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抽象的

背景:在最常见的关节疾病骨关节炎(OA)中，炎症深度参与软骨退化。具体来说，炎症细胞因子如IL-1β可以促进基质降解酶的产生，如基质金属蛋白酶(MMP)和具有血栓反应蛋白基元(ADAMTS)的崩解素和金属蛋白酶。近年来，大豆肽被发现具有抗炎活性，它是由大豆蛋白水解酶消化产生的。因此，我们研究了大豆肽是否影响il -1β诱导的人关节软骨细胞基质降解酶的表达。方法:4例骨折患者和11例OA患者的关节软骨细胞分别用0、10、100µM大豆肽培养4小时。然后用IL-1β刺激细胞24小时。未受刺激的细胞作为对照。real - time-PCR定量检测细胞中MMP-3和ADAMTS-4 mRNA的含量。结果:100µM大豆肽处理显著抑制IL-1β刺激增强的MMP-3和ADAMTS-4 mRNA水平(p=0.036和0.005)，而10µM大豆肽处理未表现出显著抑制(p=0.91和p=0.20)。在100µM大豆肽处理中，MMP-3 mRNA水平的抑制与ADAMTS-4 mRNA水平的抑制相关(R²= 0.534）。结论：大豆肽抑制了人关节软骨细胞中基质降解酶的IL-1β诱导的表达。大豆肽可能有可能在OA中改善软骨降解。

关键字

disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif -4 (ADAMTS-4)， choncytes, IL-1β， Matrix metalloproteinase-3 (MMP-3)， Osteoarthritis;大豆肽

介绍

骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是最常见的关节疾病，组织学上以软骨变性和骨赘形成为特征，导致关节[1]破坏。许多OA患者遭受疼痛和残疾。因此，为了抑制骨性关节炎的症状，防止骨性关节炎的发展，需要开发新的药物。

关节软骨细胞通过产生和降解基质蛋白，如II型胶原和蛋白多糖[2]来维持软骨基质。在OA中，基质蛋白产生和降解之间的不平衡导致软骨降解[1]。骨性关节炎[1]的软骨降解与炎症密切相关。炎症细胞因子如IL-1β在骨性关节炎[3]患者的滑膜液中增加。特别是，据报道，IL-1β可促进消化多种类型胶原[4]的软骨细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP)-1、-3和-13。此外，据报道，IL-1β可增强软骨细胞中具有血栓反应蛋白基元(ADAMTS)-4和-5的崩解素和金属蛋白酶的分泌，这些软骨细胞可消化具有代表性的蛋白多糖[5]的凝集素。

大豆含有大量的营养物质，如蛋白质、脂肪和碳水化合物。最近，除了作为营养物质的作用外，大豆的新的生物学作用也得到了重视。具体来说，所谓的大豆肽，由大豆蛋白的水解酶消化产生，已经被报道显示出各种有益健康的功能，如降低胆固醇的特性，预防认知障碍，抗病毒作用，和抗炎作用[6-12]。关于抗炎作用，据报道大豆肽可抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞[10]产生环氧化酶-2和前列腺素E2。此外，据报道大豆肽可抑制lps诱导的人脐静脉内皮细胞[11]中IL-6和IL-8等促炎细胞因子的产生。在活的有机体内据报道，大豆衍生的二肽和三种富含肽，以缓解具有葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎的猪中的结肠和回肠炎症[12]。因此，预计大豆肽也会表现出在人关节软骨细胞中的抗炎作用，这可能导致抑制OA中的软骨降解。然而，尚未对我们的知识进行调查大豆肽对人关节软骨细胞的影响。我们在这里研究了大豆肽是否抑制了人类关节软骨细胞中基质降解酶的IL-1β诱导的表达。

材料和方法

临床样本和软骨细胞的制备

4例骨折患者(正常，N1-4, 1例男性;年龄58岁，女3人;全髋关节置换术的平均年龄为78.0岁[58-88]。11例OA患者(oa1 - 11,1例男性;82岁，女10人;全膝关节置换术的平均年龄为78.7岁(66-86岁)。

