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摘要

许多具有医疗应用潜力的蛋白质都含有二硫桥。在这篇综述中，作者介绍了这类蛋白的研究，特别是结构-功能关系的澄清和分子工程方面的研究，重点介绍了三类靶点，即人溶菌酶、由肝素型结构域组成的植物凝集素以及人Fas配体和Fas受体的细胞外结构域。根据我们目前的知识，总结了每一类蛋白质与治疗应用相关的生物功能、结构特征、样品制备方法的发展以及澄清结构-功能关系的实验结果，包括基于其三维结构的蛋白质工程研究。这些研究在引入配体复合物形成、位点定向突变和位点特异性化学修饰后，通过各种生化和生物物理分析结合新开发的重组表达和化学合成方法，阐明了结构和功能后果的细节。主要研究成果包括内糖苷酶催化和凝集素识别碳水化合物的结构功能关系的基本原理，以及死亡配体和死亡受体胞外结构域应用的生物技术进展。本文综述的实验结果将有助于未来新型二硫桥蛋白的开发，具有针对未满足的医疗需求的治疗用途。

关键字

苋属caudatus抗菌肽2 (Ac-amp2)，人Fas配体，人Fas受体，人溶菌酶，Uritica dioica小麦胚芽凝集素(WGA)

缩写

aa:氨基酸;Ac-amp2:抗菌肽苋菜种子2;自身免疫性淋巴增生性综合征;CD:分化集群;CRD:半胱氨酸富域;hDcR3:人诱饵受体3;Ee-CBP:抗菌肽卫矛europaeusl .树皮;ECD:细胞外结构域;ER:内质网;加:半乳糖;GalNAc: N-acetylgalactosamine;GlcNAc: N-acetylglucosamine;移植物抗宿主病;ITC:等温滴定量热法;男:甘露糖;MHC:主要组织相容性复合体; NMR: Nuclear Magnetic Resonance; NeuNAc: N-acetylneuraminicacid; PDB ID: Protein Data Bank Identification Code; PL-D2: Pokeweed Lectin-D isoform 2; NF-κB: Nuclear Factor-kappa B; PWM: Pokeweed Mitogen from商美国树皮;RA:类风湿关节炎;TNF:肿瘤坏死因子;小麦胚芽凝集素;使用UDA:荨麻属dioica凝集素;WAMP:抗真菌肽小麦属植物kiharae种子

简介

各种各样的医学上重要的蛋白质，包括但不限于抗体、酶、细胞表面结合蛋白、细胞因子及其同源受体、抗微生物蛋白、激素、毒素和参与氧化还原转化或营养运输的蛋白质，都含有二硫化物桥。这些蛋白质通常存在于细胞表面或分泌到细胞外体液如血液中。细胞外的周围生化环境往往不利于蛋白质分子的生存，因为存在着包括蛋白酶在内的许多灭活因子。因此，相关的蛋白质必须足够稳定，以承受这种情况。二硫桥是连接蛋白质分子中主肽链的两个不同部分的共价键;因此，它们使蛋白质分子具有相当大的结构稳定性。二硫桥的稳定效应主要是熵性质的，被认为明显大于其他非共价相互作用，如氢键相互作用和范德华相互作用[2]。

迄今为止，许多二硫桥蛋白包括单克隆抗体、溶酶体酶、凝血和纤溶因子、血清蛋白、胰岛素、生长激素、干扰素和白介素已被批准作为实用的蛋白质药物。然而，仍有不同类别的二硫蛋白具有潜在的治疗活性，这可能适用于满足未满足的医疗需求。本文重点介绍了三类二硫桥蛋白，即人溶菌酶、由肝素型结构域组成的植物凝集素以及人Fas配体和人Fas受体的胞外结构域。首先，对每一类蛋白质的治疗相关性进行了简要的总结。然后阐述了强调立体方面的结构特点。在此之后，通过重组表达系统、基于自然资源的亲和分离或化学合成加上随后的重折叠实现的生物化学研究的有效样本制备方法进行了描述。最后，提出了有关结构分析和功能表征的代表性主题，以阐明它们之间的关系和与医疗应用有关的生物技术进步。

人溶菌酶

一种具有治疗应用潜力的溶菌酶

人类溶菌酶于1922年被发现是鼻液的一种成分，它溶解了培养板[3]中被污染的细菌。易感细菌被命名微球菌lysodeikticus(目前微球菌危害)．溶菌酶活性最初被认为仅对缺乏细胞外膜的革兰氏阳性细菌有效，如枯草芽孢杆菌．然而，随后发现该酶也能杀死革兰氏阴性菌[4,5]。在这种情况下，与乳铁蛋白等其他因素的协同作用可能会发生[4]，后者会导致外膜损伤，使肽聚糖层更容易接近溶菌酶分子。人体溶菌酶存在于以气道表液、眼泪、乳汁为代表的多种人体体液中，被认为是构成人体先天免疫的重要防御因子[4,6]。近年来，由于耐药细菌病原体的出现，公共卫生领域出现了严重问题。人溶菌酶来源于人体，被认为是一种安全的抗微生物剂，可能替代低分子量药物而不会产生不必要的过敏不良反应。甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌它是全球医院感染的主要原因，基本上对溶菌酶的溶解活性敏感，尽管已分离出许多表现出不同程度抗性的菌株[7]。人溶菌酶也被重新检验作为一种有效的治疗药物铜绿假单胞菌肺部感染以减轻细菌负担和炎症，这对于因免疫反应明显下降[8]而发生机会感染的患者来说可能是严重的问题。

在包括日本在内的一些国家，一种结构上同源的酶，鸡溶菌酶已被用作药物中的祛痰剂，用于治疗感冒、慢性鼻窦炎症等患者。然而，在这种情况下，溶菌酶的作用将主要来自其非酶抗炎活性，因为大多数普通感冒不是由细菌引起的，而是由病毒引起的，而病毒对溶菌酶的溶解活性不敏感。由于痰液中主要粘多糖的化学结构并不总是与细菌细胞壁的化学结构相同，因此药物治疗导致痰液粘度的降低是否可以归因于溶菌酶的酶活性尚存疑问。已经发表了一些关于免疫增强在癌症治疗中的报道，包括口服溶菌酶的抗转移活性[9,10]。这些非酶活性可能与其生理pH值[11]下的高阳离子性有关。但分子水平上的具体机制尚不清楚。与蛋白质错误折叠引起的疾病有关，迄今为止，已有8种突变的人类溶菌酶基因被报道为遗传性非神经性系统性淀粉样变的致病原因。

具有丰富二级结构的小球状单体蛋白质

人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，分子量约为14.7 kDa。它有四个二硫桥，它们都连接它的单主链紧密折叠成一个球体，尺寸为30 x 30 x 45 Å，具有扩展良好的α/β型二级结构(图1A)[13]。二级结构包括4个α-螺旋，2个3¹⁰-螺旋和由三条反平行链组成的β-片区。这些结构特征使人溶菌酶分子具有较高的热力学稳定性，其变性温度可达80.3^°C在pH值4.5[14]。碱性氨基酸残基(Arg, Lys和His，共20个残基)比酸性氨基酸残基(Glu和Asp，共11个残基)多很多，使整个分子非常碱性，这从等电点约为11可以看出。该分子本身不含碳水化合物链，但可以识别由β-1,4连接的n -乙酰氨基葡萄糖残基组成的碳水化合物均聚物(几丁质型底物)或由n -乙酰氨基葡萄糖残基和n -乙酰muramicacid残基组成的β-1,4连接交替共聚物(细菌细胞壁肽聚糖型底物)。在人溶菌酶分子表面，存在一个深的活性位点裂口，由6个子位点组成，标记为a至F，用于吞噬上述底物，并切割D和E之间的碳水化合物链(图1B和1C)。

图1所示。人体溶菌酶的三维结构。原子坐标数据来自PDB (ID: 1lzs, x射线模型)。面板A，整体结构。二级结构呈带状，二硫键呈束状。B图，结合的n -乙酰壳聚糖底物结构分裂为n -乙酰壳聚糖和n -乙酰壳聚糖(黄色)和文中提到的人溶菌酶的aa残基[原子颜色(红色，氧;灰色,碳;蓝色，氮)和其他aa残留仅棒模型(粉红色)显示。对人溶菌酶中相关aa残基进行了标记。A、B、C、D、E、F为6个子点的大致位置。图C和D，分子表面静电势分布。 Blue and green, positively charged regions; white and yellow, electrostatically neutral regions; red and orange, negatively charged regions. Blue, white and red, hydrophilic regions; green, yellow and orange, hydrophobic regions. Panel C, Front-side view exhibiting the catalytic cleft vertically in the same orientation as panels A and B; Panel D, back-side view by 180o rotation around the vertical axis.

