圣玛丽安娜大学医学院泌尿系，日本川崎216-8511
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DOI: 10.15761 / IMM.1000175。
为了克服临床移植器官的短缺，全器官工程近年来一直在尝试。在这种方法中，通过动脉灌注洗涤剂完全去除器官的细胞成分，所得到的细胞外基质支架作为后续细胞播种的模板，以创建新器官。然而，再细胞化的低效率阻碍了用这种方法生成功能齐全的器官。为了提高再细胞化的效率，我们将小鼠肾脏脱细胞，随后在负压环境中对肾脏支架进行再细胞化。通过将支架放置在定制的设备中施加压力梯度，该设备可以去除空气以产生真空。再细胞化按序进行通过动脉路线或逆行的通过输尿管路线。在动脉内接种内皮细胞或输尿管内灌注小管细胞后，计数肾门横切面细胞数。细胞成功地在没有损伤支架的情况下播种。通过应用以经验方式确定的不同压力梯度，我们观察到在血管和薄壁组织中移植细胞的增加，尽管薄壁组织的播种似乎效率较低。接种后的内皮细胞在72小时灌注培养中存活并增殖，血管阻力随着肾脏支架细胞体积的增加而增加。综上所述，采用压力梯度播种法是安全有效的。动脉和输尿管播种路的梯度强度应有所不同。这种方法可能有助于提高播种效率，并有助于实现开发用于临床的功能器官的最终目标。
器官移植已经用于治疗各种器官的终末期疾病，并取得了巨大成功，但供体器官供应有限，不可能治疗每一位需要移植的患者。例如，在日本，目前约有1.2万名患者正在等待肾移植，超过30万名终末期肾病[1]患者正在进行血液透析。然而，每年只有大约1500名患者接受肾移植。
为了解决器官移植短缺的问题，近年来研究了一种新的制造器官的方法[3-5]。在这种新方法中，通过使用清洁剂的动脉灌注完全去除整个器官的细胞成分，并将所得到的细胞外基质(ECM)支架用作细胞播种的生物模板。最终的目标是实现体外产生有功能的器官。
该方法已应用于各种器官，包括心脏、肝脏、肾脏、肺等[6-13]，但尚未实现创造一个功能齐全的器官。虽然有许多障碍需要克服，低效率的再细胞化是需要解决的关键因素之一。因此，本研究对提高再细胞化效率进行了研究。在我们将整个小鼠肾脏脱细胞后，随后在负压环境下对肾脏支架进行再细胞化，我们检查了这是否促进了再细胞化过程。此外，我们对网状支架进行灌注和培养，以确定网状支架是否允许器官特异性功能的发展。
我们使用成年雄性sd大鼠(Clea Japan, Inc.， Tokyo, Japan)，体重300-500克，按照我们的机构规定。麻醉后腹腔注射戊巴比妥(0.05 mg/g)，全身肝素化(0.4 iu/g)通过股静脉，左肾在剖腹中线手术中暴露。主动脉灌注生理盐水以清除血液，然后用24号导管(Becton, Dickinson and Company)插管左肾动脉以进行灌注。我们也将相同类型的套管插入输尿管。
我们分离出肾脏，用改良的维吾尔法进行脱细胞等．[7]。简而言之，在肾动脉灌注生理盐水50cm H后2为了去除残留血液，我们以1毫升/分钟的速度注入浓度逐渐增加的十二烷基硫酸钠(SDS)，顺序如下:0.01% 12小时，0.1% 12小时，1% 24小时。SDS已交付通过蠕动泵(PeristaTM泵，Atto公司，东京，日本)。脱细胞后，我们用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)和1% Triton X-100冲洗所得的肾脏支架30分钟，最后用含有青霉素-链霉素和0.05%叠氮化钠的PBS冲洗60分钟。然后将支架储存在-4°C。
