看看最近的文章

摘要

星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥着重要作用。缺血，缺氧和创伤损伤导致神经元和星形胶质细胞的线粒体损伤。损坏的线粒体被隔离并通过显微育噬细胞（以下称为自噬）除去，这使得具有自噬体的细胞组分降低。除去线粒体的自噬称为mitophagy。磷脂酰乙醇胺（PE） - 缀合的微管相关蛋白1光链3b（LC3b）（LC3b-II）在形成自噬体中起至关重要的作用，并且未缀入-LC3B（LC3B-1）转化为LC3B-II的转化为LC3B-II自噬诱导的指数。γ-氨基丁酸受体相关蛋白质样2（GabaraPL2）是LC3B​​的副醇，其功能尚不清楚。在这项研究中，我们证明，通过羰基氰基3-氯苯基肼（CCCP）来上调总GabaraPL2的表达和未缀入的-GabaraPL2（GabaraPL2-I）的转化为PE缀合的GabaraP12（GabaraP12-II），其诱导线粒体功能障碍和碎片。相反，CCCP上调了LC3B-I至LC3B-II的转化，但不会影响总LC3B的表达。 Thus, GABARAPL2 might function in the process of mitophagy during the formation of autophagosomes, and the expressions of GABARAPL2 and LC3B were regulated differently. The mechanism underlying the role of GABARAPL2 in mitophagy requires further investigations.

关键字

自噬，自噬，LC3, GABARAPL2, GATE-16, GABARAP

介绍

星形胶质细胞的功能是形成血脑屏障，为神经元提供营养，保持细胞外离子平衡，包围突触，与神经元一起处理信息[1-4]。缺血、缺氧和创伤性损伤引起氧化应激，导致线粒体损伤[5-7]。这种线粒体损伤导致星形胶质细胞功能障碍和死亡[8,9]。因此，分离和清除受损线粒体是维持星形胶质细胞功能的必要手段。

宏观自噬(以下简称自噬)是细胞胞质组分的整体降解过程，如缺陷蛋白和受损细胞器[10]。自噬的过程包括起始、延伸、闭合和成熟等阶段[11-14]。在自噬过程中，细胞胞质成分被自噬小体分离。自噬体在伸长和闭合阶段形成，形成自噬体的重要蛋白是微管相关蛋白1轻链3 (LC3)亚家族和-氨基丁酸-a型受体相关蛋白(GABARAP)亚家族的成员。在大鼠中，LC3亚家族包括LC3A和LC3B, GABARAP亚家族包括GABARAP、GABARAP-like 1 (GABARAPL1)、GABARAP-like 2 (GABARAPL2，又称GATE-16)[15-19]。在LC3亚家族和GABARAP亚家族中，研究自噬最常用的是LC3B。LC3B由ATG4催化，然后通过ATG12-ATG5-ATG16复合物与磷脂酰乙醇胺(PE)结合。LC3B-PE (LC3B-II)在自噬体的形成中起着至关重要的作用，unconjugatned - lc3b (LC3B-I)向LC3B-II的转化是诱导自噬[18]的指标。虽然除了LC3B和GABARAP亚家族外，LC3亚家族成员的生理功能尚不清楚，但LC3亚家族成员和GABARAP亚家族成员均与PE相连，并参与自噬体的形成[16,20]。细胞内容物的自噬降解通过非选择性和选择性途径发生。 The degradation of damaged mitochondria is considered as the selective autophagy (mitophagy) [21]. Nix, which is an outer mitochondrial membrane protein, binds LC3A, GABARAP, GABARAPL1, and GABARAPL2 but only weakly binds LC3B. Nix and GABARAPL1 are engaged in mitophagy by carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) [22]. However, the functions of GABARAPL2 in damaged mitochondria remain unclear.

本研究采用星形胶质细胞模型常用的大鼠C6胶质瘤细胞，观察LC3亚家族和GABARAP亚家族所有成员的mRNA表达情况。此外，我们还检测了导致线粒体损伤的CCCP对C6胶质瘤细胞中GABARAPL2表达的影响。

材料和方法

材料

CCCP和抗肌动蛋白抗体来自Sigma (St. Louis, MO, USA)。抗lc3b抗体和抗gabarapl2 (GATE-16)抗体来自MBL(日本名古屋)。辣根过氧化物酶相关的二抗来自Zymed Laboratories (South San Francisco, CA, USA)。Mitotracker Red CMXRos线粒体探针购自Lonza Walkersville公司(Walkersville, MD, USA)。