利用多种表达宿主开发高效重组生产系统

利用优化密码子设计的人工人溶菌酶基因，首次尝试在细胞内过表达人溶菌酶大肠杆菌虽然通过增溶和稀释[15]过程，酶活性部分恢复，但导致形成不溶性和不活跃的包涵体。因此，分泌性表达系统在酿酒酵母利用鸡溶菌酶分泌信号序列成功生产可溶性全活性酶[16,17]。经过S的功能生产。酵母,其他成功的利用不同宿主的重组人溶菌酶高水平表达系统，包括米曲霉[18]，金顶孢[19]，毕赤酵母其次是[20,21]、水稻[22]、转基因小鼠[23,24]和转基因牛[25]。tr/ansgenic小鼠乳清中最高含量达到1.76 g/l，是人类乳清[24]的3倍。最近,大肠杆菌通过使用细胞内二硫桥形成增强菌株[26]共表达酶抑制剂蛋白，成为功能活性重组人溶菌酶的高效生产者。另一种酵母，克鲁维酵母菌属lactis还用于使用生物膜反应器[27]的人溶菌酶的高效分泌生产。

人体溶菌酶的分泌水平取决于体内的分泌信号序列酿酒酵母。无论是鸡溶菌酶信号肽序列及其衍生物还是人血清白蛋白信号肽序列都工作良好，但从信号序列中衍生出来的信号曲霉属真菌awamori葡萄糖淀粉酶不能分泌人溶菌酶[17]。含有10倍Leu重复序列的修正信号序列，与野生型鸡溶菌酶信号序列[28]相比，其有效性提高了1.8倍。此外，删除Cys77和Cys95之间的二硫键(图1A)可使分泌效率提高8倍酿酒酵母[29]。在p . pastorisα因子预pro序列被证明比ch/icken溶菌酶信号肽序列[20]更有效。为进行人体溶菌酶蛋白质工程研究，酿酒酵母到目前为止，系统都是专门使用的。

广泛的蛋白质工程催化机制和酶活性研究

在x射线晶体学[30]确定了鸡溶菌酶作为第一个酶蛋白分子的详细三维结构后，包括人溶菌酶在内的鸡型溶菌酶一直以原子细节[31]中的现有信息为基础，在许多糖苷酶如纤维素酶、淀粉酶等的工程研究中发挥着模型蛋白的作用。在人溶菌酶抗菌活性的基础上，底物的酶解作为基础医学应用具有重要意义。本文就人体溶菌酶aa残基的催化机制和酶活性的蛋白质工程研究进行了综述。在分子水平上与可能的治疗应用相关的其他重要方面(例如淀粉样蛋白形成)可以参考其他地方[32]。

两个含有残基的催化羧酸基(Glu35和Asp53)的精确位置对于底物的水解至关重要:

人溶菌酶是一种内嵌型β-糖苷酶。β-糖苷酶可根据立体化学性质分为两类，β-糖苷酶的末端β-异位羟基是由裂解产物[33]中分裂的糖苷键衍生而来。一个是保留酶，另一个是转化酶。人溶菌酶属于前者，其催化反应建议通过氧碳离子型中间体进行。在人溶菌酶中，几丁质型底物水解的最佳pH值约为5.1，其中Glu35 (pKa: 6.8)作为一般酸，被认为首先使剪刀键中的氧原子质子化。生成的氧碳离子的正电荷和Asp53 (pKa: 3.4)侧链[34]的负电荷之间的静电稳定有助于键的裂解。与鸡溶菌酶[35]的情况类似，人溶菌酶中Glu35的异常高pKa可以认为部分原因是空间相邻残基Trp109提供的疏水环境(图1B)。

为了检验这些含有羧基的残基在多糖底物水解过程中精确侧链位置的重要性，将Glu35和Asp53残基分别替换为Asp和Glu[36-38]。任何一种替代都大大降低了对两者的水解活性黄体细胞底物和可溶性几丁质型底物，乙二醇几丁质。与Asp53取代Glu相比，Glu35取代Asp的催化活性降低程度更为显著。人溶菌酶with Glu53 mutation still showed 3.4% activity relative to wild-type enzyme against a chitin oligosaccharide substrate, p-nitrophenyl N-acetylchitopentaoside at 37^°C, pH 5.0，反应时间30 min，初始浓度为1.3 μM和0.22 mM时，酶和底物浓度分别为[39]。这种酶活性降低的程度与突变鸡溶菌酶的情况相当，其中相应的残基(Asp 52)被替换为Asn，而不是m .危害底物(5.5±2.5%)[40].;在terestingly, the relative activity of Glu53 mutant human lysozyme significantly decreased as the reaction time was prolonged (1.0 h, 1.0%; 2.0 h. 0.7%). Significant denaturation of the mutant enzyme was unlikely to occur within the reaction time, judging from the expected high thermostability under this pH condition [14]. Also, dissociation constants for either N-acetylchitotriose or N-acetylchitohexaose in solution were essentially kept between wild-type and Glu53 mutant enzymes [39]. Therefore, the above results might suggest that a half-covalent type intermediate was produced during the reaction in the case of Glu53 mutant, which would take much longer time to be cleaved as compared to the detachment of the intermediate simply stabilized by electrostatic interaction between the negative charge of Asp53 side chain and oxocarbonium ion intermediate of the substrate. The optimal pH of Glu53 mutant againstm .危害细胞底物与野生型相似，但与野生型酶[39]相比，碱性侧的相对活性更低。另一方面，Asp35突变体的相对V约为0.003%_马克斯/ K_米与野生型酶抗的价值相当m .危害30时的细胞底物^°C, pH 6.4。该底物的最佳pH值与野生型酶相比没有显著变化，但在酸性和碱性侧相对活性的降低在[38]的情况下更为突出。据报道，在类似的反应条件[40]下，鸡溶菌酶的同源酶Gln35突变体的比活性与具有相同底物的野生型(Glu35)酶相比为0.1±0.1 %。通过x射线晶体学确定了Asp35[38]和Glu53[41]突变体的详细结构，从等效α-碳原子的位置变化来看，与野生型人溶菌酶相比，整体结构没有明显变化。上述结果表明，Glu35和Asp53两个侧链羧基的精确定位是人溶菌酶高效催化的关键。

Trp109侧链的范德华接触是决定Glu35侧链精确定位的重要因素。Asp35突变体、Ala35突变体、Phe109突变体和Ala109突变体在110 ~ 118残基、110 ~ 120残基、104 ~ 115残基和100 ~ 111残基区域的等效α-碳原子分别在0.67 Å ~ 1.0 Å范围内发生了明显的移动。在所有情况下，整个分子的等效α-碳原子的均方根差小于估计的坐标误差(0.2 Å)。局部运动引入的突变109^th残留导致突变体ph109和Ala109的Vmax值大幅下降(分别下降13%和16%)m .危害细胞底物，同时保持其亲和力[38]。这表明范德华接触可以有效地将野生型酶中Glu35的侧链羧酸基固定在糖苷氧原子质子化的最有效位置。对两者的催化活性有类似的降低m .危害据报道，Val110对Pro突变[42]的人溶菌酶对n -乙酰壳聚糖配体的亲和力没有显著改变。该残基位于Trp109旁边，也位于子位点D附近(图1B)。我们可以合理地假设，突变引入的Glu35羧酸基位置的扰动是该情况下催化活性降低的原因，因为使用圆二色光谱没有检测到整体构象的显著变化。

Tyr63的芳香侧链基团对于识别B亚位点上的碳水化合物底物至关重要:

人溶菌酶有一个深裂口，有6个子位点a到F，每个子位点都可以容纳n -乙酰氨基葡萄糖残基或n -乙酰muramicacid残基(仅包含B、D和F子位点)(图1B, 1D)。到目前为止，与几丁质型低聚糖配合物的x射线结构可用于人溶菌酶。人溶菌酶与n -乙酰壳聚糖在pH 4.0共晶的x射线结构显示，六糖被裂解为四糖和二糖，分别占据A ~ D亚位点和在鸡溶菌酶建立模型的基础上提出的E和F亚位点附近的位置[43]。n -乙酰壳聚糖被认为以两种不同的模式结合人类溶菌酶，通过核磁共振分析，子位点A到C和子位点B到D。在两种识别模式中，子位点B的Tyr63被认为在底物识别[44]中起着核心作用。

为了解析Tyr63侧链结构元件在人溶菌酶催化作用中的功能作用，将Tyr63替换为Phe、Trp、Leu或Ala[45]。x射线结晶学分析表明，上述突变除了使63残基侧链结构发生变化外，没有引起明显的变化。而溶解活性对m .危害在这两种突变中，细胞底物均保持不变，对不带电几丁质型底物的相对活性在很大程度上取决于第63残基是否是芳香族氨基酸。n -乙酰壳聚糖的抑菌活性实验也证实了这一点。通过对野生型酶对不带电荷的可溶性几丁质底物乙二醇几丁质的相对活性和对带负电荷的可溶性几丁质羧甲基几丁质[37]的相对活性的比较，进一步说明了静电相互作用对催化活性的影响。Leu63突变体对乙二醇几丁质的相对活性为7±4%，显著低于对羧甲基几丁质的相对活性36±5%。对对硝基苯n-乙酰壳戊糖苷底物[45]催化活性的比较明确地证明了63位芳香族残基对几丁质型底物的重要性。定量催化效率参数k_猫/ K_米,pH 5.0下，37^°野生型人溶菌酶(Tyr63) C在250±80 M范围内略有变化^－1年代^－1至130±30 M^－1年代^－170±16 M^－1年代^－1ph63突变体和Trp63突变体，分别对应于的催化G值0.4±0.4 kcalmol^－1和0.8±0.3 kcalmol^－1．而Leu63突变体和Ala63突变体的kcat/Km值为4.3±2.0 M^－1年代^－16.4±4.9 M^－1年代^－1，对应的G值为2.6±0.6 kcalmol^－1和2.5±0.8 kcalmol^－1．此外，由于63残基芳香侧链的缺失，对硝基苯n -乙酰壳戊糖苷裂解模式的偏好也从4:1显著转变为3:2，这表明a、B、C和D子位点与E和F子位点对该底物的相对总亲和力大幅降低。

双糖位点特异性共轭衍生物的x射线结构分析:

