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主编
伊凡痛风
伦敦大学学院
文章类型
研究文章
出版的历史
收稿日期:2016年8月05日
接受日期:2016年8月22日
发布日期:2016年8月25日
版权
©2016 Lee G.这是一篇根据创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒介中无限制使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
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Lee G(2016)癌症免疫球蛋白在癌症免疫中的独特功能作用。整合Mol医学3:DOI: 10.15761/ im .1000238。
不列颠哥伦比亚大学生殖健康中心，温哥华，加拿大
电子邮件:leecyg@gmail.com>
DOI: 10.15761 / IMM.1000238。
癌细胞的免疫系统被揭示，了解免疫球蛋白表达在癌症表面的癌症免疫发挥重要作用。1987年产生的抗卵巢癌细胞提取液的RP215单克隆抗体与一个碳水化合物相关的表位特异性反应，该表位主要位于免疫球蛋白重链可变区，表达于几乎所有癌细胞(一般称为CA215)的表面。此后，RP215成为研究癌细胞受这些免疫球蛋白影响的作用机制的独特探针。一般来说，在裸鼠动物模型中，RP215和抗人免疫球蛋白在诱导细胞凋亡和补体依赖性细胞毒性反应以及减少植入肿瘤体积方面效果相同。在分离的癌性免疫球蛋白和/或CA215和人血清蛋白之间进行了相互作用研究，其中大多数表现出抗癌或促癌特性。因此，我们推测癌性免疫球蛋白可能与这些人类蛋白质相互作用，促进生长/增殖，并保护人类循环中培养的癌细胞。RP215可能进一步发展成为靶向大多数癌细胞的抗癌药物，用于人类癌症的免疫治疗。
抗癌、免疫球蛋白、CA215、RP215、抗癌、促癌
几十年来，我们知道上皮来源的[1]癌细胞可以表达免疫球蛋白。早期研究似乎表明，表面表达的免疫球蛋白对癌细胞的生长和增殖至关重要在活的有机体内．这一结论是基于免疫球蛋白相关的SiRNA研究得出的[2,3]，而SiRNA干扰免疫球蛋白基因表达可导致肿瘤生长和/或增殖的抑制[1,4,5]。1987年取得了重大突破，一种名为RP215的单克隆抗体被用于对抗一株浆液来源的卵巢癌细胞系(OC-3-VGH)的细胞提取物[4,5]。通过MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)综合分析发现，纯化的同源抗原(一般命名为CA215)主要由癌细胞表达的免疫球蛋白重链组成，而在b细胞来源的同源抗原中未发现[6,7]。该单克隆抗体已成为研究癌症免疫球蛋白功能作用的独特探针，许多生物学和免疫学研究。这些研究的主要目的是确定其体外和体内对抗人类癌症的作用机制，以及RP215作为抗癌药物开发候选的适用性。因此，在这篇简短的综述中，将通过使用RP215作为此类研究的工具来强调癌性免疫球蛋白的独特作用[8-10]。
有大量的间接实验证据表明，rp215特异性表位与碳水化合物相关[11,12]。最初的实验观察表明，轻度高酸盐处理会导致CA215[1]中RP215结合活性的丧失，热处理(100⁰C 5分钟)也是如此，表明碳水化合物参与了表位识别。在无碳水化合物前体(葡萄糖除外)的无血清培养基中连续培养癌细胞，观察到CA215免疫活性明显丧失[10,13]。此外，用人血清而不是牛血清白蛋白培养癌细胞不会导致CA215免疫活性的丧失，这表明NeuAc或NeuGc不会改变RP215与CA215的结合。通过对癌细胞IgG基因的DNA分析，发现癌性免疫球蛋白Fc区氨基酸序列与正常人IgG几乎相同，提示RP215特异性识别的表位可能与碳水化合物相关，而非基因变异所致[14,15]。这种rp215特异性表位也可以在许多与人类免疫球蛋白没有明显序列同源性的其他糖蛋白中检测到，如具有类似免疫球蛋白折叠的免疫球蛋白超家族蛋白(IgSF)。结合ELISA的结果表明，在CA215或癌性免疫球蛋白中，rp215特异性表位的优先位置应在IgG重链的Fab可变域上。鉴于RP215与CA215具有很高的结合亲和力，因此我们认为蛋白骨干的氨基酸残基可能参与了RP215特异性表位的形成[16,17]。CA215的RP215结合表位可能只有一个典型的糖缀合物。通过实验观察发现，在微孔包覆的OC-3-VGH(卵巢)、C33A(宫颈)和ME-180(宫颈)等多种肿瘤细胞系中，RP215的表观结合亲和力几乎相同(Kd 2-5 nM)。 