上海交通大学Bio-X研究所，发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室，上海，200240
理研脑科学研究所研究资源中心，日本埼玉县，351-0198
上海交通大学Bio-X研究所，发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室，上海，200240
上海交通大学Bio-X研究所，发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室，上海，200240
理研脑科学研究所研究资源中心，日本埼玉县，351-0198
DOI: 10.15761 / IMM.1000118
神经元电压门控钙通道(VGCCs)包括Cav2.1和Cav2.2通道介导神经递质的囊泡释放的突触前机制。然而，不同的vgcc在空间短期记忆的神经回路中的作用尚未被研究。尽管有报道称，空间认知需要海马中cav2.1调控的信号，但cav2.2调控的功能仍然未知。本研究探讨了cav2.2介导的信号通路是否在Y迷宫自发交替模式测试中起作用。脑室内注射Cav2.2受体阻滞剂(ω-康诺毒素GVIA, 5 pg/侧)小鼠自发性交替模式受损。海马内注射ω-康诺毒素GVIA (5 pg/次)诱导学习障碍。这些结果表明，cav2.2介导的信号在海马依赖的空间认知中也至关重要。
Cav2.2，海马，神经元回路，ω-康诺毒素GVIA, Y迷宫测试
电压门控钙通道(VGCCs)介导多种神经元功能，包括神经递质释放、神经元兴奋、神经突生长、突触发生、神经元存活、分化、可塑性和基因表达调控[1-3]。VGCCs具有多个亚基组成的分子复合物:α1， α2-δ， β和γ[1]。α1亚基对通道功能至关重要，并决定了通道的基本性质。约190 kDa的跨膜α1亚基(约2000个氨基酸)由4个同源结构域(I-IV)组成，包括6个跨膜α螺旋(S1-S6)和位于S5和S6[4]之间的成孔P环。编码10个孔形成α1的基因以及几个剪接变体已被鉴定并鉴定为[4]。神经元vgcc包括Cav2.1和Cav2.2通道，主要表达于整个中枢神经系统[5]的突触前神经元末梢。先前的报道表明，Cav2.1和Cav2.2在海马体[5]中浓度很高，这可能与记忆的形成有关。
为了分析啮齿动物的记忆机制，动物通常在训练过程中通过正强化或负强化来学习规则。另一方面，人类的认知表现通常不会用强化物进行测试，比如强烈的饥饿感。Y迷宫测试是基于啮齿动物自发倾向于更频繁地进入一个新臂，而不是其他臂，因为小鼠天生倾向于探索[6]。因此，Y迷宫测试适用于记忆的形成。
滚动携带Cav2.1通道α1亚基(Cav2.1α1)突变的名古屋小鼠在大约2周龄后表现出严重的共济失调[7,8]。在之前的研究中，我们发现了杂合子的认知改变滚动名古屋(高校/ +)Y迷宫试验无明显缺陷小鼠[9,10]。人们认为，n -甲基-d -天冬氨酸(NMDA)依赖过程参与了工作记忆的形成机制。NMDA受体(nmar)拮抗剂在Y迷宫测试中损害小鼠的自发交替[11-14]。我们之前的报道显示，系统和海马内给药NMDAR拮抗剂的剂量较低高校/ +海马依赖性认知功能障碍[10]，提示海马Cav2.1/NMDAR信号通路在空间短期记忆中的重要性。
有报道称谷氨酸系统是受Cav2.1和Cav2.2调控的神经递质系统之一[15,16]。不同的vgcc在空间短时记忆神经回路中的作用尚未被研究。在本研究中，为了研究Cav2.2介导的突触传递与空间短期记忆之间的关系，我们使用Cav2.2抑制剂处理的小鼠进行了Y迷宫测试。这里提出的研究证明了海马cav2.2调节信号在空间短期记忆中的重要性。