为了进一步研究在人溶菌酶配体识别事件中，结合在B亚位点的碳水化合物残基与Tyr63残基之间相互作用的功能作用，人溶菌酶衍生物位点特异性结合了三种二糖的2′，3′-环氧丙基β-糖苷衍生物，即n-乙酰壳聚糖(GlcNAc-β 1,4 -GlcNAc)， n-乙酰乳酸胺(Gal-β 1,4 -GlcNAc)和β- 1,4连接甘露糖基n-乙酰葡萄糖胺(Man- β 1,4 -GlcNAc)，是合成的。利用x射线晶体学分析了这三种位点特异性标记的人溶菌酶的详细结构[46,47]。所有的共轭都是通过与Asp53侧链羧酸基团形成酯连接进行的。与β- 1,4连接的n -乙酰氨基葡萄糖低聚物[46]的未共轭复合物相比，共轭复合物中n -乙酰壳聚糖部分糖苷键的几何结构基本相同。C亚位点n -乙酰氨基葡萄糖残基的结合模式完全维持，因此认为位点特异性标记反应是通过识别C亚位点n -乙酰氨基葡萄糖残基进行的m .危害细胞底物发生偶联。Gal-β 1,4-GlcNAc和Man- β1,4-GlcNAc的2 '，3 ' -环氧丙基β-糖苷存在时，人溶菌酶的剩余溶菌活性半衰期比GlcNAc-β 1,4-GlcNAc[47]的相应衍生物延长了约两倍。这显然表明前两个衍生物的亲和性弱于后者，这应该归因于B子位点亲和性的差异。

三维结构的比较揭示了底物识别特异性在B亚位点的起源。n -乙酰壳聚糖偶联人溶菌酶B亚位点n -乙酰葡萄糖胺残基的极面显示了几乎平行于Tyr63的酚侧链基团的堆叠几何(图2A)，使得B亚位点[48]可能存在5种CH-π相互作用。相比之下，n -乙酰乳酸胺偶联人溶菌酶中B亚位点的半乳糖残基与Tyr63的酚侧链基团之间的平行度明显较差(图2B)， B亚位点上可能的CH-π相互作用减少到4[48]。协同作用下，Asp102侧链上可能的直接氢键对应物由6-OH基转变为半乳糖残基[46]的轴向4-OH基。此外，还测定了Leu63突变体人溶菌酶与n -乙酰壳聚糖的2′，3′-环氧丙基β-糖苷结合的三维结构。由于Tyr63被Leu取代，B亚位点上的糖基残基与63残基侧链基团间CH-π相互作用被取消，Leu63突变偶联物B亚位点上的n -乙酰葡萄糖胺残基相对于野生型人溶菌酶中n -乙酰葡萄糖胺残基的相对位置明显远离Leu63的侧链。上述结果表明，CH-π相互作用和传统氢键相互作用的协同性是人溶菌酶B亚位点底物识别特异性的起源，并清楚地证明了芳香侧链基团对识别过程的直接贡献。

图2。芳香氨基酸残基与碳水化合物残基之间的堆积几何。原子坐标数据从PDB中获得。只有空间填充模型的相关残基以原子颜色表示(红色，氧;灰色,碳;蓝色，氮)和标记。图A，人溶菌酶结合2,3 ' -环氧丙基β-糖苷的GlcNAc-β 1,4 -GlcNAc (PDB ID: 1rey);B组，人溶菌酶与2,3 ' -环氧丙基β-糖苷Gal-β 1,4 - glcnac (PDB ID: 1rez)结合;C组，人溶菌酶与2,3 ' -环氧丙基β-糖苷of Man-β 1,4 - glcnac (PDB ID: 1rem)结合;D图，戊二醛交联WGA-3配合GlcNAc-β 1,6 - gal (PDB ID: 1k7t)。

与GlcNAc-β 1,4 -GlcNAc相比，与Man-β 1,4 -GlcNAc的偶联反应速率较低，尽管降低了亲和力，但甘露糖残基与Tyr63侧链的平行度保持了[47](图2C)，并且B子位点上可能的CH-π相互作用的总数没有改变。Gln104侧链与n -乙酰氨基葡萄糖残基B亚位点羰基氧原子之间原本可能的直接氢键丢失，但Gln104发现甘露糖残基的轴向2-OH基团作为新的氢键对应物。因此，Man-β 1,4 - glcnac的亲和力较n-乙酰壳聚糖弱，可能是由于CH-π相互作用和直接氢键相互作用的总数以外的因素，这些因素仍有待进一步研究。

Arg115带正电侧链对E和F子位点亲和力的重要性:

经构象能计算[50]表明，鸡型溶菌酶催化裂口E和F亚位点的底物结合有两种不同的识别可能性。一种是涉及裂隙“右侧”区域的生产性结合模式，另一种是非生产性结合模式，涉及裂隙“左侧”区域。后一种结合模式被报道为鸡溶菌酶中底物的初始结合模式，使用定向突变研究[51]。在人溶菌酶中，负责前一种结合模式和后一种结合模式的对应区域分别为Arg115残基和Trp34残基，以及Tyr45残基、Asn46残基和Ala47残基(图1B)。在最初的鸡溶菌酶与n -乙酰壳聚糖复合物的模型构建研究中，认为鸡溶菌酶中的Arg114与人溶菌酶中的Arg115对应，在F[30]亚位点与n -乙酰氨基葡萄糖残基形成双氢键。　

为了研究Arg115在人溶菌酶中的作用，将该残基替换为Lys、His、Gln或Glu，并通过检测其对人体溶菌酶的催化活性来评估其对酶功能的影响m .危害细胞和乙二醇几丁质底物[52]。既不是表观Km值，也不是相对的Vmax值m .危害用Lys取代Arg115对细胞有显著影响，这表明Arg115与F亚位点n -乙酰氨基葡萄糖残基之间的特定氢键相互作用实际上在该底物水解中无效。上述突变体人体溶菌酶对乙二醇几丁质的活性主要依赖于115的电荷状态^th残渣。相比之下，全保留活性(90±2% ~ 105±4%)的情况下，侧链为115^th残基保持正电荷状态，净电荷为115时，与野生型酶的相对活性显著降低(58±5% ~ 78±2%)^th在侧链带负电荷的情况下，残渣逐渐变为中性，并进一步减少(49±3% ~ 58±3%)。这些结果清楚地表明，人类溶菌酶Arg115的重要作用并不在于提供与F亚位点碳水化合物残基的氢键相互作用，而是在于拥有一个正电荷以维持F亚位点周围底物识别所必需的局部结构。

通过对His115和Glu115突变体在pH值4.5[53]下结晶的x射线结构分析，得到了这一假设的直接结构证据。在此pH条件下，His115残基被质子化带正电荷，Glu115侧链羧酸基被解离带负电荷。His115突变体的主链结构与野生型人溶菌酶相同，而Glu115突变体的主链位置在人溶菌酶E和F亚位点催化裂口“右侧”的第100 ~ 130残基区域与野生型有较大差异。Glu115突变引入的这种结构变形被认为是源于115侧基相互作用模式的差异^th残基和空间相邻的Trp34侧链基团。His115突变体的正电荷咪唑基与野生型人溶菌酶Arg115的胍基共用一个平面，因此它们可能保持一种阳离子-π相互作用。另一方面，Glu115的羧酸基团远离Trp34的吲哚环表面，似乎避免了负电荷与π电子的接近。

鸡型溶菌酶，包括人溶菌酶，不仅催化底物的水解，还催化涉及水解反应产物的转糖基化反应。转糖基化反应也用于对硝基苯基3的酶促合成⁵-O-β- n -乙酰氨基葡萄糖基-α-麦芽糖糖苷通过鸡溶菌酶[54]。与人溶菌酶的转糖基化反应最初是通过观察到n -乙酰壳聚糖和n -乙酰壳聚糖在3:2分裂情况下的净量，以及n -乙酰壳聚糖和n -乙酰葡萄糖胺在4:1分裂情况下的净量在实验时间过程中测量反应产物的量，n -乙酰壳聚糖[55]。假设发生转糖基化反应的虚拟计算机模拟进一步支持了这一观察结果。催化裂口中的子位点E和F负责转糖基化，因为当低聚糖产物与这些子位点结合并在水解反应中作为水分子的替代品与氧羰基中间体反应时，就发生了转糖基化反应。115度突变的影响^th通过比较野生型和115型的反应时间，验证了转糖基化反应的残留^thn -乙酰壳五糖和n -乙酰壳六糖底物的突变人溶菌酶[52]。在任何一种情况下，寡糖反应产物在pH 5.0时的量的时间过程的轮廓完全取决于115的电荷状态^th残渣侧链，反映了上述结构变化。

在表达催化活性时，亚位点A和B的“右侧”叶和亚位点A的“左侧”叶周围具有较高的结构灵活性:

在鸡溶菌酶中由卷曲环结构组成的潜在柔性区域中，在分子动力学模拟[56]中由102 - 104残基组成的区域观察到主链原子位置波动最大。鸡肉溶菌酶单斜晶晶的单位细胞中含有两个独立的分子，其中第100 ~ 104个残基之间存在显著的结构变异[57]。据报道，Pro103残基在人溶菌酶中被Gly[14]取代，对酶的热力学稳定性影响不大。

从100开始的区域^th到104年^th在催化裂孔中，Asp102残基形成了亚位点A和B的“右侧”叶(图1B)，而人溶菌酶中的Asp102残基被认为通过其侧链羧酸基[43]与碳水化合物部分发生氢键相互作用，有助于特异性识别位于A和B亚位点的n -乙酰氨基葡萄糖胺残基。为了检验这一区域结构完整性的功能重要性，我们将人溶菌酶中的Asp102替换为Asn或Glu。此外，还获得了一个缺失突变体Pro103。与野生型酶相比，这些突变体均表现出相当大的残馀活性m .危害衬底。催化效率参数V_马克斯/ K_米Asn 102、Glu102和Pro103突变体的值分别为野生型人溶菌酶的76%、40%和55% (M. Muraki，未发表结果)。鸡肉溶菌酶(Asp101)中相应残基的变化也与用Gly替换火鸡溶菌酶中的Asp101有关。在这两种酶中，n -乙酰壳聚糖在A、B和C子位点结合的方式基本相同，尽管侧链基团101个不同^圣<残留[58]。在人溶菌酶的A子位点附近插入4 ~ 12个含有Arg-Gly-Ser序列的序列，插入到Val74和Asn75残基之间[59]的位置，也表明了结构的灵活性。这些残基几乎位于衬底结合裂缝中A子位点的“左侧”瓣(图1B)，并参与了一个线圈区域(图1A)。所有含有插入序列的突变体都保持了几乎相同的相对裂解活性(85 ~ 109%)m .危害细胞底物与野生型酶的比较。

