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摘要

内皮过表达脂多糖相关因子1 (EOLA1)，这是一种未知的人类基因(GenBank No.;AY074889)，已被识别先锋该基因是人脐静脉内皮细胞脂多糖(LPS)应答基因之一。我们先前的研究表明金属硫蛋白2A (MT2A)是相关的蛋白，并且具有重要的抗氧化作用EOLA1但在lps诱导的炎症反应中的作用尚不清楚。在本报告中，我们测定了EOLA1的亚细胞定位，以及EOLA1对LPS刺激下ECV304细胞血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1)的调节能力。我们的结果显示EOLA1在细胞中广泛弥漫。LPS显著诱导EOLA1和MT2A的表达，令人惊讶的是，ECV304细胞中EOLA1的敲除显著增强了LPS诱导的VCAM-1的产生。与此一致的是，过表达EOLA1减少了lps诱导的VCAM-1的产生。此外，MT2A的敲除减少了lps诱导的VCAM-1的产生。总之，我们的结果表明EOLA1在内皮细胞中可能与MT2A相关的lps诱导的炎症反应中具有负调控作用。

简介

内皮过表达脂多糖相关因子1 (EOLA1, GenBank No.074889，又名CXorf40A)是本课题组于2004年从脂多糖(LPS)刺激脐静脉内皮细胞系ECV304后差异表达基因中鉴定出来的[1,2]。然而，它的生物学功能却鲜为人知。EOLA1位于人类染色体Xq28上，基因组学上包含6248个碱基，5个外显子由4个内含子隔开。EOLA1基因在黑猩猩、恒河猴、狗、老鼠、大鼠、鸡、斑马鱼和青蛙中都是保守的。EOLA1蛋白由158个氨基酸组成，具有多个糖基化和磷酸化位点和螺旋-turn-螺旋基序，无信号肽和膜跨结构域。这些结构特征表明EOLA1是一种细胞内蛋白，可能与细胞质和细胞核中的相关蛋白相互作用调节细胞功能。生物信息学分析表明EOLA1基因属于激活信号协积子1 (ASC-1)同源性(ASCH)超家族。ASCH是一种小的β -桶结构域，在许多生物体中经常被观察到，尽管它的功能尚未被明确定义。ASCH被认为在共激活、rna加工和调节原核转译[4]过程中具有rna结合域的功能。

EOLA1在稳定条件下微表达，在ECV304细胞中，其表达在LPS的作用下显著增加。EOLA1与金属硫蛋白2A (MT2A)之间的蛋白相关性已通过酵母双杂交和免疫共沉淀试验证实[2,5]。已知MT2A在细胞培养中具有抗炎、抗内毒素和抑制肿瘤的作用[6,7]。此外，MT2A通过诱导细胞凋亡和G2/M阻滞抑制细胞生长，通过上调IκB-α和下调p-IκB-α和cyclin D1[8]负向调控NF-κB通路。基于大鼠肝移植模型，我们发现移植排斥反应[9]中EOLA1的表达发生了显著变化。这些结果提示EOLA1可能通过与MT2A结合传递炎症相关信号，从而参与内皮细胞炎症反应的调控。

LPS是几乎所有革兰氏阴性菌的主要外表面膜成分，在从昆虫到人类的各种真核生物物种中作为配体通过特定受体触发先天免疫反应[10,11]。血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1)的诱导是激活血管内皮细胞[12]的标志。VCAM-1属于免疫球蛋白超家族，调节白细胞募集和对炎症部位的免疫反应，加速动脉粥样硬化的发展[13,14]。虽然已知LPS可诱导血管内皮细胞VCAM-1的表达。

为了了解EOLA1在广谱内调节炎症的生物学功能，我们研究了EOLA1在ECV304细胞中的亚细胞分布，以及EOLA1在LPS诱导的炎症基因反应(包括vcam -1)中的调节作用。

材料与方法

LPS制备和细胞培养

将纯化的天然LPS酚(Sigma)溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，稀释至1 mg/ml，保存于-20°C。实验时，将LPS原液进一步稀释到补充的组织培养基中，直至工作浓度为100 ng/ml。ECV304 (ATCC)在添加10%胎牛血清、3mg /ml Hepes、100u /ml青霉素G、100mg /ml链霉素和6u /L胰岛素的培养基199中培养于明胶包膜培养皿上，5% CO湿度气氛中培养₂．融合培养物与EDTA-Trypsin溶液分离，分成1:3供进一步使用。