Among CA215 recognized by RP215, the majority of glycopeptides isolated were found to be those of cancerous immunoglobulins based on results from comprehensive analysis of glycopeptide mapping (80-90%) [10]. RP215-specific carbohydrate-associated epitope may be O-linked glycan located in the variable regions of immunoglobulins. This conclusion was drawn based on the fact that tunicamycin, inhibitor of N-glycan biosynthesis has little effect of RP215-specific immunoactivity following continuous culture of cancer cells in the presence of the inhibitor [6,18,19]. Based on the results of glycosyl-linkage analysis， only two simple O-linked glycans were identified and tentatively assigned for cancerous immunoglobulins and/or CA215. The O-linked glycans from CA215 and cancerous immunoglobulins contain tri-saccharides with terminal N-acetyl neuraminic acid (NeuAc) and was found to be a major glycan component. The glycosyl linkage analysis indicates that the main O-glycans are Core-1 structure with 3-linked and 3, 6-linked GalNAcitol [GalNAc-Gal (3)-NeuAc (6)] [13,15,20].
与正常小鼠IgG或人IgG相比，亲和分离的癌性IgG免疫活性较低，提示癌性IgG可能在IgG可变区发生异常糖基化[21,22]。通过总结所有的实验观察，我们可以得出结论，rp215特异性表位最可能与O-linked glycan相关，主要位于癌性免疫球蛋白重链的可变区域，以及许多其他如igsf相关或不相关的糖蛋白[1,23]。o -链聚糖具有核心1结构，可被重新定义为T-S抗原。这个新发现的T- s抗原表位显然与肿瘤高度相关，与T, Tn或STn抗原(tumcated O-linked glycans)不同，后者通常被发现与癌症相关的粘蛋白和神经节苷脂相连[24-28]。从以上实验可以得出，RP215主要与位于癌性免疫球蛋白可变区域的表位发生反应。核1结构的o -链聚糖明显参与了RP215对表位的识别。人体内的正常免疫球蛋白和癌性免疫球蛋白可以通过后者的异常O-linked聚糖被RP215单克隆抗体识别[7,12,29,30]而得到明显的分化。
自1987年发现RP215以来，对其特异性表位及其同源抗原CA215[6]的分子性质知之甚少。然而，CA215作为泛癌生物标志物的部分免疫诊断应用已在卵巢和宫颈癌的初步临床研究中实现并报道[31,32]。大约20年后，用rp215相关免疫亲和层析从培养的癌细胞脱落培养基中分离出CA215[7,32]。通过MALDI-TOF质谱法分析CA215的分子同源性[8,9]。研究发现CA215主要由大多数上皮细胞来源的癌细胞表达的免疫球蛋白组成，而正常B细胞来源的癌细胞中未发现CA215的表达[33,34]。进一步分析还发现，CA215不仅在癌性免疫球蛋白中存在缺陷，在T细胞受体、MHCI、MCHII等多种糖蛋白(IgSF)以及细胞粘附分子中也存在缺陷，其中[35]的检出率超过60%。免疫组化研究发现，无论是在细胞系还是癌变组织切片中，RP215都能与许多癌细胞的表面发生反应[10,14,23,36]。抗人类免疫球蛋白的抗体也可以与表面的许多癌细胞发生反应。这些结果表明，抗人IgG和RP215均可与来自不同组织来源的癌细胞表面表达的癌性免疫球蛋白特异性相互作用[37-39]。