净分子表面电荷的增加和减少改变了pH值和离子强度对水解活性的依赖性m .危害细胞基质:

如上所述，静电相互作用对识别起着至关重要的作用m .危害细胞底物由人溶菌酶。鸡溶菌酶[60]的乙酰化最初指出了溶菌酶表面碱性氨基酸残基在对该底物的溶解活性中的重要性。计算机程序辅助计算整个人溶菌酶分子的静电势，显示该蛋白的分子表面除催化残基附近大部分带正电荷(图1C, 1D)。

在不同种源的鸡型溶菌酶中，尽管分子大小保持得很好，但在氨基酸残基上仍存在一些差异。例如，在狒狒、牛和鸡的溶菌酶上，分别有14、41和52个aa残基替换，其中130个aa残基被人溶菌酶删除。利用氨基酸残基的这些差异和三维结构的信息，通过位点定向诱变产生了几个突变的人溶菌酶，这些突变的分子表面正电荷有一个或两个单位的增加和减少，以检测它们对抗性的溶解活性的影响m .危害细胞底物[61]。总的来说，正电荷的增加和减少使野生型酶在最优pH条件下的最佳离子强度分别向更高和更低的方向移动。两种具有双氨基酸残基替代的突变酶也被创造出来。一种是由于Val74替换为Arg, Gln126替换为Arg，正电荷增加了两个单位;另一种是由于Arg 41替换为Gln, Arg101替换为Ser，正电荷减少了两个单位。即使正电荷只有两个单位的变化，这些突变体在几种离子强度条件下与野生型人溶菌酶表现出完全不同的pH-溶解活性谱。结果表明，在较高的pH值和离子强度条件下，(Arg74+Arg126)突变体的裂解活性明显高于野生型酶。与野生型人溶菌酶相比，(Gln41+Ser101)突变体在低pH和低离子强度条件下具有更好的催化剂作用。随后报道了具有n端额外赖氨酸残基的突变体的类似观察结果[62]。这些观察可以解释为酶和之间的最佳静电相互作用的存在m .危害表达最大裂解活性的细胞底物。

此外，多聚l -赖氨酸盐酸盐的共存对上述人体溶菌酶的溶解活性有显著影响，其影响程度取决于野生型和突变型人溶菌酶的净表面正电荷，而加入等量的单体l -赖氨酸盐酸盐对其溶解活性没有影响[61]。这表明，溶解活性可以通过聚电解质的存在来控制，这也意味着有可能通过工程设计人溶菌酶的表面电荷来增强存在聚电解质的溶解活性。事实上，这种可能性在一个带有Arg101到Asp和Arg115到His双重突变的低正电荷突变体中被证明是正确的，在对细菌的溶菌活性的最大抑制浓度值增加了3倍，7倍和43倍m .危害三种聚阴离子电解质海藻酸盐、粘蛋白和DNA的细胞底物，分别为[5]。从医学角度来看，值得注意的是，这种突变体对一种临床重要的革兰氏阴性细菌保留了98.5%的相对活性，铜绿假单胞菌。海藻酸盐是构成生物膜的主要粘多糖成分，与该致病菌引起的医院感染密切相关。通过x射线晶体学确定了上述表面静电势重塑双突变体的详细三维结构[63]。基于分解结构的静电势分析表明，负势场明显扩大，局限于衬底结合裂隙内部和周围。

使用位点特异性化学修饰改变催化和配体结合特性:

化学修饰是改变酶分子功能特性的一种有效方法。通过在人溶菌酶表面引入一个游离巯基，随后与含有两个马来酰亚胺基团的化合物反应，实现了位点特异性的分子间交联[64]。以Cys取代Arg41或Ala73中的一个残基，与N, N’-双(3-马来酰亚胺丙酸基)-2-羟基- 1,3 -丙二胺反应。在两个Cys41突变体、一个Cys41突变体、一个Cys73突变体和两个Cys73突变体之间建立了三种位点特异性交联的人溶菌酶二聚体。其中，只有Cys41-Cys41二聚体表现出与单体野生型酶和其他二聚体酶学性质的改变。Cys41-Cys41二聚体对几丁质型低聚物底物-对硝基苯n-乙酰壳戊糖苷的活性显著降低(野生型的38±3%)，而对几丁质型高分子底物-乙二醇几丁质的活性保持(野生型的87±5%)。因此，Cys41-Cys41二聚体相对于后一种底物的相对活性比相对于前一种底物的相对活性为2.3±0.3。相比之下，Cys41-Cys73二聚体和Cys73-Cys73二聚体的比值分别保持在1.0±0.1和1.1±0.1。在terestingly, the activity of the Cys41-Cys41 dimer against the oligomer substrate was enhanced as the ionic-strength of the reaction medium increased in spite of non-charged property of the substrate, whereas those of the other dimers were essentially constant [64]. The above results may be explained by the spatial proximity of two catalytic clefts of the monomer parts in the Cys41-Cys41 dimer. In the hydrolysis of p-nitrophenyl N-acetylchitopentaoside, the resulting products, such as N-acetylchitotriose and N-acetylchitotetraose, were no longer a good substrate, but were effective inhibitors, since these products still retain the similar affinity for the catalytic cleft to that of the original substrate. The difference in ionic-strength of reaction medium can alter the degree of spatial proximity of the two catalytic clefts in the dimer, which would affect the efficiency of the inhibition. In spite of the presence of two carbohydrate binding sites in the human lysozyme dimers, none of them showed hemagglutination activity toward blood red cells (M. Muraki, unpublished result). This observation was consistent with the result that only the oligomers bigger than the trimer of non-specifically cross-linked chicken lysozyme behaved as lectin-like molecules [65].

另一个有趣的结果是野生型和Glu102突变的人溶菌酶与n -乙酰乳酸胺的2′，3′-环氧丙基β-糖苷的位点特异性结合[66,67]。人类溶菌酶活性位点裂口的双重标记是通过第一配体辅助第二配体识别发生的。在这两种情况下，第一个配体部分和第二个配体部分分别共价连接到Asp53残基和Glu35残基的侧链羧酸基上。第二配体部分与第一个配体部分平行，两部分之间通过氢键网络和van der Waals相互作用进行了密切的原子接触，这得到了第一配体部分与蛋白质部分之间可能存在的氢键和CH-π相互作用的有力支持。

由网状结构域组成的植物凝集素

碳水化合物结合蛋白通过识别各种类型的致病细胞和免疫细胞具有治疗潜力

从多种植物器官包括胚芽(如WGA)中分离到由he静脉结构域组成的凝集素分子小麦)[68]，根(例如PWM from商美国)[69]，根茎(如UDA fromUritica dioica)[70]，树皮(例如Ee-CBP from欧卫矛)[71]，乳胶(如Hevein from)的橡胶树割面干涸病[72]和种子(如Ac-amp2 from苋属caudatus)[73]。这些蛋白质分子特异性地识别n -乙酰氨基葡萄糖寡聚物结构，这些结构存在于免疫细胞和病原微生物的共同表面。在这篇综述中，作者重点研究了其中的三种代表性分子，即WGA、UDA和Ac-amp2。

1963年，WGA被发现是小麦胚芽脂肪酶制剂中的一种成分，它可以选择性地凝集恶性细胞[74]。WGA显示的癌细胞特异性进一步被表征为来自正常细胞向恶性细胞转化过程中细胞表面的变化[75]。然后发现癌细胞对WGA的耐药性与黑色素瘤[76]和肉瘤[77]衍生的肿瘤细胞系的转移特性密切相关。由于这种基于碳水化合物结合特异性的细胞识别特征，WGA已被用于使用纳米颗粒的许多生物医学应用的实验。这种类型的应用包括通过鼻内给药靶向大脑[78]和癌细胞的光致发光成像分析[79]。WGA不仅对胰腺癌[80]、结肠癌[81]、白血病[82]等多种癌细胞具有特异性结合作用，而且具有细胞毒作用。细胞毒性被认为是由独立于Fas受体和caspase 3的线粒体途径诱导与G2/M期细胞周期阻滞相关的凋亡引起的[83,84]。另一个与治疗应用相关的WGA功能包括抑制叶性天疱疮患者抗纤凝蛋白1的致病IgG自身抗体的结合[85]。

WGA是小麦面粉中含有的膳食分子，是小麦胚芽的组成部分，可通过影响胃肠道上皮细胞的免疫反应而显著影响人体健康。一项生物物理研究表明，这种高度稳定的蛋白质分子在胃中的pH值较低时部分展开，但一旦到达肠道，就会再次达到其完全活跃的构象[86]。这种特性使得WGA作为口服给药载体具有吸引力，因为它能特异性地与胃肠道上皮细胞表达的糖结合[87]。在这方面，纳米摩尔浓度的WGA刺激人外周单个核细胞中促炎细胞因子的合成也很有趣[88]。

