上海交通大学Bio-X研究所，发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室，上海，200240
理研脑科学研究所研究资源中心，日本埼玉县351-0198
上海交通大学Bio-X研究所，发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室，上海，200240
上海交通大学Bio-X研究所，发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室，上海，200240
理研脑科学研究所研究资源中心，日本埼玉县351-0198
DOI: 10.15761 / IMM.1000161
神经元电压门控钙通道(VGCCs)，包括Cav2.1和Cav2.2，介导神经递质囊泡释放的突触前机制。然而，不同的vgcc在空间和非空间短期记忆的神经回路中的作用仍然知之甚少。已有研究表明，在与海马体相关的物体定位测试中，cav2.1介导的信号通路对空间记忆起作用，但对与周围皮质相关的物体识别测试中的非空间记忆作用不大。因此，需要澄清cav2.2介导的功能。本研究考察了cav2.2介导的信号通路是否在空间和非空间短期记忆中发挥作用。在小鼠脑室内注射Cav2.2抑制剂ω-conotoxin GVIA (5 pg/side)可导致短期记忆对象定位和识别测试的缺陷。这些结果表明，不同的vgcc对内存性能有不同的影响。
Cav2.2，物体定位测试，物体识别测试，ω-conotoxin GVIA，短期记忆
电压门控钙通道(Voltage-gated calcium channels, VGCCs)可介导神经递质释放、神经元兴奋、神经突生长、突触发生、神经元存活、分化和可塑性等多种神经元功能，并调节基因表达[1-3]。VGCCs是由a1、β、α2-δ和γ亚基[1]组成的分子络合物。a1子单元对信道功能至关重要，它决定了信道的基本特性[1]。编码10个孔形成a1亚基和几个剪接变异体的基因已被鉴定和表征[4]。
不同的VGCCs在空间和非空间短期记忆的神经回路中的作用还没有被详细研究。先前的报道表明，短期记忆需要在海马体相关的物体定位测试中通过cav2.1介导的信号传导，但在周围皮质相关的物体识别测试[5]中对非空间记忆几乎没有影响。因此，需要澄清cav2.2介导的功能
已经设计了几种类型的行为任务来检查啮齿类动物[6]的记忆形成。这些任务大多使用正强化或负强化，如水迷宫测试的水浸泡和恐惧条件反射测试的电刺激。在这些测试中，动物通过训练阶段的强化来学习规则;然而，人类的认知表现通常没有强化物进行测试，这支持使用无强化物的认知测试，因为它更适合研究人类VGCC功能和记忆形成之间的关系。
物体定位测试是基于啮齿类动物自发的倾向，即在一个新的位置上探索一个物体的时间比探索一个没有移位的相同物体的时间更长，或比探索一个熟悉的物体的时间更频繁[7,8]。这两种测试都被用来评估记忆，而不需要传统的强化物。神经元VGCCs，包括Cav2.1和Cav2.2，主要表达于整个中枢神经系统的突触前神经元末梢[9]。
已有研究表明，海马和周围皮质分别参与物体位置记忆和物体识别记忆[10-13]。在本研究中，我们通过对注射了Cav2.2阻滞剂ω-conotoxin GVIA的小鼠进行空间记忆的对象定位测试和非空间记忆的对象识别测试，检验了Cav2.2介导的信号通路是否在空间和非空间短期记忆中发挥作用。