EGFP-EOLA1融合蛋白表达质粒的构建及细胞转染

根据EOLA1的开放阅读框(ORF)序列合成一对引物(正向引物:5)^＇-ACCAGGATCCTCTCTTCATGCCCAAAG-3'，反向引物:5^＇-AGCAGGATCCTCTCTTCATGCCCCAAAG-3”);EcoR我和BamH将I型核酸内切酶位点分别引入正向引物和反向引物的末端。用LPS (100ng/ml)刺激ECV304细胞6小时，提取总RNA进行RT-PCR (TaKaRa)，最后扩增EOLA1的ORF序列。PCR产物和pEGFP-N2质粒(Clontech)用内切酶切割EcoR我和BamHI，酶切产物经电泳回收并与DNA连接酶(DNA ligase, TaKaRa)连接，最后将目标ORF序列插入pEGFP-N2质粒中，经转位后选择单菌落测序(TaKaRa)大肠杆菌DH5α。

细胞转染时，将ECV304细胞以1.5 × 10的倍数分裂到6孔培养板(预先覆盖无菌盖片)上⁵/好。当细胞培养中融合达到80%时，使用脂质体Lipofectamine将融合蛋白表达质粒pEGFP-EOLA1和对照质粒pEGFP-N2转染到细胞中^TM2000 (Invitrogen) 48小时。转染效率由GFP阳性和阴性细胞决定。

EOLA1的亚细胞分布

细胞转染48h后，取出培养基，PBS冲洗2次，4% PFA固定。用部分细胞检测亚细胞位置;用大鼠抗gfp抗体(一抗体)和山羊抗大鼠抗体(二抗体)孵育细胞，DAPI染色，在LSM510 META激光共聚焦显微镜(蔡司)下拍照。免疫电镜下观察，细胞用4% PFA固定，3%二氧化氢氧化，血清孵育。以制备的兔抗eolal多克隆抗体为一抗体，hrp标记的山羊抗兔IgG抗体为二抗体孵育。然后用hrp标记的链抗生素素和二氨基联苯胺(DAB)染色，2.5%戊二醛重固定，0.1%锇酸固定，丙酮梯度脱水，在70%丙酮制备的饱和醋酸铀酰中保存一夜。用纯丙酮冲洗，用丙酮与环氧树脂的混合物(v:v=1:1)浸泡，用纯包埋介质(不含环氧树脂固化促进剂DMP-30)和包埋介质(含DMP-30)在40℃下处理，用环氧树脂618包埋。最后将细胞制成超薄切片，用铅染色，在tecna110透射电子显微镜(Philip)下观察并拍照。

可拆卸的实验

EOLA1的敲除是通过RNA干扰(RNAi)完成的。EOLA1-shRNA(小发夹RNA)的寡核苷酸序列为:5 ' -AGGAGGCAAGGATGTATTCTTCAAGAGAGAATACATCCTTGTTTTTTT-3 '，反义序列为:5 ' -AATTAAAAAAAGGAGGCAAGGATGTATTCTCTCTTGAAGAATACATCCTTGCCTCCTGGCC-3 '。对于MT2A的敲除，MT2A- shrna的寡核苷酸序列为:5'- gatccgccgtgaccgtttgctatatttcaagagagaatatagcaaacggtcacggttttggaaa -3'，反义序列为:5'-AGCTTTCCAAAAAACCGTGACCGTTTGCTATATTCTCTTGAAATATAGCAAACGGTCACGGCG-3'。通过将这些寡核苷酸插入质粒pSilencer 3.1/H1 hygro (Ambion)中，构建了H1启动子驱动的shRNA表达盒。一个未经工程改造的质粒pH1被用作空白对照。细胞转染pH1，pH1-EOLA1shRNA，或pH1-MT2A shRNA与lipofectmine 2000在无血清OPTI-MEMI (Invitrogen)中根据说明书。最终体积为500 ml，转染DNA载体的浓度为8µg/ml。培养4 h后洗涤细胞，重悬于含血清的完全生长培养基中，以便进一步实验。

RT-PCR和VACM-1检测

按照制造商的说明(Invitrogen)，使用Trizol试剂从细胞中分离总RNA。RT-PCR采用一步法试剂盒(TaKaRa)检测基因mRNA表达水平。引物由共生体(EOLA1上游:5'- gctcgaattcatgaagtttggctgccttc -3'，下游:5'-AGCAGGATCCTCTCTTCATGCCCCAAAG-3')合成。β-actin:上游:5'- cgggaaatcgtgcgtgacat -3'，下游:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3')。在VACM-1试验中，细胞在含1%蛋白酶抑制剂的PBS (1:2, w/v)中均质，然后在12,000×g下4℃离心20分钟。根据生产商的说明，用ELISA试剂盒(Sigma)分析上清。

