马托格罗索大学卫生科学学院，Cáceres，巴西
巴西圣保罗大学生物医学科学研究所
心脏研究所高血压实验室，São巴西保罗
心脏研究所高血压实验室，São巴西保罗
马托格罗索大学卫生科学学院，Cáceres，巴西
心脏研究所高血压实验室，São巴西保罗
巴西圣保罗大学生物医学科学研究所
DOI: 10.15761 / IMM.1000191。
我们研究了48小时(h)禁食后永久性冠状动脉闭塞和48小时再进食对梗死面积的影响;射血分数;血浆肌酸激酶活性;成年大鼠左心室il - 1 β、CINC 2α/β、IL-6、甘油三酯、糖原和ATP水平的变化。行永久性冠状动脉闭塞随意喂食大鼠(喂食/喂食)和两天禁食大鼠(禁食/再喂食)。诱导梗死后，两组患者均予复食48 h，超声心动图检测梗死面积及射血分数。在2天禁食期结束时测量左心室的糖原、甘油三酯、ATP和促炎细胞因子水平，以及血浆中葡萄糖和游离脂肪酸的浓度。禁食/再喂养组的梗死面积明显小于喂养组。伴随着血浆肌酸激酶活性的降低和射血分数的提高。禁食本身导致糖原、ATP、CINC 2 α/β、白细胞介素(IL)-1β和IL-6增加，并降低左心室三酰甘油水平;伴随着游离脂肪酸浓度的增加和血浆中葡萄糖水平的降低。本研究提示禁食2天后48 h补食可保护心脏不受缺血诱导的损伤，这可能与禁食诱导的代谢状况有关。
空腹后补食，心脏功能，心脏炎症，心脏代谢状态，梗死大小，缺血性损伤
急性心肌梗死(AMI)是世界范围内死亡率和发病率的主要原因。急性心肌梗死是由血液流动不足引起的，导致心肌供氧和营养物质明显减少。这进而导致ATP产生的减少，并导致氧化应激、跨膜离子梯度的损失、有毒代谢物的积累和炎症[2]。在有氧条件下，脂肪酸(FA)氧化是心脏ATP的主要来源[3,4];然而，在缺血期间，ATP通过糖原[4]衍生的葡萄糖厌氧糖酵解产生。
促炎细胞因子，如IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-6的表达在正常心脏中通常不存在，但在AMI影响的动物和人的心脏中表达增加[5,6]。炎症细胞的涌入和促炎介质的产生导致心肌损伤。然而，广泛抑制炎症对AMI后的预后有不良影响[7,8]。炎症不是一个有害的过程本身,因为它触发了AMI治愈的第一步[9,10]。
饮食限制增加心脏对缺血损伤的耐受性[11,12]。间歇性禁食可增加缺血心脏的毛细血管密度[13]，减少凋亡细胞数量，降低炎症反应[14]。禁食1 ~ 3天可防止小鼠肾[15]和肝[16]缺血/再灌注损伤。
然而，短期禁食后的短期再进食对心脏对缺血损伤的耐受性的影响，游离于再灌注损伤，尚未得到研究。在本研究中，观察了大鼠禁食2天后永久性冠状动脉闭塞48 h后左心室梗死面积、射血分数(EF)、左心室(LV)质量以及ATP、甘油三酯(TG)、糖原和促炎细胞因子水平。
雄性Wistar大鼠，体重260-280克，取自São保罗大学生物医学科学研究所生理和生物物理系。将动物置于23±1°C的12:12 h明暗循环环境中。
这些大鼠被随机分为两个实验组:喂食随意(喂食/喂食)或48小时禁食和48小时再喂食(禁食/再喂食)。从喂养组和禁食组选取6只动物评估梗死前的代谢/炎症状况。禁食/再喂养组的动物在梗死诱导前48小时没有获得食物。这些动物被喂食标准的实验室饲料(NUVILAB CR-1, Nuvital, Curitiba, Brazil)。所有组都得到了水随意．São保罗大学生物医学科学研究所伦理委员会批准了这项研究。