根据Kellgren和Lawrence标准[13]进行OA诊断。每位患者均获得书面知情同意，本研究方案经圣玛丽安娜大学医学院伦理委员会批准。这项研究是按照世界医学协会《赫尔辛基宣言》进行的。

软骨细胞制备时，仔细地从软骨标本中去除滑膜组织后，将软骨切碎，清洗，并用胶原酶处理(Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)。分离的软骨细胞(第0代，P0代)在添加了10%胎牛血清(Wako)、100单位/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM, GIBCO, Carlsbad, CA)中进行单层培养，并在I型胶原蛋白包被培养盘上培养。

IL-1β和大豆肽治疗软骨细胞

[14]为主要由二肽和三肽组成的大豆肽(hinut - am, FUJI OIL Co. Ltd, Osaka, Japan)。

软骨细胞(P1-P3, 1.0x10)⁷分别用0、10和100µM大豆肽培养4小时。然后分别用1µg/ml IL-1β (R&D, Minneapolis, MN, USA)、1µg/ml IL-1β和10µM大豆肽、1µg/ml IL-1β和100µM大豆肽处理细胞24小时。未处理的细胞作为对照。

细胞活力评估

通过台盼蓝染色评估细胞活力。通过用0.1％胰蛋白酶-EDTA（Sigma-Aldrich）处理收获用0,10或100μm大豆肽培养的软骨细胞24小时。通过以1000×g离心10分钟收集的细胞沉淀，用0.5％台盼蓝（Sigma-Aldrich）染色。在显微镜下使用血胞减速计计算蓝色 - 陶瓷细胞的数量和细胞总数。

RNA的提取和逆转录

使用RNEASY®（​​Qiagen，Vengers，荷兰）和高容量cDNA逆转录Kits®（Life Technologies，Rockville，MD，MD，USA）进行来自软骨细胞样品的RNA的RNA和RNA样品的逆转录。

实时定量PCR

根据制造商的说明，使用ABI Prism 7000序列检测系统(应用生物系统公司，福斯特市，CA, USA)进行实时PCR。为了检测MMP-3和ADAMTS-4的mRNA水平，将1µg总rna来源的cDNA与TaqMan®基因表达检测试剂盒(Hs00968305_m1和Hs00192708_m1, Applied Biosystems)和TaqMan®基因表达Master Mix (Applied Biosystems)混合。然后对混合物进行实时PCR。热循环条件为:95℃10 min, 95℃15 s, 60℃60 s，循环40次。为了检测GAPDH的mRNA水平，将1µg总rna来源的cDNA与300 nM的正反引物和Power SYBR®Master Mix(应用生物系统)混合。扩增GAPDH DNA片段的引物核苷酸序列如下:GAPDH为:5 ' -TGGTATGGTGGAAGGACTCA和5 ' -ATGCCAGTGAGCTTCCCGTT。在相同条件下进行Real time PCR。

统计分析

采用IBM SPSS Statistics (Ver.22.0)进行统计学分析。采用Wilcoxon符号秩和检验(p<0.05)分析大豆肽对il -1β诱导的基质降解酶的影响。

结果

大豆肽对人关节软骨细胞il -1β诱导的基质降解酶的影响

首先，我们测试了这里使用的大豆肽的浓度是否显示出对人关节软骨细胞的细胞毒性。结果，我们证实高达100μm大豆肽不影响软骨细胞的活力（图1a）。然后，我们在软骨细胞中调查了大豆肽对IL-1β诱导的MMP-3和Adamts-4的表达的影响。我们培养有或没有大豆肽4小时的软骨细胞，然后用IL-1β刺激。然后，我们评估MMP-3和Adamts-4的mRNA水平。