为了进行组织学分析，脱细胞支架用福尔马林固定，切片用苏木精和伊红(HE)染色。用扫描电镜(SEM)对2.5%戊二醛固定支架进行分析。利用抗IV型胶原抗体(Southern Biotech, Birmingham, USA)、抗层粘连蛋白抗体(Abcam)对IV型胶原蛋白、层粘连蛋白进行免疫组化，以评估这些基底膜蛋白的保留TM，英国剑桥)。核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚反染色(DAPI, ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA)。
我们植入脱细胞肾支架通过大鼠主动脉内皮细胞(RAE)输注肾动脉(顺行播种)和大鼠上皮小管细胞(NRK-52E)输注输尿管(逆行播种)。RAE细胞购自VEC Technologies, Inc.(纽约，美国)，NRK-52E购自欧洲细胞培养收藏。RAE细胞悬浮在10 × 106细胞/ml在Dulbecco的改良Eagle 's培养基(DMEM, GibcoTM)，添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%抗菌素，同时将NRK-52E以相同浓度悬浮在CS-C完全培养基中(Cell Systems Corporation)。
然后是20 × 106人工将悬浮于2ml培养基中的RAE细胞注入肾动脉。为了防止支架内压力突然升高，细胞以0.4 ml/min或更低的速度输注。为了增强支架内的细胞分散，我们使用定制的设备施加了一个transrenal pressure gradient (TPG)，该设备可以降低空气压力，并将内部压力调整为-100 mmHg，持续60分钟(图1)。我们将该设备设置为-100 mmHg，因为我们的初步研究表明，更大的TPG可能会对支架造成损伤。动脉插管的远端放置在装置外的PBS中，以允许液体自由流动，而输尿管插管则留在装置内。
对于逆行播种，我们手动注入1 × 106RET细胞悬浮在0.1 ml培养基中进入输尿管1分钟以上。在早期实验中，我们注入了较大体积的细胞悬液，但这导致了肾盆壁的过度扩张和破裂，导致支架细胞渗漏。因此，我们将体积减小到0.1 ml。在人工输尿管输注细胞后，我们以类似的方式应用TPG进行顺行播种。将种子支架放置在装置内，压力设置为- 20mmhg 60分钟(图1)，输尿管插管远端置于装置外的PBS中，动脉插管留在装置内。
图1。能够抽气以创造负压环境的装置示意图。通过操纵外部杠杆控制进气量，可精确调节腔体内部压力。
为了评估TPG对细胞播种的影响，我们比较了仅人工注射重新填充支架和人工注射+ TPG重新填充支架之间的细胞数。在细胞播种后，立即对重新填充的支架进行HE染色和细胞计数。然后在x 200倍放大的肾门横切面重建图像中计数移植细胞。顺行播种后计数移植RAE细胞，逆行播种后计数NRK-52E细胞。在顺行播种后，我们还计算了总肾小球数和移植的至少包含一个细胞的肾小球数(细胞阳性肾小球)，然后我们计算了细胞阳性肾小球的百分比。
为了检测灌注细胞能否在肾支架中存活和增殖，我们进行了灌注培养实验。用TPG播种RAE细胞后，将重新填充的支架浸泡在培养基中3-5小时，使细胞附着。然后将每个支架安装在生物反应器中进行连续灌注培养通过肾动脉。我们建立了一个简单的生物反应器，包括一个培养液库，一个PeristaTM泵和连接管。这用于以1毫升/分钟的速度再循环100毫升补充的DMEM 72小时，之后评估灌注培养支架的组织学。我们在48小时内更换培养基，并将系统置于培养箱中保持恒定的培养条件。72小时灌注培养结束时，我们对KI-67进行HE染色和免疫荧光支架处理(ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA)。
为了分析器官功能，我们测量了再内皮支架肾动脉灌注时的动脉压，假设内皮细胞可能改变支架[14]内的流动动力学。我们用改良的Krebs-Henseleit (KH)溶液[9]代血，送入肾动脉(共100ml，时间约60min)，记录动脉压，计算血管阻力[动脉压(mmHg)/流速(ml/min)]。我们还记录了被动排液量通过输尿管。
