（STD），可能是1型（HSV-1）或2型（HSV-2）[1-5]。大多数生殖器疱疹病例是由2型（HSV-2）引起的。大多数感染单纯疱疹病毒的人不会出现或表现出单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型感染的迹象或症状[2]，当迹象确实出现时，他们通常会在生殖器/直肠和口腔周围出现一个或多个水泡。水泡破裂后会留下压痛性溃疡（溃疡），第一次出现时可能需要两到四周才能愈合。通常情况下，第二次暴发可能出现在第一次暴发后数周或数月，但与第一次暴发相比，其严重程度和时间总是较低。生殖器疱疹主要是通过与感染者的性接触而感染的。感染生殖器疱疹的人在爆发之前不会表现出任何迹象或症状。与生殖器疱疹相关的常见症状可能是全身性的，而有些是局限性的。全身症状包括疼痛、食欲减退、发烧和肌肉疼痛。而通常局限于生殖器区域的局部症状包括水泡，水泡充满液体，需要几天才能愈合。女性的局限性症状通常出现在阴道外阴唇、肛门、大腿和臀部周围，而男性则表现在阴茎、阴囊、大腿和臀部。这些症状也可能伴有阴道分泌物、排尿疼痛和淋巴结肿大。同样重要的是要注意，当一个人被感染时，病毒会在体内长时间处于休眠状态，男性的反复感染和症状比女性轻。生殖器疱疹的临床诊断是通过体检和实验室测试来确认病毒的存在。这些实验室检查包括血液测试、脱氧核糖核酸（DNA）测试和病毒培养[6]。

目前没有可用的治疗方法可以治愈生殖器疱疹,但是有药物可以抑制疫情期间症状的严重程度和持续时间,加速损伤愈合的时间和停止病毒传染,最终有助于减少感染另一个人的机会。这些抗病毒药物包括泛昔洛韦、万昔洛韦和阿昔洛韦及相关的核苷酸类似物[2,5]。然而，对这些药物的耐药性和毒性的出现使它们对HSV感染免疫缺陷个体的治疗无效，并强调需要新的、安全有效的抗病毒药物。

Ftibamzone属于氨基硫脲类，对HSV-1和HSV-2病毒斑的形成和繁殖具有抑制作用。在埃及和中国，它主要被用作治疗HSV的ftibamzone乳膏或软膏[7-10]，但在美国尚未批准使用[11,12]。此外，与抗病毒核苷酸类似物相比，FBZ具有独特的抗病毒作用机制，被认为与核糖核苷酸还原酶抑制有关。但是FBZ的低活性和低溶解性降低了其治疗效果，并限制了其药物应用[13]，例如无法静脉给药。我们选择极化细胞系Madin Darby犬肾（MDCK）细胞系进行本研究，因为人类感染HSV的细胞谱主要由极化细胞组成[14]。在这项研究中，我们报道了FBZ包埋纳米颗粒的新配方可以提高FBZ的溶解度并增加上皮细胞对FBZ的吸收，从而有效治疗生殖器疱疹。

材料和方法

材料

所有的化学药品和试剂均购自Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA)。聚乳酸-羟基乙酸(PLGA) 50/50 (MW 153000)是Purac生物材料(Gorinchem，荷兰)慷慨的礼物。

FBZ的理化表征

pH-Solubility概要测定了FBZ在pH值为2 ~ 12的磷酸盐缓冲液中的水溶性。按照前面所述的程序[15-17]，将多余的FBZ加入到含有10 ml缓冲液的各种小瓶中，置于37℃水浴摇床中^°C，使其平衡24小时。平衡后，样品在Thermo IEC Multi RF离心机(Needham Heights, Massachusetts USA)中以4500 rpm离心5分钟。收集上清液，0.45 μ m滤网过滤，HPLC法测定FBZ。所有实验均为3个重复。

FBZ法测定pKa

pH溶解度曲线根据前面描述的方法[18,19]，根据pH溶解度曲线确定pKa值。根据提供的方程式：

其中SS，_o为FBZ的结合形式在水中的溶解度，S为药物在特定pH值下的溶解度对比pH值，从x轴截距确定pKa。

分配系数

通过将5mg FBZ放入5ml (0.1 M) pH范围为2 - 10的磷酸盐缓冲液(之前已用1-辛醇饱和)中，可以获得1-辛醇/水的分配系数。在水相中加入等体积的1-辛醇(5 mL)作为有机相。管端-端旋转5小时，以4500 rpm离心10分钟。最后从稀释的有机相中仔细抽吸水相，用紫外/可见分光光度法测定FBZ的含量。分配系数(Log P)的计算公式为:

在V_aq是水相的体积，C_我和C_aq水相中FBZ的浓度是初始和平衡后与V的关系吗_o是1-辛醇的体积。

Ftibamzone稳定

强制降解研究由Ohja进行等[20]。在室温下将1毫克FBZ溶于1M盐酸中，采样120分钟，用高效液相色谱法测定完整FBZ。

FBZ的高效液相色谱分析

在室温下，以1.0 mL/min的流速通过Zorbax 300SB-C18，4.6 x 250 mM，5微米柱（安捷伦，加利福尼亚州圣克拉拉）泵送由60%乙腈和40%50 mM磷酸盐缓冲液和1 mM EDTA组成的流动相。样品进样量为20µL，使用SPD-M10AVP光电二极管检测器（美国马里兰州哥伦比亚岛津）在345 nm处检测FBZ。使用岛津EZ Start 7.2.1收集和整合数据

FBZ负载纳米颗粒的制备

FBZ与甲基-β-环糊精(mβCD)络合:在蒸馏水中制备1%、2%、5%和10% mβCD溶液;将FBZ加入每种溶液中，搅拌48小时，然后以4500 rpm离心10分钟。滤液是通过收集上清，然后通过0.45µm过滤器过滤得到的[21,22]。滤液在不同波长下的吸光度由SkanltMultiskan光谱分光光度计(Thermo Electron Corporation, vanta, Finland)获得。络合常数(K_1:1)，根据配合物化学计量比为1:1的假设，由相溶图计算得到，公式如下:

K_1:1＝

哪里，K_1:1是络合常数，S_o是本征溶解度，斜率由介质中溶解药物浓度与mβCD浓度的关系图计算得出。在没有mβCD的情况下，直接在水介质中测定FBZ的本征溶解度。

1:2络合物（K1:2）使用Loftsson等人推导的方程式进行计算[23]：

年代_t=S_o+ K_1:1. s_o. [CD]+K_1:1. K_1:2。年代_o(光盘)₂

在年代_t和CD分别为总FBZ和mβCD浓度，K_1:1和K_1:2分别表示1:1和1:2络合物的络合常数。

含FBZ/mβCD的壳聚糖凝胶:将400或800 mg壳聚糖溶于20 ml 1%冰醋酸溶液中制备壳聚糖水凝胶。将20毫升10% FBZ/mβCD复合物加入到每一种壳聚糖凝胶制剂中，充分混合，形成1%和2%含FBZ/mβCD的壳聚糖凝胶。

FBZ-PLGA纳米粒子制备:纳米颗粒(FBZ-PLGA)是通过前面描述的纳米沉淀法制备的[24,25]。采用聚乙烯醇(PVA)来提高药物的吸收和释放特性。简单地说，将1mg的FBZ加入到2ml的1% PLGA中，在丙酮中搅拌直到溶解，然后在1500 rpm的恒定搅拌下滴入4%的PVA溶液。将形成的乳化液在室温下搅拌2小时以蒸发丙酮。通过5000 rpm离心10分钟去除较大的颗粒和聚合物团块。不含FBZ的空白PLGA纳米颗粒(PLGAnps)的配方也类似。使用BI-200SM激光散射系统(Brookhaven Instruments, Holtsville, New York)测量了所有配方(PLGAnps和FBZ-PLGAnps)的粒径和zeta电位。

FBZ PLGAnps的FBZ泄漏：为了评估PLGAnps中FBZ的渗漏情况，将3 ml纳米颗粒悬浮液转移到一个分子量为50 kDa的切断透析袋中，用50 ml PBS进行透析。在预定的时间间隔内，取500µl的透析液，用等体积的新鲜PBS缓冲液替换。采用高效液相色谱法测定样品中FBZ的浓度。

纳米颗粒对极化MDCK细胞的影响

将Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞接种在96孔板上，每孔5 x 103个细胞，并在补充有2 mM L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠、4.5 g/L葡萄糖、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养。在75%汇合时，将MDCK细胞暴露于各种配方（PLGAnps、FBZ-PLGAnps、FBZ-mβCD和FBZ-1%壳聚糖凝胶）中，并在6、24和48小时使用阿拉玛蓝测定细胞活力。在每个时间点结束时，用HBSS清洗细胞，并用100µl Alamar blue plus细胞培养基进一步培养5 h。使用Skanlt Multiskan光谱分光光度计（芬兰万塔热电公司）在550/580 nm波长下测量产生颜色的吸光度。