通过培养卵巢癌(OC-3-VGH)和宫颈癌(C33A)等多种癌细胞，研究RP215和抗人IgG的作用[1,40,41]。小鼠RP215、人源RP215或抗人IgG在1-10 μg/ml浓度下培养24-48小时，几乎无一例外地诱导癌细胞凋亡[17,42-44]。将RP215与培养的癌细胞在补体存在下孵育，所有培养的癌细胞均可诱导补体依赖性细胞毒性反应(CDC)。
“概念证明”实验由裸鼠动物模型进行演示。将RP215以剂量依赖的方式注射到OC-3-VGH卵巢癌或SK-MES-1肺癌细胞系裸鼠，可观察到肿瘤体积显著减小[34,45 -47]。
抑制肿瘤生长的作用机制在体外而且在活的有机体内，通过基因调控研究阐明了RP215[27,48-50]。通过半定量PCR的方法，研究了多达十几个与癌细胞生长/增殖和固有免疫有关的基因。其中包括P1(蛋白合成)、P21、cyclin D1、c-fos(细胞周期调控)、IgG、NFkB-1 (IgG表达)以及TLR-3、TLR-4、TLR-9等toll样受体。分别测定RP215和抗人IgG处理对所选基因调控变化的影响，并进行相关性分析。两种抗抗原受体配体之间具有良好的相关系数(R2 = 0.957)。这表明RP215可作为抗人IgG抗体的合适替代品，并可用于靶向癌细胞表面表达的免疫球蛋白。因此，RP215可以作为一种很好的抗癌药物开发候选，用于治疗各种人类癌症[1,17,51]。
RP215特异性识别癌性免疫球蛋白上的异常o -连接聚糖。B细胞来源的癌性免疫球蛋白与正常免疫球蛋白在功能和表达上存在明显差异[21,22,52]。对于正常的抗原受体，如免疫球蛋白和T细胞受体，在我们的身体免疫系统中，它们分别由B细胞和T细胞表达。相反，免疫球蛋白和T细胞受体是由相同的癌细胞共同表达的，即使是来自相同克隆来源的癌细胞。正常免疫球蛋白通过类转换和高频率的高突变从B细胞中获得，而癌变免疫球蛋白的表达则不存在或[53]非常有限的表达机制。正常免疫球蛋白中除NeuAc末端的IgG重链N297处常见的n -糖基化外，未发现o -连接的糖基化或异常的糖基化。在正常的人体组织中，只发现NeuAC，但在癌变组织中，NeuAC和NeuGC都发现[1]。在正常IgG中未发现RP215单抗的识别位点[21,54]。相反，o -链接和n -链接的聚糖均在具有NeuAC和/或NeuGc末端的癌性IgG重链中检测到。“T-S”抗原表位这种具有核1三糖结构的异常o -连锁糖基化可能会产生被RP215识别的独特的蛋白-碳水化合物联合表位。 Due to the aberrant O-linked glycosylations of cancerous immunoglobulins, low immunoactivity binding activity was observed as described previously when compared to that of normal immunoglobulins (with anti-human IgG as the binding probe). Furthermore, bindings of cancerous immunoglobulins on the surface of cancer cells can result in dramatic regulation changes of many genes involved in growth/proliferation as well as innate immunity such as toll-like receptors of cancer cells. In contrast to normal B cells which produce and secrete immunoglobulins, such gene interactions or regulations have never been reported or found [50,55,56]. Finally, apoptosis and complement-dependent cytotoxicity (CDC) can be induced upon treatments of cultured cancer cells with anit-antigen receptors or RP215, whereas no such mechanisms exist in normal B cells.