细胞培养

大鼠C6胶质瘤细胞从日本大阪的JCRB细胞库中获得，并保存在添加10%胎牛血清、100单位/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM中。

逆转录- PCR

使用RNeasy Mini Kits（Qiagen，Valencia，Ca，USA）纯化从细胞分离的总RNA。在42℃下在20ml体积下在42℃下以20mL体积达60分钟，在1μgRNA上对逆转录酶反应进行逆转录酶反应。使用eMeraldamp Max PCR主混合物（Takara Bio，Otsu，Japan）进行45个循环的PCR，具有以下引物：LC3A，5'- ATGCCCTCCGACCGGCCTTTC-3'和5'- TCAGAAGCCGAAGGTTTTCT-3';LC3B，5'- ATGCCGTCCGAGAAGACCTTC-3'和5'- TTACACAGCCAGTGCTGTCC-3';Gabarap，5'- atgaagttcgtgtacaaaga-3'和5'-tcacagaccgtagacgctttc-3';gabarapl1,5'-atgaagtcagtataaaga-3'和5'-tcattcccgtagacactttc-3';gabarapl2,5'- atgaagtggatgtttaagga-3'和5'-tcagaagccaaaaagtgttc-3'。

所有引物均能扩增内含子，扩增范围为300 ~ 400 bp。

免疫印迹分析

用载体或CCCP处理的C6胶质瘤细胞被收集并溶解在修饰的RIPA缓冲液中(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25%脱氧胆酸钠，150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM氟磷酸二异丙酯，10 mg/mL的leupeptin, 10 mg/mL的抑肽酶，细胞裂解液超声分离，12,000 × g 4℃离心10分钟。上清液在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中电泳。转移到固定P膜(Millipore, Billerica, MA)。用1%脱脂牛奶和0.1% Tween 20/PBS (PBS- t)封闭膜，并与一抗孵育(根据制造商的建议稀释)。用PBS-T洗涤三次，用辣根过氧化物酶结合的二抗孵育1h。免疫反应蛋白用ImmunoStar LD (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)检测。

线粒体染色

大鼠C6胶质瘤细胞在35毫米玻璃底皿(日本静冈县磐城)上培养。细胞经CCCP处理4h。在孵育结束前30分钟加入Mitotracker Red CMXRos线粒体探针(最终浓度为50 nM)。使用带有AF6000软件的Leica DMI 6000 B显微镜(Leica, Wetzlar, Germany)获取图像。

统计分析

多次观察的结果显示为平均值±扫描电镜。多重比较采用单因素方差分析(ANOVA)，然后采用Dunnett检验。P<0.05被认为是显著的。

结果

RT-PCR检测C6胶质瘤细胞中LC3亚家族成员和GABARAP亚家族成员的mRNA表达水平(图1)。LC3亚家族成员和GABARAP亚家族成员的mRNA均在C6胶质瘤细胞中表达。LC3B mRNA表达最多，LC3A、GABARAP、GABARAPL2 mRNA表达中。GABARAPL1 mRNA轻度表达。我们检测了CCCP对GABARAPL2- ii和总GABARAPL2表达的影响。GABARAPL2- ii是PE-conjugated形式的GABARAPL2，可以结合自噬体。因此，GABARAPL2- ii的水平被认为反映了GABARAPL2的活性。GABARAPL2-I是未共轭形式，在SDS-PAGE[16]上的迁移速度比GABARAPL2-II慢。当CCCP添加到20µM时，GABARAPL2-II的表达量比对照增加了7倍，当CCCP添加到100µM时，GABARAPL2-II的表达量增加达到最大值(是对照的12倍)。在100µM的CCCP处理下，GABARAPL2的总表达量增加到对照的两倍，而在120µM的CCCP处理下，GABARAPL2的总表达量保持在这一水平(图2A)。此外,我们调查的影响120µM GABARAPL2-II CCCP的表达式和总GABARAPL2在不同时间点6 h。GABARAPL2-II增加13倍,控制响应120µM CCCP的1小时,之后GABARAPL2-II的表达水平保持在这个水平。 Total GABARAPL2 was increased about twice that of control in response to 120 µM of CCCP at 1h, after which the GABARAPL2 expression remained at this level.