所有实验程序均经上海交通大学动物实验委员会和日本理化研究所批准。C57BL/6J小鼠由Charles River Japan (Kanagawa, Japan)提供。小鼠可以自由地获得水和食物颗粒(CRF-1;东方酵母有限公司，东京，日本)，并被安置在12/12小时的光/暗周期下(08:00到20:00开灯)，时间为23±1°C和55±5%湿度。测试在循环的轻阶段进行。我们分别用两组两个月大的雄性小鼠进行每项行为测试。所有实验都不考虑小鼠的治疗条件。
在输注研究中，将Cav2.2阻滞剂ω-康诺毒素GVIA(10、50或100 pg/μL, Peptide Institute，大阪，日本)溶解在生理盐水(载体)中。在麻醉下，采用标准立体定向手术，将不锈钢引导套管(22号)植入侧脑室(小梁后方，-0.34 mm;中线外侧，±0.9 mm;硬脑膜腹侧，- 2.3 mm)或海马背侧(- 2.0 mm，±2.0 mm， - 2.0 mm)。小鼠手术后至少恢复1周。用异氟醚对小鼠进行短暂麻醉，以促进26号注射套管的插入。在行为测试前30 min，以0.05 μL/min的速度向侧脑室(0.1 μL/侧)或海马(0.1 μL/侧)输注。注射后将注射套管留在原位2分钟。药物剂量根据既往报告[17]确定。未接受药物治疗的小鼠接受了等量的载体。
Y迷宫测试在10:00至16:00之间进行，由训练有素的实验者进行，对小鼠品系一无所知。实验前至少2小时将小鼠移至行为试验室。y型迷宫装置由三个隔室组成(宽3厘米×长40厘米×高25厘米)，从中心向外辐射。在输注前，小鼠被放置在其中一个隔间中，并允许自由移动10分钟。实验室内的光强度为35勒克斯。手臂输入被定义为三条腿进入其中一条手臂，输入的顺序被手动记录。每只老鼠进行一次试验。变更定义为在连续的选项中进入所有三个部分。自发蚀变百分比计算为(实际蚀变/最大蚀变)× 100。在海马内注射实验完成后，在光镜下观察脑叶切片。将注射针放置在目标区域边界外的小鼠排除在行为分析之外。
在行为测试结束时进行了套管位置的组织学验证。小鼠经心静脉灌注0.9%生理盐水，然后再灌注4% PFA。从颅骨中取出后，将大脑固定在4%的PFA中，然后转移到30%的蔗糖溶液中，直到切片。冠状切片(40 μm厚，每120 μm取一次)在低温恒温器(-16°C)并安装在玻璃载玻片上。干燥后，切片用甲酚紫染色。
数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。使用Excel统计2006 (SSRI，东京，日本)对行为测试进行统计分析。数据分析采用重复测量方差分析和Tukey检验。
脑室内注射ω-康诺毒素GVIA对空间短时记忆的影响
我们用四组雄性小鼠(n=10)全身注射0(载体)、1、5或10 pg/片ω-康诺毒素GVIA。各组间臂条目数无显著差异[F(3,36)=0.9, P > 0.05](图1A)。但两组在自发改变方面差异有统计学意义[F(3,36)=133.6, P < 0.01](图1B)。给予5或10 pg/ side ω-conotoxin GVIA的小鼠比给予载体的小鼠表现出更少的变化。这些结果表明，阻断cav2.2介导的信号通路会损害短期记忆。
图1所示。在Y迷宫试验中，脑室内注射ω-螺毒素GVIA对总臂进入数(A)和自发变化(B)的影响。数据以均数±均数的标准误差(SEM)表示。** P < 0.01，与适当对照组比较(Tukey 's检验)。
我们用四组雄性小鼠(n=10)给予0(载体)、1、5或10 pg/支ω-康诺毒素GVIA海马内注射。各组间臂条目数无显著差异[F(3,36)=0.9, P > 0.05](图2A)。但两组在自发性改变方面差异有统计学意义[F(3,36)=129.5, P < 0.01](图2B)。给予5或10 pg/ side ω-conotoxin GVIA的小鼠比给予载体的小鼠表现出更少的变化。图3显示了海马背侧有代表性的输注套管位置。这些结果表明，阻断cav2.2介导的海马依赖信号会损害短期记忆。