基于这些观察，我们可以假设正常免疫系统和癌症免疫系统是不同的，可以在我们的身体环境中共存。
研究了癌症免疫球蛋白和人血清蛋白之间的相互作用，以阐明它们在癌症免疫中的功能作用。首先，采用亲和层析法，以RP215和抗人IgG为亲和配体，分别从培养的癌细胞(OV-3-GH，卵巢)脱落液中分离出CA215和癌性免疫球蛋白。然后将分离得到的CA215和癌性免疫球蛋白作为配体，分别分离出与CA215和/或癌性免疫球蛋白具有结合亲和力的人血清蛋白。采用LC-MS/MS法对分离的蛋白进行比较分析。对比分析结果表明，CA215和cIgG亲和柱纯化的人血清蛋白有80-86%相同。在分离出的几十种蛋白质中，它们通常可以根据其内在的促癌或抗癌特性进行分类。CA215和/或cIgG普遍识别的人血清癌前蛋白有C4结合蛋白、-chain、补体C3和补体因子H、血清转铁蛋白和体外nectin[。另一方面，经鉴定为抗癌的人血清蛋白包括载脂蛋白A1、纤维蛋白原链、胰蛋白酶间抑制物重链4、anastellin、角蛋白1型细胞骨架9和抗免疫IgG。
这些实验观察强烈表明，癌症免疫球蛋白在癌症免疫中同时发挥着两种截然不同的功能作用。因此，我们认为癌性免疫球蛋白可以作为特异性结合蛋白，捕获一些人血清蛋白，促进癌细胞的生长/增殖。与此同时，这些癌性免疫球蛋白还能够吸附、中和或与人体循环中具有抗癌特性的物质相互作用，以保证癌细胞在我们正常的人体环境中存活。
选定的人血清成分与癌细胞表面的癌性免疫球蛋白之间的确切相互作用模式有待进一步研究。如果不进一步深入研究，不排除信号转导导致癌细胞基因调控发生巨大变化的可能性。
由于RP215被证明在生物学和免疫行为上与抗人IgG具有或多或少的生物等效性，因此基于RP215的免疫诊断应用有望在癌症患者血清样本中测定癌症免疫球蛋白或CA215[56,67,68]。
在早期临床研究中，用基于rp215的酶免疫试剂盒监测宫颈癌或卵巢癌患者血清CA215水平。一般观察到无论是宫颈癌还是卵巢癌患者，血清CA215水平的升高都与癌症的分期有关[9,69-71]。研究明确表明CA215的阳性检出率与癌症分期密切相关[72,73]。以宫颈癌为例，不同癌症阶段的阳性检出率可高达66-94%[56,74]。同样，卵巢癌的阳性率在58-86%之间，也与分期有关。然而，无论哪种情况，CA215水平的状态依赖性在I期和II期或III期之间更显著[1,58,66,75]。在另一项研究中，研究人员监测了特定癌症患者在治疗过程中的CA 215水平。研究发现，与未接受任何治疗的患者相比，手术或化疗后7天，CA215水平显著降低[76]。因此，CA215酶免疫分析试剂盒可用于CA215阳性肿瘤患者的常规监测[32,77]。
采用建立的CA215 EIA试剂盒对500余例不同癌症确诊患者的血清标本进行CA215水平评估[1,34,50]。然后将这些血清标本的CA215水平与其他癌症生物标志物[11]的相对阳性率进行比较。基于rp215的酶免疫检测结果显示，与正常个体相比，CA215在不同癌症中的阳性检出率普遍高于50%[68,78]。其中淋巴瘤(83%)或肺癌(52%)、肝癌(74%)、食道癌(61%)、胃癌(60%)、卵巢癌(59%)、乳腺癌(71%)、子宫颈癌(51%)。与其他已知的癌症生物标志物如CA215、CA15-3、CA19-9、AFP、CEA和cyfra21-1和β2微球蛋白进行并排比较[33,79]。很明显，当CA215与其他类型的生物标志物结合用于癌症检测时，发现阳性率要高得多[50,67]。例如，结合CA215和CA125，从三个独立的主要医疗中心的临床研究结果判断，卵巢癌患者的阳性检出率可以从59%提高到82%[26,34]。