我们在不同时间点检测了120µM的CCCP对LC3表达的影响，最长6 h(图3A)，因为LC3从LC3- i向LC3- ii的转化反映了自噬的诱导，是自噬体形成的关键步骤。与GABARAPL2的结果类似，CCCP 120µM 1h时LC3B-II表达增加约10倍于对照，此后保持在该水平。而120µM的CCCP对LC3B总表达量没有影响(图3A)。线粒体碎裂先于线粒体自噬[23]。我们证实网状线粒体网络被120µM的CCCP碎裂(图3B)。这些结果表明，线粒体功能障碍与GABARAPL2的表达和活性有关。

图1所示。C6胶质瘤细胞LC3亚家族和GABARAP亚家族成员的mrna表达。从C6胶质瘤细胞中分离总RNA, RT-PCR检测LC3A、LC3B、GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2 mRNA表达量，共45个周期。所有引物均跨越目的基因的一个以上内含子，扩增范围为300 ~ 400 bp。

图2。C6胶质瘤细胞中GABARAPL2的表达(A)用指示浓度的CCCP处理C6胶质瘤细胞4h。(B) C6胶质瘤细胞经120µM的CCCP处理，按规定时间。细胞裂解液用抗gabarapl2抗体进行western blot分析。将GABARAPL2的表达水平与作为内参的actin的表达水平进行比较。结果是处理水平与对照组的比率(平均值±扫描电镜，n = 3)。p值<0.05被认为有统计学意义。

图3。CCCP对LC3B表达及线粒体形态的影响。(A) C6胶质瘤细胞经120µM的CCCP处理，按规定时间。细胞裂解液用抗lc3b抗体进行western blot分析。将LC3B的表达水平与作为内参的肌动蛋白进行比较。结果是治疗水平与对照组的比率(平均值±扫描电镜，n = 3)。p值<0.05被认为有统计学意义。(B) C6胶质瘤细胞分别用载体或120µM的CCCP处理4h，用mitotracker观察线粒体形态。显示相应的DIC图像。鳞片，10µm。

讨论

分离和排除受损线粒体对维持星形胶质细胞的功能至关重要。受损线粒体通过自噬被隔离和清除，并伴有自噬体的形成。LC3B是LC3亚家族和GABARAP亚家族的成员，是一种特征明确的参与自噬体形成的蛋白。然而，LC3亚家族和GABARAP亚家族的其他成员的功能尚未完全阐明。虽然GABARAPL2在自噬中的生理功能尚不清楚，但已证明GABARAPL2与磷脂的连接方式与LC3磷脂化相同，并可能在自噬[16]中发挥作用。此外，GABARAPL2与泛素结合蛋白p62[24]和线粒体定位蛋白Nix[22]结合。p62和Nix都参与了CCCP诱导的自噬。在cccp诱导的线粒体自噬中，位于线粒体表面的电压依赖性阴离子通道(vdac)被PINK1和Parkin泛素化，然后p62与泛素化的vdac结合。LC3B携带带有泛素化vdac的p62进入自噬体[21,25,26]。另一方面，在cccp诱导的自噬[22]过程中，Nix与GABARAPL1相互作用，GABARAPL1将线粒体带到自噬小体。 CCCP is the uncoupler that induces the fragmentation of mitochondria, which precedes mitophagy [23]. Therefore, we examined the effects of CCCP on the activation and expression of GABARAPL2. CCCP induced the upregulation of both GABARAPL2-II and total GABARAPL2. In contrast, the treatment of CCCP resulted in LC3-II upregulation, which is the indicator of the formation of the autophagosome, while CCCP did not affect the levels of expression of total LC3B. Recent studies have shown that LC3B plays a role in the early stage of autophagy (elongation of the phagophore membrane) and that GABARAPL2 is necessary for the late stage of autophagy (autophagosome closure) [20]. Therefore, GABARAPL2 may function in autophagosome closure during mitophagy, and each member of the LC3 subfamily and GABARAP subfamily may have distinct roles in the process of autophagy.

综上所述，我们证明了在C6胶质瘤细胞中GABARAPL2- ii和GABARAPL2总量均被CCCP上调。GABARAPL2可能在分离受损线粒体中发挥作用，从而防止星形胶质细胞的功能障碍和死亡。GABARAPL2在星形胶质细胞中清除受损线粒体的机制以及GABARAPL2的功能有待进一步研究。