如前所述，在下午5点至7点之间对左侧冠状动脉进行手术闭塞[17-20]。简单地说，左侧开胸，剖开第三肋间隙，露出心脏。左心耳远端1mm处用尼龙(6.0)缝线封堵左冠状动脉。胸部用丝线缝合。动物在恢复前一直保持通风。所有组均接受标准的实验室食物和水随意手术后。
根据美国超声心动图学会指南，冠状动脉结扎后48小时进行超声心动图检查。麻醉大鼠(每公斤体重80 mg氯胺酮和12 mg xylazine)，用SEQUOIA 512超声心动图系统(ACUSON公司，Mountain View, CA, USA)中的10-14 mHz线性换能器获得图像，测量梗死面积和收缩功能(射血分数)。MI的大小是在确定运动区(缺乏运动)、运动减少(运动减少)或运动障碍(运动反常)的基础上估计的[17,18,20]。心梗大小(左室周长%)的测量方法为功能障碍面积与左室心内膜边界总周长的比值。
ELISA双套试剂盒用于测定LV蛋白提取物中IL-1β、cc -2α/β和IL-6的含量(R&D Systems Inc.， Minneapolis, MN, USA)。结果按总蛋白水平归一化。
在进行ATP测定前，解剖左心室并保存在液氮中。组织在Polytron PT 3100中均质3/4位(litau - luceme, Switzerland)。以高氯酸(0.6 N)为萃取介质，用1 M碳酸氢钾中和上清。使用ATP测定试剂盒(Invitrogen, Eugene, Oregon, USA)测定上清液中的ATP浓度。ATP含量以μM计算，与组织湿重相关。
用Keppler & Decker[21]法测定LV糖原含量。这种方法是基于糖原转化为葡萄糖的淀粉葡萄糖苷酶(西格玛，圣路易斯。密苏里州,美国)。使用葡萄糖测定试剂盒(Bioclin, Belo Horizonte, MG, Brazil)定量糖原中的葡萄糖。糖原含量以每克左心室湿重的毫克糖基单位计算。
为了测定LV中TG的含量，将60 mg冷冻心脏组织在2:1氯仿和甲醇溶液中均质。匀浆在4°C下1000 g离心20分钟。下相转移到新管中，并在真空离心机(Vacufuge®+ Eppendorf)中蒸发。脂质颗粒悬浮于100 μ L无水乙醇中。用分光光度法测定TG含量，使用商业试剂盒(Bioclin, Belo Horizonte, MG, Brazil)。
通过心脏穿刺将喂养大鼠和禁食/再喂养大鼠的血液样本放入含有EDTA的试管中。饲养大鼠空腹6 h后采集血样。血液样本在4℃2000rpm离心15分钟，分离血清并冷冻。使用商用试剂盒(Bioclin, Belo Horizonte, MG, Brazil)测定血浆CK活性和葡萄糖浓度。血浆游离脂肪酸水平的估计与Falholt的报告一致et al。[22]。
结果以平均值±SEM表示。学生的t采用检验方法对两组进行比较:fed/fed与禁食/再进食、fed与禁食。值之间的差异被认为有统计学意义(p<0.05)。所有结果均使用GraphPad Prism 5.0统计软件(GraphPad software, San Diego, CA, USA)进行分析。
饲饲组在试验96 h内体重保持不变。然而，禁食/再喂食动物的体重在禁食48小时后下降(19%)，但之后保持不变(图1)。
图1所示。喂食/喂食和禁食/再喂食大鼠梗死诱导前(48 h)和之后(96 h)的体重(g)。以每组6只大鼠的平均值±SEM表示。（＊P< 0.05)。
禁食组的血糖水平降低了37%，而血浆游离脂肪酸浓度由于禁食48小时而增加了2倍(表1)。ATP浓度比进食组高33%，而糖原含量比进食组高4倍(图2A-B)。与进食组相比，禁食组大鼠心脏LV中TG含量降低61%(图2C)。
