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抽象的

维生素d代谢物，24,25（OH）₂D_3.据报道有荷尔蒙活动。据报道过氧化氢酶是24,25(OH)的结合蛋白。₂D_3.，根据代谢产物特异性结合的基础上分离的蛋白的序列分析。在目前的工作中，我们报道24R,25(OH)₂D_3.,而不是24岁的人群,25 (OH)₂D_3.是通过共聚焦显微镜判断的过氧化氢酶再分配的有效代谢物。我们用24S,25(OH)这两种载体处理雄性鸡的肠道细胞₂D_3.，24R，25（OH）₂D_3.或1,25（OH）₂D_3.确定过氧化氢酶的本地化。共聚焦显微镜分析显示点状染色，在细胞表面上和在细胞与载体处理的细胞质中，24R，25（OH）₂D_3.，24S，25（OH）₂D_3.或1,25（OH）₂D_3.对于所有测试的时间点。用24R，25（OH）处理的细胞₂D_3.显示细胞核内过氧化氢酶的标点染色。Western分析证实细胞核内的标点染色来自细胞表面过氧化氢酶的重新分布。Western分析还显示24S，25（OH）₂D_3.处理导致过氧化氢酶的再分配到细胞核，但比具有24R治疗在较小程度上，25（OH）₂D_3.．通过了解2425 (OH)的分子和细胞作用₂D_3.在鸡肠中，提高动物对磷酸盐和钙的吸收，以提供足够的骨骼生长所需的矿物质，并可减少生产动物粪便中的磷酸盐。

关键字

24,25-二羟维生素D3，小鸡肠道，过氧化氢酶的本地化

介绍

维生素D于1922年被发现，从那以后就被归类为一种前激素，这是因为高等动物对维生素D的利用经历了一个光化学过程。维生素D的激活始于肝脏，主要的循环代谢物25-羟基维生素D的产生_3.[25（OH）d_3.]，然后在肾脏中羟基化产生两种代谢物，即1,25-二羟基维生素D_3.(1,25 (OH)₂D_3.]当由磷酸盐和钙含量低或24,25-二羟基d_3.[24,25（OH）₂D_3.]当磷酸盐和钙含量较高时制造。

24日,25-dihydroxyvitamin D_3.不再被认为是一种不活跃的代谢物。早期研究表明，为了达到正常的雏鸡孵化率[1]和成骨[2]，1,25(OH)₂D_3., 24日,25 (OH)₂D_3.是必要的。1, 25-dihydroxyvitamin D_3.2425 -二羟基维生素D刺激钙和磷酸盐在灌注的鸡十二指肠袢和分离的肠细胞的快速运输_3.抑制这种刺激[3,4]。在成骨细胞和骨肉瘤细胞中，1,25（OH）₂D_3.已发现对钙通道开放有快速影响，而24,25（OH）₂D_3.被发现能抑制这种非核效应[5-7]。在鸡肠细胞中，1,25(OH)₂D_3.已经发现有一种急性，磷酸盐运输非核效果，24,25（OH）₂D_3.已发现能抑制[8]反应，而对甲状旁腺素(PTH)刺激的磷酸盐转运[9]无影响。灌注鸡十二指肠袢2425 (OH)₂D_3.抑制磷酸盐运输的快速刺激[8]介导的通过1,25（OH）₂D_3.，以及钙转运[10]。