参考文献

2021年版权燕麦。所有权利reserv

1. Allaman I, Bélanger M, Magistretti PJ(2011)星形细胞-神经元代谢关系:或好或坏。趋势>34: 76 - 87。[十字架］
2. (2004)血脑屏障:概述:结构、调节和临床意义。neurobiol dis.16：1-13。[Crossref]
3. Parpura V, Heneka MT, Montana V, Oliet SH, Schousboe A, et al.(2012)神经胶质细胞在病理生理学中的作用。J Neurochem.121:速率。[十字架］
4. Stobart JL, Anderson CM(2013)星形胶质细胞作为神经元能量供应gatekeeper的多功能作用。前细胞>7: 38。[十字架］
5. 陈H，Yoshioka H，Kim Gs，Jung Je，Okami N，等。（2011）缺血性脑损伤中的氧化应激：细胞死亡机制和神经保护的潜在分子靶标。Antioxid氧化还原信号14: 1505 - 1517。[十字架］
6. Kochanek PM, Jackson TC, Ferguson NM, Carlson SW, Simon DW1，等(2015)创伤性脑损伤的新兴疗法。Semin神经35: 83 - 100。[十字架］
7. Sena LA, Li S, Jairaman A, Prakriya M, Ezponda T, et al.(2013)线粒体是通过活性氧信号激活抗原特异性T细胞所必需的。免疫力38: 225 - 236。[十字架］
8. 星形胶质细胞的线粒体功能:鱼藤酮氧化损伤的神经保护作用。> Res74: 80 - 90。[十字架］
9. 黄志刚，李志刚，李志刚(2004)星形胶质细胞凋亡与神经保护的关系。食物一般72: 111 - 127．[十字架］
10. 自噬与综合应激反应的关系。摩尔细胞40: 280 - 293。(Crossref)
11. (2014)巨噬细胞自噬机制的研究。细胞Res24: 24-41。[十字架］
12. Kiriyama Y, Kino K, Nochi H(2015)自噬与氨基酸及其代谢产物。综合食品、营养和代谢2：151-155。
13. Mizushima N，Komatsu M（2011）自噬：细胞和组织的翻新。细胞147：728-741。[十字架］
14. Shen HM, Mizushima N2(2014)在自噬通路的末端:对自噬中溶酶体功能的新认识。学生物化学趋势Sci39: 61 - 71。[十字架］
15. Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, Yamamoto A, Kirisako T, et al.(2000)哺乳动物酵母Apg8p同源物LC3在处理后定位于自噬体膜。EMBO J19日:5720 - 5728。[十字架］
16. Kabeya Y, Mizushima N, Yamamoto A, Oshitani-Okamoto S, Ohsumi Y, et al. (2004) LC3, GABARAP和GATE16定位于自噬体膜依赖于form-II的形成。J细胞科学117: 2805 - 2812。[十字架］
17. Tanida I, Komatsu M, Ueno T, Kominami E (2003) GATE-16和GABARAP是Apg7和Apg3介导的可信修饰词。生物化学与生物物理300: 637 - 644。[十字架］
18. Wild P, McEwan DG, Dikic I (2014) LC3的相互作用一目了然。J细胞科学127: 3 - 9。[十字架］
19. xin y，yu l，chen z，zheng l，fu q等。（2001）克隆，表达模式和三种人和两种小鼠同源物的克隆，表达模式和染色体定位。基因组学74: 408 - 413。[十字架］
20. Weidberg H, Shvets E, Shpilka T, Shimron F, Shinder V, et al. (2010) LC3和GATE-16/GABARAP亚家族在自噬体生物发生中都是必不可少的，但作用不同。EMBO J29日:1792 - 1802。[十字架］
21. Youle RJ, Narendra DP(2011)线粒体自噬机制。NAT Rev Mol Cell Biol12: 9-14。[十字架］
22. noak I, Kirkin V, McEwan DG, Zhang J, Wild P, et al. (2010) Nix是一种线粒体清除的选择性自噬受体。EMBO代表11: 45-51。[Crossref]
23. Gomes LC，Scorrano L（2013）Mitophy和Macroautophagy的线粒体形态。Biochim Biophys学报1833: 205 - 212。[十字架］
24. Pankiv S，Clausen Th，Lamark T，Brech A，Bruun Ja，等。（2007）P62 / SQSTM1直接与ATG8 / LC3结合，以促进通过自噬降解泛素蛋白质聚集体。J临床生物化学282: 24131 - 24145。[十字架］
25. Geisler S, Holmström KM, Skujat D, Fiesel FC, Rothfuss OC，等(2010)PINK1/ parkin介导的自噬依赖于VDAC1和p62/SQSTM1。Nat Cell Biol.12: 119 - 131。[十字架］
26. Johansen T, Lamark T(2011)自噬适配器蛋白介导的选择性自噬．自噬7: 279 - 296。[十字架］