所有动物实验均经上海交通大学动物实验委员会和日本理化研究所批准。C57BL/6J小鼠由Charles River Japan(神奈川，日本)提供。这些小鼠被给予免费的水和食物颗粒(CRF-1;东方酵母有限公司，东京，日本)，并放置在12/12小时的明暗循环(从08:00到20:00亮灯)下，温度为23±1°C，湿度为55±5%。我们用两组两个月大的雄性小鼠原位杂交(ISH)行为试验。所有实验都是由对处理条件一无所知的研究人员进行的。
实验结束时，将灌注后的脑组织进行解剖，用组织固定剂(Gonostaff, Tokyo, Japan)固定，石蜡包埋，切片(6 μm厚切片)。与之前报道的[14]进行杂交，使用一个691 bp的cDNA片段，对应于Cav2.1a1 cDNA的6068-6748 bp(登录号:NM_007578.3)。
在输注研究中，将Cav2.2阻滞剂ω-conotoxin GVIA (100 pg/μL, Peptide Institute, Osaka, Japan)溶解在生理盐水(载药)中。药物剂量的确定基于之前的报道[15,16]。未治疗的小鼠接受等量的载药。在麻醉下并使用标准立体定位程序，将不锈钢引导套管(22号)植入侧脑室(bregma后-0.34 mm;中线外侧，±0.9 mm;从硬脑膜腹侧，−2.3 mm)，术后允许小鼠恢复至少1周。用异氟醚对小鼠进行短暂麻醉，以促进注射套管(26号)的插入。行为测试前30min，侧脑室以0.05 μL/min的速度输注0.1μL/侧。注射套管在注射后保持原位2分钟。
实验前至少2小时将小鼠转移到行为试验室。对象定位和对象识别测试按照报道进行，但进行了轻微修改[7,8]。这两项测试包括三个阶段:习惯化、习得和保持(习得阶段后30分钟)，在25勒克斯光照下，在聚碳酸酯笼子(35 × 35 × 35 cm)中进行。物体识别和物体定位测试的习惯化和习得阶段的程序是相同的。在习惯化阶段，小鼠分别接受每天60分钟的单次熟悉课程，持续3天，在此期间，它们被引入空的竞技场，以熟悉设备。
在获取阶段，小鼠接受了一个5分钟的会议，在此期间，两个相同的地板固定塑料柱(4厘米高× 5厘米直径)(a)被对称地放置在竞技场的中心，彼此相距11厘米，距离最近的墙壁12厘米。老鼠被允许在开阔的田野里探索物体。为了尽量减少嗅觉痕迹的存在，每次试验前都用70%的乙醇彻底清洗物体。在物体定位测试的保持阶段，小鼠被允许在两个相同物体的存在下探索开阔区域:未移位的物体A和移位的物体B(放置在仪器的角落)，持续10分钟。用手记录探索每个物体(鼻子指向小于1厘米的物体)的时间。识别指数(即，探索任何一个对象(获取阶段)或移位的对象(保留阶段)所花费的时间与探索两个对象所花费的总时间的比值)被用于测量空间记忆性能。
在物体识别测试中，小鼠在保持阶段被允许在两个不同物体的存在下探索开放区域10分钟:熟悉的物体A和新的物体B(三角形金字塔:4厘米高× 5厘米底面积)。开始对象和对象对在组内是平衡的。用手记录探索物体(鼻子指向物体，距离小于1厘米)的时间。识别指数(即，探索任何对象(习得阶段)或新对象(记忆阶段)所花费的时间除以探索两个对象所花费的总时间的比值)被用于测量非空间短期记忆。
数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。使用Excel统计2006 (SSRI，日本东京)对目标定位和目标识别测试进行了统计分析。数据分析采用重复测量方差分析与Tukey检验。
在行为测试结束时对插管位置进行组织学验证。小鼠经心静脉灌注0.9%生理盐水，然后注入4%多聚甲醛(PFA)。颅骨取出后，将大脑固定在4%的PFA中，然后转移到30%的蔗糖溶液中，直到切片。冠状切片(40 μm厚，每120 μm取一次)在低温恒温器(-16℃)上切割，安装在玻璃载玻片上。干燥后，切片用甲酚紫染色。