图2。诱发梗死前左心室ATP (A)、糖原(B)和TG (C)含量。研究了以下几组人随意(Fed)和48小时禁食(fasted)。以每组6只动物的平均值±标准差表示。＊P< 0.05;**P< 0.01与Fed组比较。
美联储 |
禁食 |
|
葡萄糖(mg / dL) |
113.6±3.26 |
71.40±3.61** |
游离脂肪酸(mM) |
0.32±0.017 |
0.62±0.072*＊ |
表1。血糖和游离脂肪酸浓度随意梗死诱导前空腹组(空腹组)和48 h空腹组(空腹组)。
数值表示为平均值±SEM。**P低于0.01的对照组。
版权所有OAT。版权所有与进食组相比，禁食组的cc -2α/β、IL-1β和IL-6水平升高(分别为3.2-、4.9-和1.4倍)(图3A-C)。
图3。梗死前左心室cc -2α/β、IL-1β和IL-6水平。研究了以下几组人随意(Fed)和48小时禁食(fasted)。以每组6只动物的平均值±标准差表示。＊P< 0.05;**P< 0.01与Fed组比较。
缺血诱导48小时后用超声心动图测量的梗死面积，禁食/再喂养组大鼠的梗死面积比喂食/再喂养组小37%(图4A)。此外，与fed/fed组相比，禁食/再进食组的射血分数高31%(图4B)。与喂食/喂食组相比，禁食/再喂食组血浆CK活性较低(图5A)。同样，喂食/喂食组的左室/心脏重量比低于禁食/再喂食组(图5B)。各组间左室中cc -2α/β、IL-1β和IL-6水平(图6A-C)和血浆FFA水平(图7)无差异。
图4。梗死诱导后48小时梗死面积和射血分数。研究了以下几组人随意(Fed/Fed)和48小时禁食/再进食(禁食/再进食)。每组至少7只动物的平均值±标准差表示。＊P与美联储/美联储组相比< 0.05。
图5。心肌梗死诱导48 h后血浆肌酸激酶活性及左室/心重比。研究了以下几组人随意(Fed/Fed)和48小时禁食/再进食(禁食/再进食)。每组至少6只动物的平均值±标准差表示。＊＊＊P与美联储/美联储组相比< 0.001。
图6。诱导梗死48 h后左心室cc -2α/β、IL-1β和IL-6水平。研究了以下几组人随意(美联储/美联储)和48小时禁食/再进食。以每组6只动物的平均值±标准差表示。
图7。梗死诱导48小时后血浆游离脂肪酸浓度。研究了以下几组人随意(美联储/美联储)和48小时禁食/再美联储。以每组7只动物的平均值±标准差表示。
本研究的关键发现是，在诱发梗死前禁食48小时，然后补食，限制了梗死区域的范围，并在一定程度上防止了预期的收缩功能障碍。此外，禁食48小时本身导致左心室ATP、糖原、cc -2α/β、IL-1β和IL-6水平升高，TG水平降低。
与我们的观察相符，斯诺里克et al。[23]表明，3天禁食可有效减少缺血/再灌注下的梗死面积和室性心律失常。冠状动脉结扎后24小时内，心肌细胞坏死死亡是心肌细胞损失[24]的主要原因。在这里观察到的梗死面积减小反映了禁食对坏死的保护作用，正如梗死后血浆CK活性降低和左室块保存所表明的那样。
禁食/补食对心脏保护作用的中介机制尚未完全阐明。然而，心肌梗死前糖原含量的增加可能起着重要作用。在离体心脏实验模型中，空腹或胰岛素诱导的糖原积累已被证明可提高ATP和ADP水平，使葡萄糖利用正常化，减少心肌细胞膜损伤，缩短缺血后的恢复时间。本研究表明，禁食48小时后永久性冠状动脉闭塞48小时再进食是保护心脏免受缺血性损伤的有效方案。