1984年，UDA被发现是一种植物凝集素，对人类淋巴细胞具有诱导干扰素γ的活性[70]。UDA是六种等凝集素的混合物，它们都具有相同的分子大小、碳水化合物结合的特异性和凝集特性。所有的等凝集素都显示出相同的人类干扰素γ诱导活性，这应该会增强淋巴细胞的抗病毒功能[89]。事实上，研究表明，该凝集素分子对许多严重的致病病毒具有很强的抗病毒活性，包括人类免疫缺陷病毒[90]、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒[91]和登革病毒[92]。UDA与其他植物凝集素最显著的区别之一是，这种t淋巴细胞有丝分裂凝集素通过使用MHC类I抗原和MHC类II抗原作为受体，表现为一种针对Vβ 8.3+ t细胞群的超级抗原[93]。研究证明，在自身免疫模型MRL中，使用UDA删除Vβ 8.3+ t细胞可以阻止系统性红斑狼疮样疾病的发展lpr / lpr小鼠Fas受体基因发生纯合突变[94]。有趣的是，UDA与MHC II类的结合被其特定的碳水化合物配体n -乙酰壳聚糖以剂量依赖的方式完全抑制[95]。在刺荨麻提取物中，也有研究认为UDA是一种安全的抗前列腺肥大剂，是一种主要的治疗成分[96]。

Ac-amp2是1992年首次被分离出来的一种抗微生物蛋白，对植物病原真菌有较强的生长抑制活性葡萄孢菌而且镰刀菌素culmorum[73]。该几丁质结合蛋白在其6个Cys残基的不变定位辅助下，在主序列的排列上与hevein具有结构同质性，因此被认为是一个截断hevein结构域。该分子对一些革兰氏阳性菌也表现出抑制活性，包括芽孢杆菌megaterium,但对革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌。由于Ac-amp2分子较小，常被归类为抗菌肽[97]。这类蛋白是治疗免疫抑制的系统性真菌感染患者的一种有前途的新型潜在疗法，因为抗微生物肽由包括人类在内的多种生物产生，在保护宿主免受病原体侵害方面发挥着重要作用[98]。值得注意的是，Ac-amp2浓度达到500 μg/ml时，对人脐内皮细胞或人皮肤肌肉成纤维细胞均未表现出细胞毒作用[73]。

一个微小的球状区域，没有扩展的二级结构:串联重复和截断

他静脉结构域的基本结构是一个由43个aa残基组成的小球状物，其中含有4个二硫桥，与人溶菌酶的情况相同。然而，由于该结构域的折叠结构呈球状且体积微小，无法容纳扩展的二级结构。属于这一类的几丁质结合凝集素在其主要结构中由单个或多个hevein型结构域串联重复组成。到目前为止，利用x射线晶体学和核磁共振分析已经揭示了WGA、UDA和Ac-amp2的三维结构。所有WGA等凝集素(WGA-1、2和3)的晶体结构已通过x射线晶体学确定[99,100]。结果显示，WGA是一种尺寸为40 x 40 x 70 Å的二聚体蛋白，由两个相同的171个aa残基多肽原聚体组成，每个原聚体由其n端起的四个hevein型结构域组成，分别为a、B、C和D结构域(图3A)。另一方面，UDA是一个由两个串列重复的hevein结构域组成的单体蛋白，共有89个aa残基，其中两个结构域之间有一个由4个aa残基组成的铰链区(图3B)。迄今为止，已经阐明了两种等凝集素(质谱分析鉴定的UDA-I和VI)的详细晶体结构[101,102]。UDA中两个hevein型结构域的主链结构和四个二硫键桥可以很好地相互叠加，但这两个结构域的整体空间取向与WGA的第一和第二结构域完全不同[101]。Ac-amp2是c端hevein型结构域的截断版本，在30个aa残基的紧凑结构中包含3个二硫键桥(图3C)[73]。 The three-dimensional solution structure delineated by NMR analysis displayed strong homology to the domain B of WGA concerning the main-chain structure [103].

图3。植物凝集素由hevein型结构域组成的三维结构。原子坐标数据从PDB中获得。二级结构呈带状，二硫键呈束状。面板A, WGA-3 (PDB ID: 1wgt, x射线模型);面板B, UDA-VI (PDB ID: 1ehh, x射线模型);面板C, Ac-amp2 (PDB ID;1mmc, 26个NMR模型重叠)。D图中显示了文中提到的结合n -乙酰壳聚糖(黄色)和aa残基(粉色)的结构。在UDA-VI中标注了相关的aa残基名称。标签A, B和C表示从非还原端开始的三个n-乙酰氨基葡萄糖残基。

从自然资源中分离、重组生产和化学合成

迄今为止，用于生化分析由肝素型结构域组成的凝集素的样品最方便地从含有目标凝集素的植物组织中分离出来。这可能是因为与人类蛋白质不同，植物中含有的原料通常易于大量获取。从植物原料的粗水提取物中分离凝集素的常用方法是亲和层析，例如使用卵母样琼脂糖提取WGA[104]或使用几丁质粉提取UDA[70]。有必要使用离子交换色谱法或反相色谱法进行进一步分馏，以获得WGA和UDA的纯等凝集素，因为亲和纯化材料是等凝集素的混合物。在的case of Ac-amp2, it was possible to obtain a pure sample directly using two steps of anion-exchange and cation-exchange chromatography without the necessity of affinity purification step by virtue of its highly basic character (pI > 10) [73].

利用分泌性表达建立了重组WGA-2的制备方法酿酒酵母[105]。在该系统中，需要使用一种特殊的菌株KS58-2Ddel来保持ssl1突变，导致人溶菌酶的超分泌表型，高效(150~200 μg/l)分泌功能WGA-2。这种分泌量进一步增加了3 - 4倍的蛋白二硫异构酶基因从酿酒酵母。相比之下，使用亲本野生型菌株KK4，即使使用相同的鸡溶菌酶衍生信号序列，分泌量也减少到1/20。另一种酵母分泌系统由酿酒酵母α-因子前信号序列和酵母分泌系统组成p . pastorisGS115宿主菌株能成功分泌人溶菌酶，但不能分泌功能性WGA (M. Muraki，未发表结果)。高度同源蛋白大麦凝集素与WGA有95%的同源性大肠杆菌[106]。利用氧化还原性谷胱甘肽组成的氧化还原缓冲体系，成功地将细胞内积累的蛋白作为包衣体进行还原，最终从1g纯化的功能蛋白中获得400~500 μg大肠杆菌细胞。将得到的重组大麦凝集素结晶化。使用谷胱甘肽氧化还原缓冲系统对非活性蛋白的再折叠策略也适用于单一的肝素型结构域蛋白WIN2[107]和Ac-amp2[108]。在这种情况下，使用9-芴甲基羰基多肽合成化学方法制备了具有每个相应初级序列的多肽，然后重新折叠成天然的三维结构。使用乙酰氨基甲基保护基团结合醋酸汞(II)脱保护和反相柱层析纯化是制备功能产品的必要条件。报道了WAMP-1a的另一种可能的制备单一hevein型结构域凝集素的方法，该方法使用与硫氧还蛋白融合蛋白的表达大肠杆菌[109]。通过溴化氰裂解和随后的反相色谱分离，成功地纯化了含有5个二硫桥的黑素型结构域，从而获得了最终产量为每升约8毫克的功能产物。

碳水化合物配体识别机制的结晶学和溶液研究

在开创性地研究了WGA与n-乙酰壳聚糖、n-乙酰壳聚糖和n-乙酰神经氨酸配合物的x射线晶体结构分析[110]后，主要利用x射线晶体学和核磁共振分析对由hevein型结构域组成的凝集素分子的碳水化合物配体识别机制进行了结构阐明。

在这类凝集素中，对WGA等凝集素进行了最广泛的研究。n -乙酰神经氨酸乳糖(NeuNAc-α 2,3 - gal -β 1,4 - glc)与WGA-1和WGA-2的复杂结构(2.2 Å分辨率)[111]，红细胞膜糖蛋白A中含有t5 -四糖的糖肽(NeuNAc-α 2,3 - gal -β 1,3 - galnac -α 2,6 -NeuNAc)与WGA-1的复杂结构(2.0 Å分辨率)[112]，GlcNAc-β 1,6 - gal, GlcNAc-β 1,6 - gal -β 1,4 -GlcNAc与戊二醛交联WGA-3的复杂结构(2.4,2.2和2.2 Å分辨率)，分别)[113]已通过x射线晶体学测定。所有碳水化合物结合区几乎都集中在B结构域和C结构域之间的接触区，属于每个不同的原聚体，由四个hevein型结构域组成。最近，通过对合成的二价GlcNAc配体与WGA-3配合物的晶体学分析，所有理论上预测的WGA中的8个碳水化合物结合位点都被发现同时具有功能[114]。