在持续动脉灌注SDS时，离体肾逐渐变白，48小时后透明(图2A)。通过将染料注入肾动脉，我们发现支架保留了先天的树形血管。输尿管输注染料也证实了肾盂间隙的结构性保留(图2B)。当脱细胞支架用HE染色时，我们发现细胞物质和细胞核被完全去除，而纤维结构仍然存在(图2C)。DAPI染色在脱细胞支架中未检测到细胞核。免疫荧光显示IV型胶原蛋白和层粘连蛋白在支架中保存良好(图2D)。扫描电镜显示网状结构，其中肾小球和管状区室清晰可见(图2E)。因此，我们发现脱细胞支架中细胞成分被充分去除，固有结构被很好地保存，这被认为是成功播种细胞的先决条件。
图2。脱细胞支架的评价。A:连续灌注SDS 48小时后脱细胞大鼠肾脏外观。肾脏变得近乎透明，同时保留其大体外观。
B:左为肾动脉，右为输尿管。在脱细胞支架中，树状血管网(左)和盆腔间隙(右)清晰可见，没有大量的染料泄漏，表明细胞外基质固有结构的保存
C:脱细胞大鼠肾脏代表性HE染色;细胞和细胞核缺失，肾小球和管状基底膜结构保存完好。比例尺，100 μm
D:层粘连蛋白(左)和IV型胶原(右)免疫组化;肾基底膜的主要成分层粘连蛋白和IV型胶原在肾小球和肾小管腔室中显示。比例尺，100 μm。E:扫描电镜超微结构分析;一个完整的删除单元内容和一个组织良好的三维架构显示。可见管状腔(左)和肾小球毛细血管腔(右)。
在细胞顺行播种过程中，我们手动注入2ml细胞悬液(20 × 106RAE细胞)进入肾动脉，支架外观无任何改变。90%以上的注入细胞留在支架内。当使用TPG时，大约有100毫升PBS通过动脉插管流入。人工注射后重新填充的支架HE染色仅显示灌注细胞适度扩散至外周血管和肾小球(图3A)。同时，人工注射+ TPG复活支架后，每个肺门截面细胞计数增加，但变化无统计学意义(图3A)。应用TPG时，细胞阳性肾小球从72%显著增加到85%(图3B)，表明TPG促进了支架内细胞的顺行分散。
图3。顺行(A, B)和逆行(C)再细胞化后细胞数的变化。A:加和不加TPG的RAE细胞数(-100 mmHg 60分钟)。在肾门横切面图像中，与对照组(仅手工注射，n=5)相比，分散的内皮细胞(手动注射+ TPG, n=5)数量更多，但未达到统计学意义(p=0.2, Student 's t检验)。
B:伴有和不伴有TPG的肾小球细胞阳性(- 100mmhg, 60min)。细胞阳性肾小球(手动注射+ TPG, n=5)明显高于对照组(仅手动注射，n=5)。(p < 0.05)。
C: NRK-52E加和不加TPG (-20 mmHg 60分钟)的数量。分散管状上皮细胞(手动注射+ TPG, n=5)较对照组(仅手动注射，n=5)显著增加(p<0.05)。
通过逆行播种，我们注入了0.2021版权OAT。版权所有6NRK-52E)进入输尿管，支架无明显损伤。组织学检查显示盆腔壁完好无损。手动输注后NRK-52E不能有效地分散到肾实质(图3C)。细胞只是偶尔到达肾小管间隙，而从未到达肾小球间隙。我们在肾盆壁上发现了多层活细胞，提示盆壁是细胞分散的障碍。当我们使用TPG和逆行播种细胞时，没有PBS的流入，这是逆行播种观察到的现象。我们发现每个肝门截面的移植细胞数量显著增加(图3C)，尽管总细胞数量仍远低于顺行播种后。这些结果表明，TPG也促进逆行细胞播种，但在更有限的程度上。
重新填充的肾脏支架以1 ml/min的速率灌注培养72小时，没有明显的压力升高，可能损害支架。组织学检查显示，血管和肾小球中内皮细胞被保留并存活(图4A)。我们还发现血管内内皮细胞增殖，KI-67染色阳性，部分内皮细胞存在于肾小球以外的管周毛细血管(图4B)。
图4。灌注培养支架的组织学评估。