图1所示。大豆肽对il -1β诱导人关节软骨细胞MMP-3和ADAMTS-4表达的影响．(一)取3例OA患者(OA1-3)关节软骨细胞，分别用0、10、100µM大豆肽培养24小时。细胞经台盼蓝染色。细胞存活率(%)计算公式如下:(未染色细胞数/细胞总数)×100。SP,大豆肽。(B)4例骨折患者(N1-4)和11例OA患者(OA1-11)的关节软骨细胞分别用0、10和100µM大豆肽培养4小时。然后用IL-1β刺激细胞24小时。未受刺激的细胞作为对照。RT-qPCR检测MMP-3和GAPDH mRNA水平。用GAPDH校正MMP-3的mRNA水平。左:每个未处理的样本中MMP-3的正确mRNA水平定义为1.0。右图:在每个il -1β处理的样本中，MMP-3的正确mRNA水平被定义为1.0。p值使用表1所列值进行Wilcoxon符号秩检验。(C)4例骨折患者(N1-4)和7例OA患者(OA5-11)的关节软骨细胞的处理方法与(A)相似。使用GAPDH校正ADAMTS-4的mRNA水平。左:每个未处理的样本ADAMTS-4的正确mRNA水平定义为1.0。右图:在每个il -1β处理的样本中，ADAMTS-4的正确mRNA水平被定义为1.0。p值使用表2所列值进行Wilcoxon符号秩检验。SP,大豆肽。(D)使用表1和表2所示的值计算每个软骨细胞样本(4例骨折患者(N1-4)和6例OA患者(OA6-11))中MMP-3和ADAMTS-4 mRNA水平的抑制率(%)。100µM大豆肽处理对MMP-3和ADAMTS-4 mRNA水平的抑制关系如图所示。决定系数(R²)，采用回归分析计算。

在评估MMP-3 mRNA水平时，我们首先证实IL-1β刺激后MMP-3 mRNA水平显著升高(p<0.01，表1和图1B，左图)。值得注意的是，在每个受刺激的软骨细胞样本中，MMP-3的mRNA水平都因IL-1β刺激而升高。然后我们评估了大豆肽对il -1β诱导的软骨细胞MMP-3表达的影响。结果，100µM大豆肽处理显著抑制了IL-1β刺激增强的MMP-3 mRNA水平(p=0.036，表1和图1B，右图)，尽管10µM大豆肽处理没有显示出显著的抑制(p=0.91，表1和图1B，右图)。

样本	控制	il - 1β	il - 1β	il - 1β
不。			+ 10µM HN-AM	+100μmhn-am
N1	0.063 0	13.2	16．2	15.9
N2 N3	1.49	60.0	73.3	54.4
N3	2.13	13.5	13.0	11.9
陶瓷	1.45	10．3	10．1	9.27
OA1	1.09	4.62	4.49	2.58
OA2	2.93	7.98	6.98	6.62
OA3	0.77	3.17	2.85	2.48
OA4	0.91	6.50	4.60	5.52
OA5	0.81	42．5	19.2	5.72
OA6	０．３３	15.9	20.7	25.0
OA7	0.02	15.9	16.3	10．3
OA8	1.58	12．1	7.93	4.04
OA9	0．20	10.9	10.9	9.13
OA10.	1．02	13.0	14.2	8.11
oa11.	0.22	3.55	3.91	3．50
平均	1．00	15.5	15．0	11.6
STDEV.	0.82	15．4	17．1	13.2
p价值	－	< 0.01	0.91	0.036
		(与控制)	(对il - 1β)	(对il - 1β)

表1．大豆肽对il -1β诱导的人软骨细胞MMP-3 mRNA水平的影响

SP、大豆肽

在对ADAMTS-4的评估中，我们首先证实IL-1β刺激后ADAMTS-4 mRNA水平显著升高(p<0.01，表2和图1C，左图)。11个软骨细胞样本中有10个通过IL-1β刺激上调了ADAMTS-4的mRNA水平。因此，我们利用10个对IL-1β阳性反应的软骨细胞样本来评估大豆肽对IL-1β诱导的ADAMTS-4表达的影响。结果，100µM大豆肽处理显著抑制了IL-1β刺激增强的ADAMTS-4 mRNA水平(p=0.005，表2和图1C，右图)，尽管10µM大豆肽处理没有显示出显著的抑制(p=0.20，表2和图1C，右图)。