在鸡肠细胞中，激素刺激的磷酸盐摄取是由配体结合1,25 d启动的_3.-membrane关联，快速响应类固醇结合受体 - 1,25D_3.-MARRS [11]，也称为ERp57 / GR58 / PDIA3。的24,25的能力（OH）₂D_3.抑制1,25D_3.-在鸡肠[12]和肾脏[4]中发现MARRS受体激活蛋白激酶A和C的活性，这表明存在24,25（OH）的特异性结合蛋白₂D_3.．Percoll梯度分析显示溶酶体分数最高[^3.H) 24日,25 (OH)₂D_3.绑定活动[10]。为了解释2425 (OH)₂D_3.为了实现抑制作用，分离、纯化了一种细胞结合蛋白（66 kDa）[10]并对其进行了测序[13]。发现其24,25（OH）的结合常数为7 nM₂D_3.，经Edman降解技术鉴定为过氧化氢酶[13]。过氧化氢酶对细胞信号分子[14]很敏感。发现24,25(OH)的抑制作用₂D_3.是由于鸡肠[15,16]和肾[12]中过氧化氢酶活性降低，同时H₂O₂生产[13]。因此，抑制作用的一个可能机制可能是1,25 d硫氧还蛋白结构域的氧化_3.-MARRS受体在暴露[15]10分钟后发生，并伴有结合活性的丧失。然而，研究[15]显示24,25(OH)₂D_3.或H₂O₂孵育5分钟后处理，表明另一种机制，因为24,25（OH）₂D_3.不能与1,25(OH)竞争₂D_3.马斯绑定。

在肠细胞，研究表明1,25D_3.-刺激的磷酸盐摄取由PKC信号[3]和2425 (OH)介导。₂D_3.似乎废除作用[10]。因此，另一种可能的机制将是影响信号转导途径[17]。

在本研究中，我们使用鸡肠细胞来确定过氧化氢酶在不同维生素D类固醇激素反应中的定位。Western分析验证了共聚焦显微镜的结果。

实验性

动物

所有手术程序均经犹他州立大学机构动物使用和护理委员会批准。白来航公鸡在孵化当天获得（Privett孵化场，Portales，NM），并在商业上可买到的富含维生素D的饮食中饲养（Nutrena Feeds，Murray，UT）通常在试验前3-7周。使用当天，用无水乙醚麻醉雏鸡（Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ）.通过手术打开腹腔，将十二指肠环取出至0.9%的冰凉盐水中，冷冻15分钟。从十二指肠环中取出胰腺并丢弃。将十二指肠环外翻并在冷冻盐水中冲洗三次。

用枸橼酸螯合培养基(96 mM NaCl, 27 mM无水枸橼酸，1.5 mM KCl, 8 mM KH)分离鸡肠细胞₂阿宝₄， 5.6 mM Na₂HPO₄，pH为5.0 - 酸性pH促进存活和形态学的保持率）[3,18]。通过低速离心（500×g下，5分钟，4℃）收集细胞，并再悬浮于Gey中的平衡盐溶液（GBSS小体积的细胞沉淀，将含有119 mM的NaCl的，​​4.96毫米氯化钾，0.22毫KH₂阿宝₄， 0.84 mM NaHPO₄， 1.03 mM氯化镁₂•6小时₂O, 0.28 mM₄•7小时₂O, 0.9 mM CaCl₂, pH值7.3)。将等量的细胞悬液(0.4 ml)移入35毫米塑料培养皿(Falcon, Scientific Products;Franklin Lakes, NJ)含有1.5 ml RPMI 1640培养基和抗生素(100单位/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo)。细胞在37ºC、5% CO无血清的情况下培养过夜₂/ 95%空气促进细胞粘附。