不同纳米颗粒配方对上皮细胞的共聚焦效应

极化MDCK细胞与FBZ-PLGAnps-共轭异硫氰酸荧光素（FBZ-PLGAnps-FITC）在37℃温和摇动下孵育。1小时后，移除FBZ PLGAnps FITC，用PBS清洗细胞表面两次，用4%多聚甲醛固定，安装，并使用配备蔡司LSM 510激光共焦显微镜的Axiovert 100M显微镜（卡尔蔡司公司，纽约桑伍德）成像，激发波长为488 nm，发射波长为520 nm。

后果

ph溶解度曲线和pKa

如图1所示，从pH 2到pH 10, FBZ的溶解度没有显著增加，但从pH 10到pH 12, FBZ的溶解度显著增加，最终溶解度为950µg/ml。结合方程1中的ph值溶解度数据，FBZ的pKa被确定为10.95(图2)，而使用辛醇/水(方程2)的对数P被发现为1.246。

图1所示。25±1℃时FBZ pH溶解度曲线^°C

图2。FBZ pKa与溶解度的关系;图中显示了pH值的函数。该曲线与R呈线性关系²值>0.99。x轴上的截距是FBZ的视在pKa

对数分布系数与稳定性

图3显示了不同pH值下FBZ溶解度的D随pH值的变化曲线。从剖面上可以看出，log D值从pH 1时的1.26略微增加到pH 2时的1.49，之后保持不变到pH 10。在pH为11 ~ 14时，log D从1.42显著降低至-0.59。这表明，对药物FBZ的pH曲线的对数D是酸性药物的一个特征，在低pH时，unionized基团占优势，而在高pH时，药物FBZ达到电离态，增强了其亲水性。为了考察FBZ在酸性环境中的稳定性，在1M HCL中对FBZ的降解进行了评估，得到的数据(图4)显示，在120 min内，FBZ的降解率仅为2.21%。总的来说，FBZ的稳定性剖面显示降解速率为2.5 × 10^－5最小值^－１．

图3。FBZ分布系数剖面;在辛醇缓冲体系中，Ftibamzone的分配系数与pH的关系

图4。FBZ在HCl中的降解曲线显示在120分钟内随时间的变化。数据表示为平均值±SEM (n=3)

FBZ-mβCD络合

采用相溶法研究了mβCD对FBZ水溶液溶解度的影响，即在mβCD溶液中加入FBZ，测定FBZ的溶解度。从图5可以看出，FBZ的溶解度随环糊精浓度的增加而增加，呈线性增加。这种线性增加表明与mβCD形成了1:1络合物，相溶解度曲线的线性回归相关系数大于0.99，表明拟合良好。计算的络合常数K_1:1含mβCD的FBZ为0.00706 mM^－１使用方程3。另外，K_1:2根据式4计算出络合常数为8.98 × 10^－8毫米^－１这明显低于K_1:1复杂。K的较低值_1:2相比之下,K_1:1表明1:1复合物是主要形式。

图5。甲基-β-环糊精（mβCD）对FBZ溶解度的影响

FBZ-mβ cd纳米颗粒对FBZ的释放动力学研究

对FBZ进行体外释放，结果表明FBZ释放量与包埋FBZ的mβCD量呈线性关系。从图6中，我们观察到，加载FBZ时使用的mβCD量越高，FBZ的释放量越大。这与图5中的结果一致，图5中mβCD的增加量提高了FBZ的溶解度。

图6。FBZ负载甲基-β-环糊精(FBZ-mβ cd)在37℃下24小时的体外释放动力学^°C

FBZ-PLGA纳米颗粒的表征

粒径和zeta电位FBZ-PLGAnps的测定值分别为216.20±6.20 nm和-5.47±0.83 mV，而PLGAnps的测定值分别为147.68±18.07 nm和-2.92±0.64 mV（表1）。FBZ-PLGAnps比PLGA纳米颗粒大约1.46倍，这很可能是由于FBZ的包封作用。我们还观察到FBZ-PLGAnps的zeta电位是PLGAnps的1.87倍。这两种纳米粒子显示的负电荷是PLGA聚合物的典型特征[24,26,27]。