表2。大豆肽对il -1β诱导的人软骨细胞ADAMTS-4 mRNA水平的影响

2021年版权燕麦。所有权利reserv

样本	控制	il - 1β	il - 1β	il - 1β
不。			+ 10µM HN-AM	+100μmhn-am
N1	０．１６	1.37	1.25	1．00
N2 N3	0．23	2.78	2.94	2.00
N3	０．１３	0.74	0．31	0.59
陶瓷	0.92	1.49	1．65	1.38
OA5	2.03	1.77	-	-
OA6	1.30	4.71	5.53	4.43
OA7	1．70	2.96	2.66	1.88
OA8	1．02	1.51	0.66	0．43
OA9	1.47	2.20	1.46	1．16
OA10.	0.91	3.64	2.98	2.52
oa11.	1．11	1.83	1.66	1.14
平均	1．00	2.27	2.11	1．65
STDEV.	0.63	1．16	1.50	1.17
p价值	－	< 0.01	0．20	０．００５
		(与控制)	(对il - 1β)	(对il - 1β)

SP、大豆肽

最后，我们研究了大豆肽对MMP-3表达的抑制作用与ADAMTS-4表达的相关性。结果表明，在100µM大豆肽处理下，MMP-3 mRNA水平的抑制与ADAMTS-4 mRNA水平的抑制存在相关性(R²= 0.534,图1 d)。此外，大豆肽对骨关节炎患者MMP-3和ADAMTS-4表达的抑制作用高于骨折患者(图1D)。

讨论

我们在这里发现大豆肽抑制il -1β诱导的人关节软骨细胞MMP-3和ADAMTS-4的产生。

大豆肽作用的可能机制如下:1)大豆肽通过与IL-1β或IL-1β受体结合，抑制IL-1β信号转导的输入;2)大豆肽进入软骨细胞，抑制细胞内IL-1β信号转导;3)大豆肽与未知受体结合，然后阻断IL-1β信号转导。

在第一种可能的机制中，IL-1β通过特异性结合IL-1β受体激活信号转导系统。在大多数测试的软骨细胞样本中，100µM大豆肽处理可抑制il -1β刺激软骨细胞组MMP-3的mRNA水平(图1B)。然而，在一小部分被测试的软骨细胞样本中，MMP-3的mRNA水平通过大豆肽处理而增加(图1B)。如果大豆多肽与IL-1β或IL-1β受体结合，在所有测试的软骨细胞样本中，MMP-3的mRNA水平将被抑制。因此，大豆肽不太可能抑制IL-1β和IL-1β受体之间的结合。

第二种可能的机制是，在大豆肽处理的软骨细胞样本中，MMP-3 mRNA水平的抑制与ADAMTS-4 mRNA水平的抑制密切相关(R²= 0.5343,图1 d)。因此，我们认为大豆肽通过抑制il -1β诱导的MMP-3和ADAMTS-4的共同途径来抑制它们的产生。IL-1β通过激活多种蛋白激酶(如p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、c-Jun n端激酶(JNK)和Akt)来激活信号转导系统[15-18]。活化的MAPK、JNK、Akt可促进多种炎症因子和基质降解蛋白的产生，激活AP-1、NF-kB[19]等转录因子。Akt被激活的磷酸肌醇3-激酶(PI3K)磷酸化，导致NF-kB[20]的激活。NF-kB激活促炎细胞因子和基质降解酶MMP-3和ADAMTS-4的转录[4,5]。据报道，大豆蛋白β-聚甘氨酸衍生的多肽可通过抑制lps诱导的炎症模型小鼠[11]肝脏和主动脉中Akt的磷酸化而灭活NF-kB。因此，我们推测大豆肽可能通过抑制Akt磷酸化而抑制PI3K-Akt-NF-kB信号通路，从而抑制il -1β诱导的MMP-3和ADAMTS-4的产生。