Kokubunet al。[26]显示，禁食12 h和48 h导致大鼠心脏糖原含量增加，而降低骨骼肌和肝脏的糖原含量。反et al。[27]假设血浆FFA浓度的增加减少了葡萄糖的利用，导致糖原在心脏的积累。铃木et al。[28]报道，在禁食16 h和48 h的小鼠中，血清FFA浓度增加了两倍。在我们的研究中，在禁食48小时后，血浆FFA浓度也增加了两倍。FFA在有氧运动中优先用作燃料，在非缺血性条件下占心脏产生ATP的60-90%[3,4]。在本研究中，禁食48小时的动物左室TG水平的下降表明梗死诱导前FA氧化的增加。这与ATP含量的增加有关。然而，在厌氧条件下，FA氧化降低，ATP的产生依赖于糖原降解产生的葡萄糖的厌氧利用[4,26]。
急性心肌缺血后细胞存活需要心脏内代谢的显著变化。古德温et al。[29]表明，在肾上腺素能刺激下，灌注心脏对葡萄糖的吸收相对于糖原分解的爆发是延迟的，表明糖原在应激条件下的重要作用。因此，空腹48小时后，血浆中FFAs水平以及左室ATP和糖原水平的增加是保护心脏免受梗死诱导损伤的适应性代谢变化的一部分。
Liepinshet al。[30]显示梗死面积增加体外空腹大鼠心脏灌注与进食大鼠心脏灌注比较。在缺血/再灌注模型中，这种效应在再灌注后立即观察到。他们使用添加了代谢物的Krebs-Henseleit缓冲溶液进行再灌注，以模拟禁食状态下的血浆参数。空腹状态下，血浆FFA浓度升高[28]。FA氧化取代了葡萄糖氧化，从而降低了厌氧糖酵解对心肌能量产生的贡献。我们的研究和Liepinsh的研究之间的区别et al。这可能是由于我们在补血48小时后测量了梗死面积，而此时血浆脂肪酸浓度并没有升高。因此，空腹状态下血浆FFA水平升高对代谢变化(左心室糖原和ATP增加)是必要的，但在心肌梗死情况下可能是有害的;如果永久升高，损害葡萄糖代谢。Malfitanoet al。在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠组织重建两周后，[20]表现出对缺血损伤的心脏保护作用。就像在禁食时，他们表明糖尿病的情况本身梗死诱导前左心室和游离脂肪酸血浆浓度的糖原增加，在低血浆和组织游离脂肪酸浓度下，与非糖尿病动物相比，收缩功能障碍和梗死面积更小。此外，以前的研究，使用体外分离的灌注心脏，得出禁食大鼠的心脏对缺血/再灌注引起的损伤有更好的保护作用[26,31,32];这些结果与我们的研究结果一致。这些研究使用缓冲溶液灌注，非常接近低血浆FFA水平的饲料状态。
我们发现MI诱导前空腹组左室中cc -2α/β、IL-1β和IL-6含量增加。Verweijet al。[16]报道IL-6和p -选择素mRNA表达增加对3天禁食小鼠肝脏缺血/再灌注损伤有保护作用。
血浆中过量的游离脂肪酸对心脏组织是有害的。周et al。[34]表明，肥胖患者心功能障碍是由暴露于高FFA水平的心血管细胞凋亡引起的。在喂食条件下，FAs主要由冠状动脉内皮表面富含tg的脂蛋白水解而来。在禁食期间，葡萄糖利用率的降低触发了从心脏TG释放的FA，导致FA的供应远远超过组织的氧化能力。过量的FFAs会导致细胞死亡，这种死亡被定义为“心脏脂肪毒性”[35]．这可能是禁食48小时引起LV炎症的机制。在禁食状态下，心肌细胞暴露于高浓度的血浆游离脂肪酸和来自心脏TG存储的游离脂肪酸。
48小时禁食引起的代谢变化(糖原、ATP积累和强烈的TG动员)使心脏处于“警报”状态，表明左室中cc -2α/β、IL-1β和IL-6水平升高，以应对最终的损伤发作。在禁食/再进食组观察到的较小的梗死面积和正常的射血分数可能是禁食强加的代谢适应的结果。
作者感谢J.R. Mendonça和Tatiana Carolina Alba Loureiro博士提供的出色技术支持。