共聚焦显微镜

次日上午，培养基用0.1% BSA替换为GBSS (GBSS-BSA，牛血清白蛋白，Sigma, St. Louis, MO)，细胞用载体(0.01%乙醇)或激素处理15秒至60分钟(15秒，30秒，7min, 10min, 15min, 25min, 30min, 40min, 50min, 60min)。在每个时间点,媒体取代4%多聚甲醛(电子显微镜科学,哈特菲尔德,PA)、3%蔗糖在PBS(磷酸缓冲盐)和固定30分钟。与0.1% PBS-BSA洗涤后,细胞被孵化与PBS NaBH4 0.05% 5分钟刷状缘消除自体荧光,然后用0.15% Triton X-100在PBS中洗涤并渗透5分钟检测细胞内过氧化氢酶活性，或不使用Triton X-100检测细胞表面过氧化氢酶活性。用0.1% PBS-BSA洗涤后，用正常兔血清(JacksonImmuno Research, West Grove, PA)覆盖细胞5分钟，然后洗涤。然后用一抗Ab365(高度特异性多克隆抗体，Center for Integrated BioSystems, Logan, UT)覆盖覆盖30分钟(0.1% PBS-BSA中的1/1000)，然后再孵育30分钟(在加入更多的PBS-BSA以防止干燥后)，洗涤，然后用荧光标记的二抗Alexa Fluor 594 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA)覆盖，在591 nm激发，在614 nm发射;和Phalloidin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)用异硫氰酸荧光素标记(激发在495 nm，发射在513 nm) 30分钟。然后冲洗三次。最后洗涤后，将盖片置于显微镜载玻片上的安装介质(10% 1 M Tris, 80%甘油)上，并密封以便随后的共聚焦显微镜分析。采用尼康TE-200显微镜(BioRad)共聚焦成像。使用ZEN软件采集图像，使用60x油浸物镜，并使用ImageJ和adobephotoshop CS5进行进一步处理。

西方的屁股

将上述分离的肠细胞用500 × g离心5 min(4ºC)收集，用30 ml GBSS重悬。5 ml细胞悬液与试验物质在GBSS中混合，最终浓度为0.01%乙醇，6.5 nM 24R,25(OH)₂D_3.及下午二时二十四分,二十五分(俄亥俄州)₂D_3.．细胞分别孵育10分钟和25分钟，取出1 ml到10 ml冰冷PBS中提取细胞质和细胞核。萃取过程涉及在蛋白酶抑制剂存在的情况下与一系列清洁剂混合。

用SDS-PAGE和Western blot检测对照和维生素D处理的细胞中过氧化氢酶的免疫反应水平。用Bradford试剂(Bio-Rad, Hercules, CA)测定蛋白，然后样品(5-30µg/孔)在8% (wt/vol)的SDS-PAGE凝胶上分离，5%的堆积凝胶。在SDS-PAGE上分离后，使用TransBlot SD半干转移细胞(Bio-Rad.)将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon-P, Fisher Scientific)，并进行Western分析。为了避免非特异性结合，将膜在37ºC封闭溶液中浸泡1小时(0.5%脱脂奶粉，磷酸盐缓冲盐水(PBS;0.9% NaCl和10mm Na₂HPO₄，pH 7.4）中，然后洗涤，每次用洗涤溶液在Tris缓冲盐水（0.1％（重量/体积）BSA 5分钟三次（TBS; 0.9％的NaCl的20mM的Tris-HCl，pH 7.4）中，并温育与一抗（Abcam公司公司，剑桥，MA）在4℃过夜。之后附加洗涤三次，将膜与二级抗体（碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔IgG）在1％BSA和0.05％吐温孵育20在TBS在室温下2小时，然后如前面所指出的洗涤。免疫反应带与色原体显现5-溴-4-氯-3-吲哚基 - 磷酸盐/硝基四氮唑蓝，和使用Adobe Photoshop进行定量过氧化氢酶的相对量。