我们使用ISH来测定小鼠大脑中Cav2.2a1的表达模式。我们对空间记忆进行了对象定位测试，对非空间记忆进行了对象识别测试。在习得阶段，我们允许小鼠单独自由地探索两个物体以使其熟悉，在保留阶段，我们评估了训练后小鼠的记忆。
利用反义探针，广泛表达了一种1在大脑中检测到Cav2.2亚基，在海马体和周围皮层的表达水平特别高(图1)。感觉探针从任何大脑中都没有产生信号(数据未显示)。
目标定位试验采用雄性小鼠脑室内注射0(对照剂)或10 pg/侧ω-锥体毒素GVIA (n(图2)。灌胃小鼠和注射ω-锥体毒素gvia小鼠在获取阶段的探索时间分别为151.3±8.96秒和153.8±9.79秒。在训练过程中，注射载体和注射ω-锥体毒素gvia的小鼠在探索两个物体的时间方面没有发现显著差异。30分钟后，我们对训练后的小鼠进行记忆力评估。载体注射小鼠和ω-锥体毒素gvia注射小鼠在停留期的探索时间分别为411.5±15.49秒和301.2±8.13秒。虽然注射了ω-螺毒素gvia的小鼠在探索过程中探索两个物体的时间相等，但注射了载体的小鼠表现出了对移位物体的探索偏好。注射针放置在目标区域边界之外的小鼠被排除在行为分析之外(数据未显示)。这些结果表明，阻断cav2.2介导的信号通路会损害空间短期记忆。
图1所示。原位Cav2.1α1 mRNA的杂交。
图2。脑室内注射ω-螺毒素GVIA对物体定位试验的影响。在保持阶段，被注射的小鼠对移位物体的探索偏好明显强于对未移位物体的探索偏好。在注射ω-螺毒素gvia的小鼠中，移位物与非移位物所花费的时间没有显著差异。数据以均数±标准误差(SEM)表示。**P与适当对照相比<0.01 (Tukey’s检验)。
对象识别测试进行了2021版权所有。0(载体)或10 pg/side ω-conotoxin GVIA (n= 10)。在每项试验中(图3)，灌药小鼠和注射ω-锥体毒素gvia小鼠在获取阶段的探索时间分别为153.0±8.11秒和149.0±10.26秒。我们发现，在训练过程中，注射载体和注射ω-锥体毒素gvia的小鼠在探索两个物体的时间上没有显著差异。30分钟后，我们对训练后的小鼠进行记忆力评估。注射载体小鼠和注射ω-锥体毒素gvia小鼠的探测时间分别为414.5±12.56秒和302.0±15.21秒。尽管注射了载体的小鼠表现出了对新物体的探索偏好，注射了ω-锥体毒素gvia的小鼠表现出了相似的探索两个物体的时间。注射针放置在目标区域边界之外的小鼠被排除在行为分析之外(数据未显示)。这些结果表明，阻断cav2.2介导的信号通路会损害非空间短期记忆。
图3。脑室内注射ω-螺毒素GVIA对物体识别试验的影响。在保持阶段，小鼠对新物体的探索偏好明显强于对熟悉物体的探索偏好。注射了ω-螺毒素gvia的小鼠在不同物体之间的时间没有发现显著差异。数据以均数±标准误差(SEM)表示。**P与适当对照相比<0.01 (Tukey’s检验)。
神经元VGCCs，包括Cav2.1和Cav2.2，介导神经递质从突触前机制释放，这是行为的基础。然而，不同的vgcc在空间和非空间短期记忆神经回路中的作用尚未被探索。在本研究中，我们研究了在接受Cav2.2阻滞剂ω-conotoxin GVIA脑室内注射的小鼠中，Cav2.2介导的信号传导与空间和非空间短期记忆形成之间的关系。