MDCK细胞活力和125µg FBZ-mβCD纳米粒的内化：评估

为了研究不同FBZ包埋纳米颗粒对MDCK细胞的影响，我们首先确定了增加FZB浓度对MDCK细胞活力的影响。暴露48小时后，我们观察到0.01µM FBZ对MDCK细胞几乎没有影响，而10µM FBZ孵育MDCK细胞后仍有60%的细胞存活(图7A)。图7B显示了MDCK细胞暴露于不同浓度的不同纳米颗粒时的生存能力。PLGAnps、FBZ-PLGAnps和125µg FBZ-mβCDnps处理6、12和48小时后，MDCK细胞活力均无明显下降。而250µg FBZ-mβCDnps和500µg FBZ-mβCDnps对MDCK细胞暴露48小时后活性有显著降低(p < 0.05)。在所有配方中，只有500µg FBZ-1%的壳聚糖凝胶对MDCK细胞具有细胞毒性。在细胞摄取纳米粒子时，125µg FBZ-mβCDnps被极化的MDCK细胞单层吸收。仅壳聚糖包被FBZ负载的plganps (FBZ- cplganps)，在极化后的MDCK细胞单层中显示了显著的聚集，如图8B所示，而图8A显示了未处理的MDCK细胞中存在核。

图7。在细胞被增加浓度的FBZ处理48小时后，MDCK细胞的存活率（a），在6、24和48小时被PLGAnps、FBZ-PLGAnps、FBZ-mβCD和FBZ壳聚糖纳米粒处理时，MDCK细胞的存活率。数据表示为平均值±扫描电镜（n=3）。*；p<0.05，***；p<0.001

图8。用激光共聚焦显微镜观察MDCK细胞对（A）FBZ CpGaNPs的摄取。纳米颗粒显示为绿色荧光，而细胞核显示为蓝色荧光

讨论

Ftibamzone（FBZ）是一种氨基硫脲，目前在亚洲和欧洲部分地区用于治疗生殖器疱疹。然而，由于其溶解度低且不能在携带病毒的阴道上皮细胞中积聚，因此其对单纯疱疹病毒的有效性尚未完全实现。在这项研究中，我们系统地研究了FBZ的理化性质，并得出了一个合理的配方，可以最有效地将FBZ运送到病毒增殖部位。

FBZ在阴道pH为4左右和血浆pH为7.4时的水溶性很低。它在乙醇或聚乙二醇等生物相容溶剂中没有明显的溶解性，但在不适合用于药物制备的二甲基二苯甲醚和丙酮中表现出明显的溶解性。我们的研究表明，pH值超过10后，负基团的电离程度更高，因此FBZ的溶解度呈指数级增加。因此，为了增加FBZ在pH为4时的溶解度，我们使用了mβCD，通过将亲脂药物纳入其亲脂核心来增加其溶解度。mβCD与FBZ形成较小的1:1，但主要形成1:2的复合物。FBZ-mβCD在极化上皮细胞培养模型中的通透性和随后的积累较低。为了规避这种渗透性挑战，我们将FBZ-mβCD复合物加入生物粘合剂和生物相容性壳聚糖凝胶中，这是众所周知的提高药物穿过细胞屏障的渗透性。然而，这些壳聚糖凝胶配方损害了上皮细胞或宿主细胞的完整性。

因此，我们设计了FBZ包埋PLGAnp（FBZ-PLGAnps），其粒径约为200nm，表面具有中等的负电荷密度。当用0.1%壳聚糖凝胶对这些纳米粒子进行预处理时，纳米粒子的表面正电荷显著增加。尽管粒径增加至280±16 nm，壳聚糖包覆的FBZ-PLGAnps仍能在MDCK细胞中显著累积，与对照细胞相比，其细胞毒性不显著。这些结果清楚地表明，通过形成FBZ-mβCD络合物，FBZ的溶解度可以显著提高。然而，这些复合物并没有在上皮细胞中大量积累。但是用壳聚糖引发的PLGAnps是一种有效的载体，可以将FBZ携带到单纯疱疹病毒居住和复制的MDCK细胞中。

研究表明，FBZ- plganp纳米颗粒与单用FBZ相比，可显著提高FBZ的溶解性和吸收性，具有作为治疗生殖器疱疹的有效给药系统的潜力。FBZ- plganp和FBZ对单纯疱疹病毒的抗病毒活性有待进一步研究和比较。