值得注意的是，n-乙酰壳寡糖中GlcNAc的非还原端与n-乙酰神经氨酸残基的位置基本相同，其碳水化合物部分总是发生三种特定的极性氢键相互作用。分别是WGA结构域B中n -乙酰酰胺基团的羰基氧原子与Ser62的oh -基团之间的氢键，WGA结构域B中3-OH基团与Tyr73的oh -基团之间的氢键，WGA结构域C中n -乙酰酰胺基团的氨基氮原子与Glu115的羧酸基之间的氢键[115]。通过调整这一取向，Ser114中涉及oh基团的氢键对应物从n -乙酰氨基葡萄糖残基的4-OH基团转变为n -乙酰神经氨酸残基的羧酸基。WGA识别碳水化合物配体的另一个重要方面是结合位点上存在三个芳香aa残基(WGA-1存在Tyr64、Tyr66和Tyr73, WGA-1和WGA-3存在Tyr64、His66和Tyr73)。如图2A-2C所示，在人溶菌酶B亚位点识别糖基，芳香侧链基团可以通过多次CH-π相互作用形成面对面的堆叠接触，这在很大程度上有助于通过调节糖苷的二面角来确定碳水化合物-配体构象的方向，使蛋白质部分与配体部分达到最佳匹配。这种策略基本上存在于配合物的所有结构中，并通过与GlcNAc-β 1,4 -GlcNAc配合物的戊二醛交联WGA-3的识别模式与与GlcNAc-β 1,6 - gal配合物的识别模式的比较明显地表现出来[113]。GlcNAc-β 1,4 -GlcNAc代表甲壳素的二糖部分结构，与之相比，GlcNAc-β 1,6 - gal在两个六原子环之间的糖苷氧附近有一个额外的亚甲基基团。然而，后者配体在溶液中表现出的亲和力并不比前者差。结晶学分析表明，这是通过调整两个六个原子组成的碳水化合物环之间的键的构象来实现的，以最佳地拟合到Tyr64和His66的侧链上，这两个侧链通过面对面的堆叠接触参与了碳水化合物配体的识别过程(图2D)。

UDA是一种由两个hevein型结构域组成的单体凝集素，其与两种碳水化合物配体n-乙酰壳聚糖[101,116]和n-乙酰壳聚糖[116]的复合物结构分别在1.9 Å和1.4 Å进行了x射线晶体学研究。在四糖配合物中，非还原性端第1 - 3个n-乙酰氨基葡萄糖残基的位置与三糖配合物中的位置重叠，使得第4个n-乙酰氨基葡萄糖残基突出在分子外，与蛋白质部分没有明显的密切接触。在UDA隔离素VI - n-乙酰壳聚糖配合物的晶体结构中，配体以n端和c端两个hevein型结构域夹在一对UDA单体之间。在最近确定的来自商陆的PL-D2的晶体结构中也观察到同样的情况，商陆是另一种单体凝集素，由两个黑醋栗型结构域组成，与n-乙酰壳聚糖配合物[117]。同样在UDA中，也观察到与WGA相似的策略用于配体的n -乙酰壳聚糖部分的识别(图3D)。在这种情况下，Cys24的主链羰基氧和n端焦谷氨酸基侧链通过非还原端第一个n-乙酰氨基葡萄糖残基发生了特定的极性氢键相互作用。在配体的第二个n -乙酰氨基葡萄糖残基与Ser19和Tyr30侧链oh -基团之间还观察到其他氢键相互作用。Trp23和Trp21的侧链分别通过CH-π与第2和第3个n -乙酰氨基葡萄糖残基的相互作用实现了面对面的堆叠接触。

另一方面，单一hevin型结构域集素分子识别机制的结构信息主要通过核磁共振分析进行研究，其中包括与n-乙酰壳聚糖配合物hevin、假hevin和Ac-amp2的核Overhauser效应光谱实验[118,119]。从这些实验中得到的结果证实了三个保守的芳香aa残基和一个丝氨酸残基在配体结合位点上的重要作用，这是由WGA和UDA的结晶学实验所揭示的。WGA中与Tyr64、His66/Tyr66、Tyr73和Ser62结构对应的残基分别为Trp21 (UDA)/Phe18 (Ac-amp2)、Trp23 (UDA)/Tyr20 (Ac-amp2)、Tyr30 (UDA)/Tyr27 (Ac-amp2)和Ser19 (UDA)/Ser16 (Ac-amp2)。因此，在配合物的x射线结构测定中得到的碳水化合物配体识别机制的结论也被证明适用于溶液中的相互作用。

等温滴定量热实验和核磁共振滴定实验是评价凝集素-碳水化合物相互作用的强度和定量热力学参数的有价值的方法。对于WGA[120]、UDA[121]和hevein [122]， ITC实验测定的n -乙酰壳寡糖的关联常数通常随着配体长度的增加而增加，这也得到了核磁共振滴定实验的证实[122]。而在相同溶剂条件下的ITC实验表明，n -乙酰壳聚糖对UDA的结合焓远小于WGA，更接近于he - vein的结合焓。此外，n -乙酰壳寡糖与WGA的结合焓值总是与UDA的结合焓值的两倍以上，而两者的结合自由能值基本相同[121]。这些结果表明，尽管在UDA - n -乙酰壳聚糖/ n -乙酰壳聚糖配合物的晶体结构中观察到夹状结构，但UDA在溶液中作为碳水化合物配体的单体粘结剂。已知含有GlcNAc-β 1,6 - gal或GlcNAc-β 1,6 - galnac序列的n -乙酰乳酸氨基低聚糖与n -乙酰壳寡糖相比，对wga固定柱的结合强度并不弱[123]。事实上，ITC实验表明，与GlcNAc-β 1,4 -GlcNAc相比，GlcNAc-β 1,6 - gal的关联常数更大[113]。对于末端有唾液酸残基的低聚糖配体，核磁共振滴定实验表明，α-2,6-联n -乙酰神经氨酸乳糖及其对应的乳酸胺在溶液中与WGA的结合强度是α-2,3-联n -乙酰神经氨酸乳糖的数倍，但其具体机制尚不清楚[124]。除了ITC和NMR滴定实验外，通过平衡透析实验，配合x射线无配体三维结构分析，研究了位于两个原聚体B域和C域接触区域的Tyr73和Phe116的WGA-2突变体在n -乙酰壳聚糖结合中的作用[125]。本研究表明，利用位点定向诱变技术在原聚体的接触位点引入一个新的氢键，可以增强对糖配体的亲和力。

为了评估Ac-amp2中两个芳香aa残基在配体识别过程中与碳水化合物残基极性面叠加的功能重要性，我们创造了几种突变体，包括对非天然aa残基的改变，并评估了它们对几丁质柱的亲和力[108]。其中，一些具有较大芳环侧链的残基，如Trp、β-(1-萘基)丙氨酸和β-(2-萘基)丙氨酸的突变使其对几丁质的亲和力增强。相反，β-环己基丙氨酸和丙氨酸残基的突变导致了ph18侧链的去芳构化和苯环的丢失。Trp18和β-(2-萘基)丙氨酸突变体与野生型Ac-amp2结合强度增强，以n -乙酰壳聚糖为配体，通过核磁共振滴定实验进一步定量证实[126]。上述结果表明，通过调节堆叠芳香侧链与碳水化合物配体之间的CH-π相互作用，可以人为控制由hevein型结构域组成的植物凝集素的配体亲和力。

碳水化合物残基通常被认为是亲水的，作为一个完整的分子，由于存在许多羟基。然而，碳水化合物残基具有由轴向ch基组成的极面[127]。近年来，CH-π相互作用所支配的吸引力在包括蛋白质对碳水化合物分子的识别在内的多种生物大分子的功能结构形成和分子识别过程中发挥着重要作用[128]。每单个CH-π相互作用的净能量被认为比静电相互作用或传统的氢键相互作用小得多。然而，即使在水等极性环境中，它也是有效的，并且可以彼此相互合作，也可以与传统的极性氢键相互作用[129]。由hevein型结构域组成的植物凝集素的n-乙酰壳寡糖和人溶菌酶的几丁质型多糖底物等碳水化合物配体均无净静电荷，这使得CH-π相互作用在总结合能中的相对贡献变得显著，因此在识别事件中得到了突出。

人Fas配体和Fas受体的细胞外结构域

与人体许多严重疾病密切相关

人Fas受体和人Fas配体的编码基因分别于1991年[130]和1994年[131]被鉴定出来。死亡配体和死亡受体介导的几种细胞死亡诱导信号系统可引起人体内的细胞凋亡。其中，人Fas配体-人Fas受体系统是最重要的系统之一，它通过消除对身体有害的细胞，与维持人体健康有着严重的关系[132]。使用该系统的凋亡信号传导过程是由Fas配体(hFasLECD)的细胞外结构域与靶细胞表面存在的Fas受体(hFasRECD)的特异性结合所触发的。在生理学上，这种凋亡过程被认为直接参与了自然杀伤细胞和活化的t细胞对新兴癌细胞、病毒感染细胞和自身反应性免疫细胞的清除。因此，该系统不受控制的状态会在短时间内导致许多由免疫系统异常引起的严重疾病的发作，其中包括各种类型的癌症和自身免疫性疾病，如功能障碍的类风湿关节炎(RA)，功能过度的移植物抗宿主病(GVHD)、暴发性肝炎和脊髓损伤。已知由人Fas配体和Fas受体基因突变引起的正常淋巴细胞凋亡缺陷可导致称为自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)的疾病[133]。值得注意的是，hFasLECD对RA患者关节滑膜组织细胞的血管生成均有抑制作用在体外对于在活的有机体内通过诱导滑膜细胞凋亡暴露嵌入小鼠的Matrigels[134]。

Fas配体与Fas受体的结合在正常凋亡因某种原因被抑制的情况下也会产生非凋亡过程。例如，无论是在caspase 8缺失的细胞中，还是在caspase 8功能被抑制的细胞中，NF-κB通过受体相互作用蛋白1介导的细胞激活被认为是通过Fas配体与Fas受体结合而发生的[135]。Fas配体- Fas受体信号也被报道可诱导NF-κ b激活介导炎症细胞因子白介素8的产生[136]。NF-κB激活导致组织持续炎症可导致癌症的发生，慢性肝炎引起的肝癌就是一个很好的例子[137]。从临床角度来看，Fas配体- Fas受体系统的另一个重要方面是可能用作疾病的诊断生物标志物。人血清中的可溶性Fas配体(sFasL)和可溶性Fas受体(sFasR)已被广泛研究，作为多种疾病潜在有用的生物标志物，包括恶性肿瘤[138-140]、心血管疾病[141]、病毒感染[142-144]、自身免疫性疾病[145]、中枢神经系统疾病[146]、炎症性疾病[147]和糖尿病并发症[148]。sFasL与sFasR的比值也被认为是化疗应答的一个有希望的预后和预测因素[149,150]。值得注意的是，早期Stevens-Johnson综合征和中毒性表皮坏死患者血清中sFasL水平明显升高，如果不治疗，药物会发展为皮肤脱离等严重的皮肤不良反应[151]。