Western blot分析

转染细胞用添加完全蛋白酶抑制剂片(Roche)的RIPA缓冲液裂解。用Lowry法测定裂解液蛋白浓度。蛋白质样品(30 mg)装载在SDS-9%聚丙烯酰胺凝胶上，然后使用标准程序在电印迹装置中转移到蛋白质硝化纤维素膜上。免疫检测如前所述[2]，使用抗eola1，抗mt2a或抗gfp作为第一抗体，第二抗体igg -辣根过氧化物酶偶联物(Invitrogen)，抗β-actin作为负载对照。抗eola1多克隆抗体由新西兰大白兔免疫制备，经Western blot鉴定。在蛋白a Sepharose柱上纯化抗EOLA1的IgGs。ELISA法测定多克隆抗体的效率。

统计分析

数据用均值表示±标准误差。学生的t进行检验以确定酶联免疫吸附测定的统计学显著性;p<0.05为有统计学意义。

结果

eola1在ECV304细胞中的亚细胞分布

用pEGFP-EOLA1融合蛋白表达质粒和pEGFP-N2对照质粒转染ECV304细胞48h。在激光共聚焦显微镜下观察图像。转染对照质粒或融合蛋白表达质粒的ECV304细胞在绿色荧光下显示全细胞分布均匀，而转染融合蛋白表达质粒的细胞也有核聚集(图1A)。以制备的兔抗eola1多克隆抗体为一抗，对转染细胞进行免疫标记，然后在电镜下观察。转染对照质粒的细胞中没有免疫沉淀，但转染融合蛋白表达质粒的细胞的细胞质基质中沉积了明显的免疫沉淀(图1B)。

图1所示。EOLA1在ECV304细胞中有亚细胞定位。用空白质粒pEGFP-N2和融合蛋白表达质粒pEGFP-EOLA1转染ECV304细胞。培养48小时后，用4%的PFA固定转染细胞。A、大鼠抗gfp抗体(一抗体)和山羊抗大鼠抗体(二抗体)孵育细胞，DAPI染色，LSM510 META激光共聚焦显微镜下拍照。B、用兔抗eolal多克隆抗体(一抗体)和hrp标记的山羊抗兔IgG抗体(二抗体)孵育细胞，用hrp标记的链抗生素素和二氨基联苯胺染色，环氧树脂618包埋。最后将细胞制成超薄切片，用铅染色，在tecna110透射电镜下观察并拍照。白色箭头是抗eola1抗体转染pEGFP-EOLA1的ECV304细胞中的免疫沉积。

LPS诱导ECV304细胞中EOLA1的表达和VCAM-1的产生

ECV304细胞生长至80%汇合，用LPS (100 ng/ml)刺激，时间过程如所示。细胞显示EOLA1转录以时间依赖性的方式增加(图2A)。酶联免疫吸附测定培养上清中VCAM-1的浓度。细胞暴露于LPS (100ng/ml)诱导VCAM-1产量显著增加(图2B)。

图2。LPS诱导ECV304细胞产生EOLA1和vcam -1。A、ECV304细胞用LPS (100ng/ml)处理0、3、6、12和24小时，用RT-PCR分析EOLA1的总rna。B，用LPS (100ng/ml)刺激ECV304细胞，在指定的时间内收集上清，ELISA检测vcam -1的产生。数据显示三个独立实验中的一个有代表性的实验。

EOLA1过表达可抑制LPS诱导的ECV304细胞中VCAM-1的表达

为了进一步表征EOLA1在ECV304细胞中诱导VCAM-1的功能影响，我们将pOPRSVⅠ-EOLA1-EGFP和pCMV-LacⅠ质粒共转染ECV304细胞，使其在IPTG诱导后稳定过表达EOLA1(图3A)。添加IPTG 48 h后用LPS (100 ng/ml)处理过表达EOLA1的细胞，LPS处理6 h后用ELISA法检测细胞上清中VCAM-1蛋白的产生。结果显示，LPS可显著诱导VCAM-1蛋白分泌，过表达EOLA1可降低LPS诱导的ECV304细胞中VCAM-1蛋白水平(图3B)。

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图3。EOLA1过表达可阻止LPS诱导的ECV304细胞中VCAM-1的产生。用pOPRSVⅠ-EOLA1-EGFP和pCMV-LacⅠ质粒转录ECV304细胞，IPTG诱导。用抗EOLA1抗体48进行Western blotting分析，发现IPTG诱导后EOLA1过表达。B，用商用ELISA试剂盒检测IPTG诱导的细胞在LPS (100 ng/ml)刺激6 h后产生VCAM-1的能力。数据表示三个独立实验的平均值±标准差。* p < 0.05。