关于第三种可能的机制，虽然大豆肽的受体还没有被确定，但这种受体可能存在并传递信号。例如，M. Chimenet al。据报道，肽，一种蛋白质衍生自14.3.3 zeta delta蛋白的肽，用钙粘蛋白-15作为受体，并导致来自内皮细胞的鞘氨酸-1-磷酸盐[21]。与Pepitem的情况一样，可能存在大豆肽的受体，这应该是研究的。包括这些3种可能的机制，应在不久的将来调查大豆肽的作用机制。

我们在这里发现大豆肽显著抑制il -1β诱导的人关节软骨细胞MMP-3和ADAMTS-4的产生。在大多数测试的软骨细胞样本中，100µM大豆肽处理均抑制了MMP-3和ADAMTS-4的mRNA水平(图1C)。然而，在一小部分被测试的软骨细胞样本中，MMP-3和ADAMTS-4的mRNA水平都没有被大豆肽处理抑制(图1C)。因此，大豆肽的作用将受到个体遗传背景的影响。可能有不同的亚群对大豆肽表现出不同的敏感性。

有趣的是，大豆肽对骨关节炎患者MMP-3和ADAMTS-4表达的抑制作用往往高于骨折患者(图1D)。OA软骨细胞对大豆肽的敏感性可能高于正常软骨细胞。

本研究使用的大豆肽主要由二肽和三肽[14]组成。然而，抑制il -1β诱导的MMP-3和ADAMTS-4产生的特异性肽尚未被鉴定出来。最近，有报道称，从大豆主要蛋白甘氨酸中提取的Val-Pro-Tyr三肽下调了肠上皮细胞和巨噬细胞[22]中促炎细胞因子的表达。本研究中使用的大豆多肽预计含有甘氨酸，因此将含有缬氨酸。Val-Pro-Tyr三肽可能是本研究中抑制IL-1β作用的大豆肽之一。在这一点上，还需要进一步的研究。

我们的数据显示，大豆肽抑制了il -1β诱导的人关节软骨细胞MMP-3和ADAMTS-4的产生在体外．我们的数据表明大豆肽可用于预防或抑制OA中的软骨降解。

确认

我们感谢Sawada Y女士、Tamaki M女士、Mogi T女士和Suzuki M女士的技术援助。本工作得到富士石油有限公司的支持。

利益冲突陈述书

Arito M，Mitsui H，Kurokawa Ms，Niki H，Yudoh K和Kato在研究期间，富士油有限公司的赠款和非财政支持。KATO T从提交的工作之外举报了陈柴制药有限公司的赠款和非财政支持。Yudoh K报告了维生素C60 Bioresearch Corporation的非金融支持，在提交的工作之外。Kamada T无需披露。