一种具有长片结构和单一二硫桥的三聚体蛋白(hFasLECD)和一种具有多个短片结构和广泛二硫桥的单体蛋白(hFasRECD)

人Fas配体是一类ii型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)配体超家族[152]。其位于hFasL蛋白c端端胞外结构域(ECD)由179个aa残基(aa 103 - 281)组成，并在Cys202和Cys233之间包含一个双硫桥(图4)。该ECD以同三聚体状态存在，不需要n端胞内结构域和跨膜结构域的帮助。最近确定的hFasLECD -人诱饵受体3 (hDcR3)复合物的三维结构显示，hFasLECD组装三聚体中的原聚体具有由两条β-链组成的延伸β-片结构，每条β-链由五条反平行β-链组成(图4)。超过40%的残基参与了β-片结构的形成。三聚体hFasLECD的整体结构类似于一个钟形截断金字塔，高度约为60 Å。一个hFasLECD单体在Asn184、Asn250和Asn260上有三个可能的n -糖基化位点。

图4。hFasLECD - hDcR3配合物的三维结构。原子坐标数据来自PDB (ID: 4msv, x射线模型)。该复合物由一个三聚体hFasLECD分子和三个单体DcR3分子组成，仅存在hFasLECD的单个原聚体部分和一个结合DcR3单体。二级结构呈带状，二硫键呈束状。

人Fas受体是一种i型膜蛋白，属于TNF受体超家族[152]。与hFasLECD不同，hFasRECD由157个aa残基组成，位于hFasR的n端(aa 1 - 157)，包含三个紧凑的富cys结构域(CRD)，称为CRD1、CRD2和CRD3，每个结构域约由40个aa残基组成。这些串联的crd被认为形成了DcR3中观察到的拉长形状的整体三维结构(图4)。hFasRECD中二硫桥的总数为9个。具有抗hFasRECD抗体Fab结构域的hFasRECD复合物的三维结构已通过x射线晶体学澄清[153]，尽管该结构中仍缺少N端和c端大量残基的信息。由于crd结构紧凑，hFasRECD结构中的多个β-片区域相当小，由2 - 4个aa残基组成。一个hFasRECD单体在Asn102和Asn120上含有两个可能的n -糖基化位点。有报道称n端部分和CRD1区域需要作为凋亡实现的预关联域，这与ALPS的发生有关[154]。

hFasLECD - hFasRECD配合物的三维结构尚未被实验圈定。然而，通过类比已经确定的其他同源复合物的三维结构，如人淋巴素α(LTα) -人TNF受体1复合物[155]、人肿瘤坏死因子(TNFα) -人TNF受体2复合物[156]、人TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL) ECD -人死亡受体5 (DR5)复合物[157]和hFasLECD - hDcR3复合物(PDB ID:4msv)时，可以合理地假设三个单体hfasrecd与三聚体hFasLECD中相邻单体之间形成的三个原聚体界面结合，从而导致3到3个受体配体组装。

利用酵母细胞系统和昆虫细胞系统进行高效重组生产

hFasLECD和hFasRECD不能从血液等自然人力资源中大量获得，因此开发高效的重组生产系统以大量获得这些蛋白质以进行生化研究非常重要。到目前为止，这些蛋白质的重组生产系统已经开发使用细菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞。其中，所用的哺乳动物细胞系统包括人胚肾和猴COS-1细胞，所需生物功能蛋白相对较少[158,159]。为了进行需要大量样品的生化分析，利用低等动物和单细胞生物的细胞系统设计了其他几种异体系统，用于重组生产hFasLECD和hFasRECD。

关于hFasLECD，迄今为止开发的功能生产mg级蛋白质的最有效的异体系统是使用甲基营养酵母的分泌表达系统，p . pastoris[160]。研究发现，截断n端区域(aa 103-138)[161]以及在n端添加DYKDDDDK-(Gly)5标记序列可显著提高其分泌水平[162]。这些重组产物的hFasRECD结合活性通过受体介导的免疫共沉淀和尺寸排除层析分析得到证实。最近，针对该系统设计了一种使用一次性培养袋的改进生产方法[163]。与其他人类死亡配体ECD(如TNFα、LTα或TRAIL ECD)相比，hFasLECD难以有效地在体内产生大肠杆菌[160]。这种情况可能与n -糖基化在酵母分泌中的关键作用有关，特别是在Asn260位点。已知Asn-linked glycans通过calnexin/calreticulin循环参与了包括酵母在内的真核细胞内质网(ER)中糖蛋白的折叠过程[164]。在p . pastoris缺乏所有可能的n -糖基化位点的hFasLECD三突变体(Asn184、Asn250和Asn260)的分泌被完全抑制，尽管有关Asn184和Asn250的双n -糖基化位点缺失突变体的分泌有效[162]。这表明在Asn260位点上含有末端葡萄糖残基的新生n -聚糖的存在对于hFasLECD的正常折叠至关重要，从而避免了er相关降解途径的转位进入通道[165]。这一假设得到了实验结果的支持，即使用糖工程蛋白完全阻断了有关Asn184和Asn250的双n -糖基化位点缺失突变体的分泌p . pastoris一种叫做SuperMan5的菌株，它只能在n -糖基化位点附着受损的Man5寡糖(M. Muraki。未发表的结果)。在这方面，也有报道hFasLECD在人体系统中与ER中的伴侣凝集素分子calreticulin有很强的直接结合[166]。报道了另一种独特的hFasLECD生产方法，该系统使用阿米巴宿主，盘基网柄菌discoideum,哪一种生物活性可溶性蛋白的分泌效率较低p . pastoris[167]。重要的是，重组hFasLECD在一个大肠杆菌在最近发表的hFasLECD - hDcR3复合物(PDB ID: 4msv)的x射线结构中，以体系为来源进行了结晶实验，表明非糖基化hFasLECD蛋白被有效地重折叠成生物功能形式。

另一方面，迄今为止报道的重组hFasRECD最有效的异体生产系统以蚕幼虫为表达宿主[160]。受到成功分泌生产重组小鼠FasRECD的启发，无论是六组氨酸标签还是人IgG1-Fc域标签在c端Trichoplusia倪利用大鼠的幼虫，构建了hFasRECD与人IgG1-Fc结构域融合蛋白的分泌系统[168]家蚕[169]。与另一种昆虫细胞系中相同融合蛋白的系统相比，Spodoptera frugiperda,的b .森幼虫系统的单位体积分泌产物的表达量要高得多。该生产系统被进一步改进，从而可以通过加入一个蛋白酶裂解位点序列来高效分离hFasRECD片段，该序列对凝血酶消化具有特异性[170]。虽然生产产量低于野生型hFasRECD，但涉及Asn102和Asn120两个n -糖基化位点的Gln双突变体也在夏季大量分泌到体液中b .森幼虫系统[163]。这表明n -糖基化对hFasRECD分泌水平的影响越来越大，但在这种情况下，并不总是昆虫细胞系统中hFasRECD分泌的先决条件。相比之下，野生型hFasRECD的分泌产生帕斯托氏酵母用于hFasLECD成功分泌的完全相同的表达单元构建[162]，仅将hFasLECD基因替换为hFasRECD基因，即使在两个n -糖基化位点存在的情况下也无法工作(M. Muraki，未发表的结果)。这可能是因为在包含较短扩展二级结构的较小分割域内的高密度二硫桥阻碍了hFasRECD分子在ER室中的有效折叠p . pastoris这是正确形成二硫化物桥的关键过程。

蛋白质疗法在医学上有巨大的应用潜力

野生型重组hFasLECD诱导细胞死亡活性的生物学功能基本完整p . pastoris最初是用老鼠做的实验丙酸菌属曼秀雷敦[171]。重组hFasLECD衍生物p . pastoris通过受体介导的免疫共沉淀法检测，使用纯化的重组hFasRECD-Fc融合蛋白重组家蚕B.;并被证明具有功能活性[161-163]。研究了hFasRECD- fc融合蛋白的功能活性，并从融合蛋白中分离出hFasRECD片段b .森用排除尺寸层析法对含有n端截断无标记hFasLECD衍生物的混合物进行检测p . pastoris[170]。这表明，与二价hFasRECD- fc衍生物相比，分离的hFasRECD与hFasLECD的相互作用较弱，显示了后一种情况下抗体样亲和性的贡献。

目前，通过x射线晶体学分析尚未获得hFasLECD与hFasRECD之间三维水平识别机理的直接实验信息。以同源死亡配体ECD和死亡受体ECD结构为模板，利用基于知识的计算机算法建立人工分子模型，进行了位点定向诱变研究，目的是鉴定hFasRECD - hFasRECD相互作用的关键aa残基[158]。因此，可获得的信息仍然相当有限，目前主要采用细胞死亡诱导活性试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)来评估诱变的效果。在hFasLECD中，位于与hFasRECD结合界面的两个aa残基Pro206和Tyr218分别被替换为三种不同的aa残基(Arg、Asp或Phe)[158]。突变体Arg206、Asp206、Phe206和Arg218在上述两种方法中活性均显著降低，而Asp218和Phe218突变体活性则表现出较为温和的降低。通过从hFasLECD的c端提取一系列缺失突变体，研究了hFasLECD中每个结构分离的结构域部分在自结合成三聚体结构和受体结合中n -糖基化的作用[159]。在hFasRECD中，有15种aa残基(CRD1中2种，CRD2中10种，CRD3中3种)被Ser独立取代[172,173]。其中Arg86和Arg87的两个突变完全取消了与hFasLECD的结合活性。其中Phe42、Lys73、Lys78和Glu98 4个突变对结合活性影响不大或影响甚微，除Ser118突变在ELISA检测水平未表达外，其余4个突变的结合活性均有中度降低。此外，使用CRD1缺失突变体和一系列与人TNF受体1 (TNFR 1) ECD中相应CRD交换突变体检测了hFasRECD中每个CRD在配体结合中的作用[174]。这表明单一CRD或一对CRD不足以与hFasLECD结合，对hFasLECD的特异性主要由CRD2和CRD3决定。