敲除EOLA1可增强LPS诱导的ECV304细胞中VCAM-1的表达

为了进一步研究EOLA1对LPS诱导的ECV304细胞产生VCAM-1的影响，我们用EOLA1 shRNA转染ECV304细胞以沉默EOLA1基因。western blot证实转染EOLA1- shrna的细胞中EOLA1表达明显下调。敲除EOLA1也可抑制MT2A的表达(图4A)。敲除EOLA1可以增强LPS诱导的VCAM-1蛋白分泌(图4B)。

图4。用shRNA敲除EOLA1可抑制MT2A的表达，增加lps诱导的ECV304细胞VCAM-1的产生。A, ECV304细胞转染对照或EOLA1 shRNA 48小时。细胞裂解后用抗eola1或抗mt2a抗体，β-actin作为负载对照的Western blotting分析。B、ECV304细胞转染对照或EOLA1 shRNA 24小时后，在LPS (100 ng/ml)条件下培养，刺激6后测定培养上清中VCAM-1的浓度。数据表示三个独立实验的平均值±标准差。* p < 0.05。

EOLA1通过MT2A调节VCAM-1的生成

EOLA1在ECV304细胞中与MT2A相关，且EOLA1调节MT2A的表达，提示EOLA1通过与MT2A相关介导VCAM-1的产生。我们进一步研究了MT2A在LPS诱导的免疫应答中的作用。LPS处理MTA2敲除细胞，LPS处理6h后用ELISA法测定VCAM-1细胞上清。结果显示，向下敲除MT2A可调节LPS诱导的ECV304细胞VCAM-1蛋白分泌(图5)。

图5。EOLA1通过MT2A介导LPS诱导的VCAM-1的产生。A、ECV304细胞转染MT2A shRNA或对照shRNA，用抗MT2A或ant-EOLA1抗体、β-actin作为负载对照，裂解细胞，进行Western blotting分析。B, ECV304转染MT2A shRNA或对照shRNA，然后用LPS (100 ng/ml)刺激6 h。ELISA检测VCAM-1的产生。数据表示均值+S。D三个独立实验。* p < 0.05。

讨论

EOLA1是本课题组在ECV304细胞中筛选LPS诱导的基因表达时首次发现的一个新基因。然而，目前对其在炎症中的生物学功能知之甚少。为了了解EOLA1的亚细胞分布，我们将EOLA1的ORF序列定向克隆到pEGFP-N2载体中，成功构建EGFP-EOLA1融合蛋白真核表达质粒转染ECV304细胞。在激光共聚焦显微镜下观察瞬时表达后的转染细胞。观察结果显示，细胞质和细胞核中均有强烈的绿色荧光信号。DAPI染色证实融合蛋白在细胞质中表达，并在细胞核中聚集。此外，我们进一步利用免疫电镜酶标记技术在细胞超微结构水平观察了EOLA1的亚细胞定位，结果证实了EOLA1在细胞质中的表达。以上观察表明EOLA1是一种胞内蛋白，具有从细胞质转位到细胞核的能力，但这一现象尚需进一步证实。

ECV304细胞属于人脐静脉内皮细胞，可通过LPS刺激激活。LPS刺激细胞后，通过膜受体toll样受体-4信号转导，解除了I-κB对NF-κB的抑制，转入细胞核，促进VCAM-1的表达和释放，激活内皮细胞，吸引单核巨噬细胞聚集，诱导炎症反应[15,16]。最近的研究也表明，LPS诱导的VCAM - 1表达有助于动脉粥样硬化过程的启动[17,18]。我们的实验表明，LPS诱导EOLA1的表达，同时诱导VCAM-1的产生，EOLA1过表达减少LPS诱导VCAM-1的产生，而EOLA1的缺失显著增强LPS诱导VCAM-1的产生。我们的结果表明EOLA1控制LPS对内皮细胞的激活程度，并可能负调控炎症免疫反应。

MT2A是细胞质中的一种低分子量蛋白，在细胞代谢中发挥多种作用，具有抗炎、抗内毒素、抑制肿瘤生长等作用。近年来研究发现MT2A可通过上调IκB-α，抑制NF-κB的活化，从而降低细胞炎症反应。我们的研究结果表明，EOLA1通过与MT2A结合调节MT2A的表达，影响VCAM-1的产生，从而避免ECV304细胞的过度激活，从而达到对炎症反应的精细调控和及时控制。这样可以避免过度炎症反应对组织和细胞的损伤。EOLA1与MT2A结合的具体机制及其对NF-κB信号通路的功能影响有待进一步研究。

综上所述，EOLA1在ECV304细胞中与MT2A结合，对lps诱导的炎症反应起负调控作用。

利益冲突

作者声明他们没有竞争利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金项目(资助号:30670838)的资助。

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