参考文献

1. Loeser RF, Goldring SR, Scanzello CR, Goldring MB(2012)骨关节炎:一种关节作为器官的疾病。关节炎感冒64: 1697 - 1707。［Crossref］
2. Golding MB，Marcu KB（2009）健康和风湿病的软骨稳态。关节炎Res其他11: 224。［Crossref］
3. Kaneyama K, Segami N, Nishimura M, Suzuki T, Sato J(2002) 121例颞下颌关节疾病的滑膜液中促炎细胞因子的重要性。口腔颌面外科40: 418 - 423。［Crossref］
4. Richardson DW, Dodge GR(2000)白细胞介素-1 β和肿瘤坏死因子- α对培养的马关节软骨细胞基质相关基因表达的影响。美国兽医协会61：624-630。［Crossref］
5. Bau B, Gebhard PM, Haag J, Knorr T, Bartnik E，等(2002)人关节软骨细胞中胶原酶和凝集酶的相对信使RNA表达谱在活的有机体内和体外。关节炎感冒46：2648-2657。［Crossref］
6. Inoue N, Nagao K, Sakata K, Yamano N, Gunawardena et al.(2011)大豆蛋白源性低甘油三酯双肽的体外和体内筛选。脂质健康说10：85。[Crossref］
7. Maebuchi M，Kishi Y，Koikeda T，Fruya S（2013）大豆肽膳食补充剂增加了血清多巴胺水平，改善了具有轻度认知障碍的受试者的认知功能障碍。日本杂志41: 67 - 73。
8. Katayama S, Imai R, Sugiyama H, Nakamura S(2014)口服大豆肽通过诱导神经营养因子抑制SAMP8小鼠认知功能下降。农业食品化学杂志62: 3563 - 3569。［Crossref］
9. Matemu Ao，Nakamura K，Kayahara H，Murasawa H，Katayama S等人。（2011）通过饱和脂肪酸酰化增强大豆β-甘氨酸衍生肽的抗病毒活性。J食品科学76: M299-M304。Crossref］
10. Martinez-Villaluenga C, Dia VP, Berhow M, Bringe NA, Gonzalez de Mejia E(2009)富含-conglycinin大豆基因型的蛋白水解物抑制脂质积累和炎症体外。Mol Nutr Food Res53: 1007 - 1018。［Crossref］
11. Burris RL, Ng HP, Nagarajan S(2014)大豆蛋白通过抑制NF-κB和AKT信号通路抑制载脂蛋白e缺陷小鼠炎症诱导的VCAM-1和炎症因子的诱导。欧元J减轻53: 135 - 148。［Crossref］
12. Young D, Ibuki M, Nakamori T, Fan M, Mine Y(2012)大豆衍生的二肽和三肽缓解猪右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎的结肠和回肠炎症。J减轻142: 363 - 368。［Crossref］
13. 凯格伦、劳伦斯(1957)骨关节病的放射学评估。安大黄说16：494-502。［Crossref］
14. Nakamori T(2010)大豆肽作为功能性食品原料。主要用途:生物活性蛋白和多肽作为功能食品和保健品。(Mine Y, Li-Chan ECY, Jiang B，编)Wiley-Blackwell出版社，霍博肯，265-271页
15. Guy GR, Philp R, Tan YH(1995)肿瘤坏死因子和白细胞介素-1信号转导通路中蛋白激酶的激活和蛋白磷酸酶2A的失活。欧元J物化学229: 503 - 511。［Crossref］
16. Bankers-Fulbright JL, Kalli KR, McKean DJ(1996)白细胞介素-1信号转导。生命科学59: 61 - 83。［Crossref］
17. Li X, Tupper JC, Bannerman DD, Winn RK, Rhodes CJ，等(2003)Phosphoinositide 3 kinase介导toll样受体4诱导的内皮细胞NF-kappa B活化。感染IMUN71: 4414 - 4420。［Crossref］
18. Tsuzaki M, Guyton G, Garrett W, Archambault JM, Herzog W, et al. (2003) IL-1 β诱导人肌腱细胞中COX2, MMP-， -3和-13,ADAMTS-4, IL-1 β和IL-6。J . Res21日:256 - 264。［Crossref］
19. Williams DH, Jeffery LJ, Murray EJ (1992) aurothiglucose通过作为IL-1功能拮抗剂抑制NF-kB和AP-1活性。Biochim Biophys学报1180：9-14。［Crossref］
20. Yap TA, Garrett MD, Walton MI, Raynaud F, de Bono JS等(2008)靶向PI3K-AKT-mTOR通路:进展、陷阱和承诺。当今药物杂志8: 393 - 412。［Crossref］
21. Chimen M, McGettrick HM, Apta B, Kuravi SJ, Yates CM, et al.(2015)在自身免疫和慢性炎症疾病中，B细胞来源的肽对T细胞运输的稳态调节受损。Nat地中海21日:467 - 475。［Crossref］
22. Kovacs-Nolan J, Zhang H, Ibuki M, Nakamori T, Yoshiura K, et al. (2012) pept1转运大豆三肽VPY可减少肠道炎症。Biochim Biophys学报1820: 1753 - 1763。［Crossref］