结果与讨论

激素体外作用后过氧化氢酶定位的时程研究

在最初的实验中，通过在一抗Ab365之前添加激素来确定共聚焦显微镜下过氧化氢酶的定位。用0.01%乙醇、6.5 nM 24R、25(OH)处理鸡肠细胞，在培养皿中培养。₂D_3.24日下午,200年代,25 (OH)₂D_3.，或300pM 1,25(OH)₂D_3.中，已显示出等同于循环水平[19]，对于选定的时间（15秒，30秒，7分钟，10分钟，15分钟，25分钟，30分钟，40分钟，50分钟，60分钟），并固定为共聚焦显微镜的浓度。红染色描绘Alexa氟594荧光，这表明在细胞表面上过氧化氢酶的本地化。图1A示出了较短的时间点和图1B示出了更长的时间点。用0.01％的乙醇选定的时间处理的对照细胞显示明显表面染色，用在细胞核内一个较低的水平。在这个和随后的实验中这些意见一式三份实验中重现。图2描绘了从在其中细胞用24R，25处理的实验结果（OH）₂D_3.在较短时间点(图2A)和较长时间点(图2B)，与对照组相比，核染色(用黄色箭头表示)和表面染色明显增加。图3为24S, 25(OH)处理细胞的实验结果₂D_3.在较短时间点(图3A)和较长时间点(图3B)中，与对照组相比，细胞核染色略有增加，但与24R、25(OH)相比，增加幅度较小。₂D_3.治疗。图4描绘了来自实验，其中细胞用1，25处理结果（OH）₂D_3.在较短时间点(图4A)和较长时间点(图4B)中，与对照相比，核染色和表面染色均无增加，自1,25(OH)以来₂D_3.不与24R竞争，25（OH）₂D_3.在以前的研究中，发现24R，25（OH）₂D_3.在体内注射1 h, 24S,25(OH)₂D_3.能够增加磷酸盐吸收5-H体内注射后，这表明抑制效果可能会被24R，25主要执行的（OH）₂D_3.[20] 。一种可能的基因调控机制可能是过氧化氢酶与STAT3的结合[21]。需要进一步研究STAT3是否是过氧化氢酶的结合伙伴。

关于核染色的起源提出了问题。为了回答这个问题，进行了额外的共聚焦显微镜实验，以确定细胞表面过氧化氢酶是否是类固醇介导的核再分配的来源。在这些实验中，首先将一级抗体添加到细胞中30分钟，然后将一级抗体加入到细胞中与车辆一起使用，1,25（OH）₂D_3.，24S，25（OH）₂D_3.或24R，25（OH）₂D_3.．图5为0.01%乙醇处理较短(图5A)和较长(图5B)时间点的对照细胞，表面染色明显，但细胞核内染色很少。如图6A、B所示，24R、25(OH)后核再分配₂D_3.治疗并没有出现，这表明配体结合至细胞表面的过氧化氢酶诱导再分配到细胞核，但是被阻断的抗体。类似地，治疗用抗体的细胞抑制第一24S的效果，25（OH）₂D_3.（图7A和7B），与预期一样，1,25（OH）没有影响₂D_3.处理被发现（图8A和8B）。

进一步分析，用ImageJ软件量化细胞核内过氧化氢酶染色强度。图9描述了“激素优先处理”的比较，即细胞先用激素处理，然后用抗体处理。24R,25(OH)的强度显著增加₂D_3.治疗组，而另一组保持不变。图10描绘了用抗体之前激素，或“抗体的治疗第一”处理的细胞进行了比较。有一个在各组间的强度没有明显的增加，这表明核再分配由24R，25介导的（OH）₂D_3.确实是来自细胞表面过氧化氢酶。

一个独立的做法是采取以验证这些结果。在这些实验中，细胞用载体处理的，24S，25（OH）₂D_3.或24R，25（OH）₂D_3.10和25分钟，离心收集，重悬于匀浆中进行亚细胞分离。对P1(细胞核、刷状边缘和未断裂细胞)、P2(过氧化物酶体、溶酶体、线粒体、高尔基膜和基底侧膜)和S2(微粒体和胞质)进行sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行Western blotting。结果重复显示24R,25(OH)后细胞核再分布更多₂D_3.与24秒、25秒（OH）相比的治疗₂D_3.（图11）。一种可能的解释可能是24R，25（OH）的浓度较高₂D_3.比24S,25(OH)₂D_3.．然而，下面的24S从细胞表面和细胞器到细胞核再分配的事实，25（OH）₂D_3.Western分析检测到的结果表明，共焦显微镜是灵敏度较低的方法。图11所示的结果也表明，商用抗体的特异性低于Ab 365[17]。

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