图2。在Y迷宫试验中，海马内注射ω-康诺毒素GVIA对总臂输入数(A)和自发变化(B)的影响。数据以均数±均数的标准误差(SEM)表示。** P < 0.01，与适当对照组比较(Tukey 's检验)。
图3。在海马背侧放置插管。图为海马背侧有代表性的插管位置。
神经元vgcc包括Cav2.1和Cav2.2通道介导神经递质的囊泡释放的突触前机制。然而，不同的vgcc在空间短期记忆的神经回路中的作用尚未被研究。在本研究中，为了研究Cav2.2介导的海马信号与短期记忆形成之间的关系，我们使用野生型小鼠脑室内或海马内注射Cav2.2阻断剂(ω-康诺毒素GVIA)来研究自发性改变行为。一般认为，Cav2.2通道(Cav2.2α1) α1亚基上的ω-康诺毒素GVIA结合位点主要定位于通道的外部前庭，位于区域III的成孔S5-S6区域[18,19]。
我们发现，脑室内注射ω-conotoxin GVIA阻断了自发性改变行为，提示Cav2.2激活的信号级联在空间短期记忆中起作用。由于Cav2.2通道存在于[5]的各种突触上，很难从行为性能来评价全身注射研究。已有研究表明海马体对空间记忆的形成至关重要[20-22]。海马内注射ω-康诺毒素GVIA可破坏小鼠的自发交替行为。这些结果表明，海马中cav2.2调节的信号在空间记忆形成中很重要。
电生理学研究表明，钙诱导海马突触前神经末梢释放谷氨酸2 +流入Cav2.1和Cav2.2[15]。先前的研究也表明谷氨酸系统都参与认知过程[23]。也有报道称，全身和海马内给药NMDAR拮抗剂显示认知功能障碍[10]。这些结果表明，海马cav2.2介导的NMDA受体信号在空间短时记忆中的重要性。我们还表明，不同亚阈值剂量的药物和局部注射的联合研究对于诱导短期空间学习的影响和识别特定神经元回路[10]中的功能信号通路是有用的。在未来的研究中，将使用Cav2.2抑制剂和NMDA受体拮抗剂治疗的小鼠，研究Cav2.2介导的海马谷氨酸传递与空间短期记忆之间的关系。
综上所述，我们发现Cav2.2阻断剂破坏了Y迷宫测试中的自发交替行为。我们的研究结果表明，cav2.2介导的海马体信号在空间短期记忆中起着重要作用。
作者声明没有利益竞争。
OAT版权所有。版权所有作者(W.L.和E.T.)设计并监督了这项研究，并撰写了手稿。作者(Y.Z.和K.N.)进行了手术和行为实验。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年01月03日
录用日期:2015年1月14日
发布日期:2015年1月19日
©2015 Zhou Y.这是一篇根据创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和出处。
周毅，李伟，高桥E (2015) Cav2.2抑制剂对海马空间短期认知的影响。Integr Mol Med 2: DOI: 10.15761/ im .1000118
理研脑科学研究所研究资源中心，日本埼玉县和谷市广泽2-1，电话:+81-48-467-5871，传真:+81-48-467-9692。
图1所示。在Y迷宫试验中，脑室内注射ω-螺毒素GVIA对总臂进入数(A)和自发变化(B)的影响。数据以均数±均数的标准误差(SEM)表示。** P < 0.01，与适当对照组比较(Tukey 's检验)。
图2。在Y迷宫试验中，海马内注射ω-康诺毒素GVIA对总臂输入数(A)和自发变化(B)的影响。数据以均数±均数的标准误差(SEM)表示。** P < 0.01，与适当对照组比较(Tukey 's检验)。
图3。在海马背侧放置插管。图为海马背侧有代表性的插管位置。