我们首先检查了大脑中Cav2.2a1的表达模式。ISH显示，Cav2.2a1主要表达于整个中枢神经系统，包括海马体和周围皮层，如先前报道的[9]。给出了Ca的精确调节2 +信号在神经过程中是很重要的2 +通过不同的Cav2通道的电流会影响神经元和导致记忆形成的电路的功能。有报道称，Cav2.1a1在海马体和周围皮质[17]中强烈表达。我们之前的研究使用了老年杂合子的空间记忆的海马体相关物体定位测试和非空间记忆的周围皮质相关物体识别测试，来检验Cav2.1通道功能的细微破坏是否足以导致记忆形成的缺陷滚动名古屋(rol/+)小鼠携带Cav2.1a1突变[5]。在习得阶段，小鼠分别被允许自由探索两个物体，以使熟悉。在物体定位和物体识别测试的采集阶段所使用的程序是相同的，这表明在这两种测试的采集阶段将对包括关于两个相同物体的位置和特征以及场外线索在内的相同信息进行编码。rol/+组的小鼠在两项测试中都表现出了正常的习得阶段，在探索两个物体的时间方面，这表明小鼠对任务具有相同水平的好奇心和动机。在记忆保留阶段，我们对训练后的小鼠进行了记忆测试。rol/+小鼠在探索过程中表现出对物体定位的记忆缺陷，但在物体识别测试中没有。这些结果表明，小鼠对新位置或新物体的识别是通过不同的神经元过程进行的，在不同的区域有不同的Cav2.1通道。另一方面，尽管在物体定位和物体识别测试的获取阶段，注射ω-锥体毒素gvia的小鼠与注射ω-锥体毒素gvia的小鼠在探索两个物体的时间上没有显著差异，但注射ω-锥体毒素gvia的小鼠在保持阶段的表现表明在物体定位和物体识别测试中存在记忆缺陷。提示Cav2.2激活的信号级联在海马体依赖的空间记忆和周围皮层依赖的非空间短时记忆中起作用。
总之，我们发现在物体定位和物体识别测试中，Cav2.2阻滞剂破坏了空间和非空间短期记忆。为了研究Cav2.1或Cav2.2通道依赖性信号如何影响海马和周围皮层的短期记忆，需要进行电生理学研究和神经递质释放分析。我们还表明，不同阈值以下剂量的药物和局部输注的组合有助于诱导短期学习的效果，并有助于识别特定神经元回路[18]中的功能信号通路。因此，后续研究应该在类似的组合研究中检查cav2介导的信号传导和短期记忆之间的关系。
本研究得到国家973项目(2010CB529604)和国家科学基金项目(81271511和30900432)的资助。
作者声明没有竞争利益。
WL和ET设计和监督了研究，并撰写了手稿。YZ和KN分别进行手术和行为实验。所有作者都阅读并认可了最终版本的手稿。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年7月20日
录用日期:2015年8月18日
出版日期:2015年8月22日
©2015 Zhou Y.这是一篇基于创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
周燕，Niimi K, Li W, Takahashi E (2015) Cav2.2抑制剂对空间和非空间短期记忆的影响。整合分子医学2:DOI: 10.15761/ im .1000161。
日本理研脑科学研究所研究资源中心，埼玉县和库市广泽2-1，邮编351-0198，电话:+81-48-467-5871;传真:+ 81-48-467-9692。
图1所示。原位Cav2.1α1 mRNA的杂交。
图2。脑室内注射ω-螺毒素GVIA对物体定位试验的影响。在保持阶段，被注射的小鼠对移位物体的探索偏好明显强于对未移位物体的探索偏好。在注射ω-螺毒素gvia的小鼠中，移位物与非移位物所花费的时间没有显著差异。数据以均数±标准误差(SEM)表示。**P与适当对照相比<0.01 (Tukey’s检验)。
图3。脑室内注射ω-螺毒素GVIA对物体识别试验的影响。在保持阶段，小鼠对新物体的探索偏好明显强于对熟悉物体的探索偏好。注射了ω-螺毒素gvia的小鼠在不同物体之间的时间没有发现显著差异。数据以均数±标准误差(SEM)表示。**P与适当对照相比<0.01 (Tukey’s检验)。