尽管关于结构域内结构-功能关系的信息有限，但hFasLECD和hFasRECD被认为具有巨大的治疗疾病的潜力，因为通过fasr介导的外部通路诱导凋亡与人体内严重疾病具有很强的临床相关性。因此，许多hFasLECD和hFasRECD的工程衍生物已经被开发出来，以提高其潜在的治疗功能，寻找针对疾病的新型有效生物药物，这些疾病被认为起源于与hFasL - hFasR信号系统相关的免疫疾病。

可溶性三聚体hFasLECD分子，以及膜结合的hFasL全长形式，与靶细胞表面存在的膜结合形式hFasR具有特异性结合，但单个三聚体hFasLECD分子单独结合通常不能在恶性细胞上引发有效凋亡。这被认为是由于靶细胞表面缺乏多个hFasR的组装，使得hFasR在细胞膜脂筏中的聚集成为癌症治疗的一个有希望的靶点[175]。研究发现，两个相邻三聚体hFasLECD分子的结合是有效形成死亡诱导信号复合物的最低要求[176]。为了使这种结合成为可能，已经设计了许多人工方法来结合两个以上的三聚体hFasLECD分子。在已开发的工程分子中，从实验结果来看，对恶性细胞最有希望的药物是一种六聚体簇激动剂MegaFasL，它由两个hFasLECD三聚体与人脂联素的胶原结构域结合而成[176]。这种激动剂分子目前被制造商称为APO010，已成功检测其对多种恶性细胞的细胞死亡诱导活性，包括几种类型的白血病[177,178]、卵巢癌[179]、胃肠道间质肿瘤[180]和胶质瘤[181]，以及胶质母细胞瘤干细胞样细胞[182]作为潜在的治疗药物在活的有机体内而且体外使用。根据临床试验(ID: NCT00437736)， APO010在实体瘤患者中的I期剂量发现研究已经完成。其他报道的结合两种以上hFasLECD三聚体的方法包括利用人IgG1-Fc结构域[176]、人白血病抑制因子受体gp190的自关联模块[183]、来自噬菌体T4的纤维蛋白三聚体结构域[184]和用于自寡聚的异亮氨酸拉链基序[185]。

hFasLECD分子工程的另一个重要手段是通过融合细胞表面抗原特异性的结合片段来增加靶向特异性。单链抗体靶向的细胞表面抗原包括成纤维细胞活化蛋白[186,187]、b细胞来源的恶性细胞系上的CD20[188]、白血病t细胞上的CD7[189]和RA和幼年特发关节炎中的自动反应性t细胞[190]以及人肿瘤相关抗原TAG-72和TAL6，它们在Jurkat-Ras细胞和HeLa细胞表面表达[191]。成纤维细胞样滑膜细胞上的细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4蛋白可以通过阻断CD28共刺激信号诱导t细胞无能，也被认为是hFasLECD治疗RA的融合伙伴[192]。通过进一步与hFasRECD融合，设计了一种衍生物作为前药，可选择性地激活表达基质金属蛋白酶2的癌细胞[187]。上述结构复杂的基因融合蛋白的制备一般需要以HEK293细胞或CHO-K1细胞为代表的哺乳动物细胞作为表达宿主，以保证重组融合蛋白中两个效应子组分的功能完整性。最近，一种新型的hFasLECD重组衍生物，其n端标记每个原聚体含有单个活性Cys残基，可以通过位点特异性的化学修饰与其他蛋白或低分子量化合物偶联来增强其治疗功能p . pastoris在富有成效的表达中更方便地处理宿主[163]。该重组hFasLECD产物含有n端dykddddk标记序列，可以与n -乙基马来酰亚胺或含有单端或双端马来酰亚胺基团的聚乙二醇衍生物位点特异性偶联。这两种结合产物都保留了特定的受体结合活性，以糖基化和非糖基化hFasRECD-Fc产生b .森通过与抗dykdddddk抗体交联，前者被证实对结直肠癌细胞系HT-29具有显著的细胞毒活性[163]。

自小鼠fasrecd -人IgG1 Fc结构域嵌合体蛋白在小鼠中预防细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导的暴发性肝炎的初步观察以来[193]，有效的工程hFasRECD分子已被研究用于抑制hFasL引起的有害生物功能。到目前为止，已经设计出两种临床重要策略，有助于治疗严重疾病。一种是消除hFasL在CTL中引起的过度凋亡诱导[194]，另一种是抑制hFasR在对正常凋亡有抗性的恶性肿瘤细胞表面介导的不必要的非凋亡信号过程、增殖和迁移[195]。这两种策略都已被证明可以通过连接人类IgG1 Fc结构域的hFasRECD二价融合蛋白(hFasRECD-Fc)有效实现，该蛋白在临床试验中被制造商命名为APG101。前者被证明对GVHD和骨髓增生异常综合征(MDS)有效，后者对多形性胶质母细胞瘤(GBM)有效，并已分别进入MDS (ID: NCT01736436)和GBM (ID: NCT 01071837)的I期临床试验。也有报道使用骨保护素c端结构域、软骨基质蛋白和软骨寡聚基质蛋白(软骨寡聚基质蛋白，COMP)作为融合配合物将多个hFasRECD结合的方法[196]。其中，含有五聚化hFasRECDs的hFasRECD-COMP融合蛋白在阻断抗体交联hFasLECD对四种恶性肿瘤细胞系的细胞毒活性方面表现出比hFasRECD-Fc强至少20倍的活性在体外．

结束语

阐明配体识别特异性的作用机制和来源对于开发具有生物医学应用潜力的新型工程蛋白至关重要。与细胞内蛋白相比，细胞外二硫桥蛋白具有更强的结构稳定性，是一种具有治疗潜力的生物药物。到目前为止，市场上有许多具有二硫桥的蛋白质生物制药。其中，临床和商业上最成功的一类治疗性蛋白质是单克隆抗体，其新型应用的分子设计仍在不断发展，通过整合低分子量化合物的优点[197]。然而，除了已经上市的蛋白质之外，还需要寻找不同类别的二硫桥蛋白作为商业药物，以满足仅靠低分子量药物无法满足的未满足的医疗需求。本文通过生物化学和生物物理分析，结合新发展的重组表达和化学合成方法，综述了三种具有潜在医学应用潜力的二硫桥蛋白的治疗相关性和结构功能关系。

尽管蛋白质具有很高的底物/配体识别特异性，但在本文所述的二硫桥蛋白中也存在一些阻塞因素造成的困难。例如,肺炎链球菌,一种能引起包括菌血症和脑膜炎在内的许多严重传染病的致命细菌，基本上易受溶菌酶的溶解活性影响。然而，该细菌基因组中编码的一种名为肽聚糖n -乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶A的酶通过产生去乙酰化的肽聚糖来抑制对溶菌酶的敏感性，而这种酶不能更有效地识别这些肽聚糖[198]。植物凝集素由肝素结构域组成，非人类来源。因此，尽管这类蛋白质在治疗人类疾病方面具有巨大的治疗潜力，特别是作为治疗艾滋病的抗病毒药物[199]，但其在人体系统中的免疫原性可能会阻碍其对人体血液系统的直接管理。对于人Fas配体- Fas受体系统，认为丝状病毒的糖蛋白包括埃博拉病毒和马尔堡病毒已知可引起人类严重出血热，通过空间屏蔽作为一种免疫逃避机制干扰fas受体介导的凋亡[200]。在RA患者的关节中，观察到hFasL的诱饵受体hDcR3的大量表达，它作为hFasL介导的细胞凋亡对抗增厚滑膜成纤维细胞的有效竞争性抑制剂[201]。另外，细胞表面异常的唾液酸化被指出通过破坏FasL - FasR通路介导的凋亡与恶性肿瘤的逃避机制密切相关[202]。基于先进工程技术的进一步研究，将这些抑制机制考虑在内，将是最大限度地发挥其治疗潜力的必要条件。

最后，开发高效的生产系统是成功的蛋白质生化和药物表征的先决条件。从研究样品制备的角度来看，另一个需要克服的重要问题是糖基化问题。大多数二硫桥接糖蛋白在生物合成中作为分泌蛋白产生，而Asp-linked n -糖基化被认为在分泌通路的ER区协助生产蛋白折叠[164]。如本文所示，利用酵母和昆虫等异种表达系统，已经开发了许多用于重组生产二硫桥治疗蛋白的有用方法。然而，在现有条件下，用于人类的糖化药物蛋白的实际制造主要依赖于中国仓鼠卵巢和人胚胎肾的哺乳动物细胞培养系统[203]。这种情况在很大程度上可以归因于哺乳动物与其他低等生物糖基化形式的差异。使用非哺乳动物系统生产具有人性化碳水化合物链的糖基化蛋白的方法的未来发展包括在体外利用哺乳动物细胞系统的更快、更便宜的生产方法将极大地加速二硫桥蛋白的基础研究和应用研究，具有医学应用潜力。

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