在大多数癌症表面表达的免疫球蛋白可以成为RP215的唯一靶点，它特异性识别癌性免疫球蛋白。此前的生物学和免疫学研究也表明，RP215可诱导培养的癌细胞凋亡，CDC反应可在补体存在下诱导培养的癌细胞裂解[16,52,80]。几种典型的裸鼠动物模型显示，将RP215注射到肿瘤植入小鼠也可以以剂量依赖性的方式显著减少肿瘤体积[37,75]。
基本上，目前有两种策略可以用于开发基于rp215的抗癌药物。一种是将人性化形式的RP215按克或亚克数量对癌症患者进行被动免疫治疗。另一种是CAR-T细胞疗法。在Fab域的人源化RP215基因以嵌合抗原受体(CAR)的形式被包装到载体中。用car相关载体转染患者自身的T细胞，进一步扩增T细胞，可使RP215表达靶向癌细胞在活的有机体内．rp215相关的CAR-T系统可能是未来癌症免疫治疗的一种有前途的方法[1,11,81]。
鼠源性的RP215可以被设计成人性化的形式，特别是IgG重链和轻链的FR域Fab区域。由于CDR区域是关键的抗原结合域，因此应尽量减少CDR区域氨基酸序列的改变[81,82]。RP215人源化抗体可以以不同的形式组装，包括全抗体、Fab、Fab '和(Fab ')等片段2以及重组产生的单链抗体(scFv)，后者通常用于CAR-T技术，对CA215具有免疫反应性。得到的人源化RP215应与原始鼠RP215具有相当或相当的亲和力和特异性，通常包含基本相似或相同的cdr区域或域[81]。目前正在开发分泌人源化RP215的CHO稳定细胞系，以实现人源化RP215的大规模生产在体外文化[11,41]。目前正在进行人性化RP215的临床前研究，以满足美国FDA要求的IND(初始新药开发)标准[83,84]。
在这篇简短的综述中，我们总结了我们最近对癌症免疫球蛋白的研究结果，以阐明它们在癌症免疫中的作用机制[32,41,42]和潜在的临床应用。癌细胞产生的免疫球蛋白不同于B细胞来源的免疫球蛋白。在癌症免疫球蛋白中异常的糖基化导致一个独特的碳水化合物相关的表位被RP215单克隆抗体识别。因此，RP215可以成为癌症免疫球蛋白研究的有用工具。通过多年的研究，我们开始意识到癌症免疫球蛋白可能存在两种不同的功能作用。一般来说，在我们正常的身体环境下，许多人的血清蛋白通常被癌症免疫球蛋白或RP215识别，已知具有抗癌或促癌特性，在体外或在活的有机体内(21、22)。因此，我们可以合理地假设，在我们正常的身体环境下，癌性免疫球蛋白通过与某些人血清蛋白的相互作用或结合，对癌细胞的生长/增殖至关重要。这些人血清蛋白先前已经被其他人证明可以促进癌细胞生长或增殖，上调生长因子，下调补体攻击癌细胞和血管生成癌细胞[57,79]。
另一方面，与某些人血清蛋白的相互作用可能导致抑制癌细胞的生长。癌性免疫球蛋白可用于中和人体循环中的那些有害蛋白质或成分。因此，靶向表面表达的癌性免疫球蛋白的RP215可能成为癌症免疫治疗的独特选择。人性化RP215的临床前和临床研究有待于进一步的抗癌药物开发。在不久的将来，通过被动免疫或与RP215相关的CAR-T细胞治疗，人源化的RP215有望成为有效的抗癌药物[1,10]。
作者感谢加拿大温哥华Vancouver Biotech Ltd.和加拿大NSERC的IRAP项目(No. 794354)的研究资助。我们也感谢韩博士的技术支持。
伊凡痛风
伦敦大学学院
研究文章
收稿日期:2016年8月05日
接受日期:2016年8月22日
发布日期:2016年8月25日
©2016 Lee G.这是一篇根据创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒介中无限制使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Lee G(2016)癌症免疫球蛋白在癌症免疫中的独特功能作用。整合Mol医学3:DOI: 10.15761/ im .1000238。
没有数据。