A.L.S.J, m.c.i.和R.C.设计了实验。A.L.S.J, c.m.， d.f.和L.E.S.进行了实验。A.L.S.J, m.c.i.和RC对数据进行了分析和解释。文章由mci和r.c.a.l.s.j修改，E.I.撰写手稿。所有作者都阅读并认可了最终版本的手稿。
本研究得到了国家环境保护委员会Científico e Tecnológico (CNPq)、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)和古根海姆基金会的支持。
作者声明他们没有利益冲突。
Masayoshi Yamaguchi埃默里大学医学院
Reserach文章
收稿日期:2015年12月05日
录用日期:2015年12月24日
出版日期:2015年12月28日
©2016 Souza Junior AL.这是一篇开放获取的文章，根据创作共享署名许可协议发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Souza Junior AL, Malfitano C, Figueroa D, de Souza LE, Ignotti E, et AL .(2016)断食和补食对大鼠心肌梗死后果的影响。整合分子医学3:DOI: 10.15761/ im .1000191。
马托格罗索大学健康科学系。Av. Tancredo Neves, 1095-Cavalhada II -78200-000-Cáceres-Mato格罗索- PABX +55(65) 3221-0000，巴西
美联储 |
禁食 |
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葡萄糖(mg / dL) |
113.6±3.26 |
71.40±3.61** |
游离脂肪酸(mM) |
0.32±0.017 |
0.62±0.072*＊ |
表1。血糖和游离脂肪酸浓度随意梗死诱导前空腹组(空腹组)和48 h空腹组(空腹组)。
数值表示为平均值±SEM。**P低于0.01的对照组。
图1所示。喂食/喂食和禁食/再喂食大鼠梗死诱导前(48 h)和之后(96 h)的体重(g)。以每组6只大鼠的平均值±SEM表示。（＊P< 0.05)。
图2。诱发梗死前左心室ATP (A)、糖原(B)和TG (C)含量。研究了以下几组人随意(Fed)和48小时禁食(fasted)。以每组6只动物的平均值±标准差表示。＊P< 0.05;**P< 0.01与Fed组比较。
图3。梗死前左心室cc -2α/β、IL-1β和IL-6水平。研究了以下几组人随意(Fed)和48小时禁食(fasted)。以每组6只动物的平均值±标准差表示。＊P< 0.05;**P< 0.01与Fed组比较。
图4。梗死诱导后48小时梗死面积和射血分数。研究了以下几组人随意(Fed/Fed)和48小时禁食/再进食(禁食/再进食)。每组至少7只动物的平均值±标准差表示。＊P与美联储/美联储组相比< 0.05。
图5。心肌梗死诱导48 h后血浆肌酸激酶活性及左室/心重比。研究了以下几组人随意(Fed/Fed)和48小时禁食/再进食(禁食/再进食)。每组至少6只动物的平均值±标准差表示。＊＊＊P与美联储/美联储组相比< 0.001。
图6。诱导梗死48 h后左心室cc -2α/β、IL-1β和IL-6水平。研究了以下几组人随意(美联储/美联储)和48小时禁食/再进食。以每组6只动物的平均值±标准差表示。
图7。梗死诱导48小时后血浆游离脂肪酸浓度。研究了以下几组人随意(美联储/美联储)和48小时禁食/再美联储。以每组7只动物的平均值±标准差表示。