A: HE染色可见广泛分布的再内皮化肾小球及邻近血管。比例尺，100 μm。B:在密集再填充的肾小球中，可见KI-67阳性细胞(箭头所示)。部分内皮细胞分散于肾单位外的管周间隙。比例尺，100 μm。
当KH溶液以恒定的速率灌注到经过72小时灌注培养的支架的肾动脉时，动脉压稳定在150 mmHg左右。当未灌注的支架以相同的速率灌注时，压力大约是灌注支架的一半，这表明灌注培养支架的流动阻力明显更高(图5A)。结果表明，移植的内皮细胞改变了对灌注液的抵抗力。在使用100ml KH溶液灌注时，灌注培养的支架在输尿管中产生少量的流出物，而非种子支架产生的流出物量更大(图5B)。移植细胞似乎阻止了支架内的自由过滤，导致输尿管内流出物的体积减少。
图5。灌注培养支架的功能评估。答:
动脉输送KH溶液时，与无细胞、无种子的支架(n=4)相比，再内皮支架(n=5)的血管阻力[动脉压(mmHg)/流速(ml/min)]显著增加(p<0.01, Student 's t检验)。B:动脉输送KH溶液时，与无细胞、无种子支架(n=4)相比，再内皮支架(n=5)输尿管流出物显著减少(p<0.05)。
脱细胞肾ECM支架的再生通常采用两种方法，即血管网络的顺行播种通过肾动脉和肾实质逆行播种通过输尿管，但各路径的最佳播种方法尚未建立[15]。
罗斯等．[10]手动注射细胞悬液通过肾动脉和输尿管，并报告大量的细胞分布在脉管系统，但没有在肾实质。他们推测，肾乳头作为一个屏障，以均匀和有效的细胞分散。首歌等．[9]率先报道了TPG促进细胞在管状间隙和血管网络中的分散。他们同时用TPG重新填充脉管系统和实质。
为了进一步探讨TPG对再细胞化的影响，我们对两种再生途径分别施用不同水平的TPG进行实验，并量化了移植细胞的数量。我们以实证的方式确定了TPG的应用强度。当血管路径的TPG为- 200mmhg或以上时，支架容易受损，而输尿管路径的TPG为- 50mmhg或以上时，则会造成气压性创伤。因此，在本研究中，我们将血管路和输尿管路的TPG分别设置为-100和-20 mmHg。
我们证明了TPG促进细胞在血管网络中的分散。虽然手动注射提供了相当数量的内皮细胞，但在使用TPG后，我们计数了更多的细胞，我们观察到细胞阳性的肾小球显著增加。我们推测，TPG将细胞运送到更多的外周区域，导致细胞阳性肾小球的增加。我们还发现TPG对逆行细胞分散有影响，但播种效率似乎仍不足以发展实质功能。TPG的合适强度似乎在不同的路线之间是不同的，应该针对特定的路线来确定。即使应用了特异的TPG，实质再细胞化似乎也是极具挑战性的。
为了解决与实质再细胞化相关的挑战，Caralt等．[16]尝试了一种不同的方法。他们以25ml /min (232 mmHg)的速度将小管细胞顺行注入肾动脉，观察到细胞从脉管系统到实质的有效移位以及小管结构的形成。我们的发现与他们的相矛盾，因为我们发现高压很可能导致气压损伤和细胞从支架上渗漏。为了解释这种差异，我们应该考虑到研究中脱细胞和再细胞化方案的差异，包括脱细胞剂和灌注时间的差异，使用的细胞播种方法和细胞类型的差异，以及可能影响结果的生物反应器参数[17]。我们认为，这些差异不可避免地限制了各研究之间再细胞化效率的比较。
在我们对灌注培养支架的功能分析中，我们发现内皮细胞植入后血管阻力增加。这一结果验证了劳伦斯的模拟研究et al。[14]，这表明由于再细胞化引起的细胞增加可能与支架孔隙度降低和压力增加有关。我们证明了再内皮化增加了动脉阻力并减少了输尿管内的流出量，这表明这些参数可以用于评估再细胞化效率。作为更具体的肾功能指标，宋等．[9]分析尿流出物，测定再细胞化支架的溶质清除能力。然而，我们对流出物的分析并不一致，表明支架之间的差异很大。在这里，使用的细胞类型(他们使用高度增殖的细胞)和其他参数的变化也可能导致报告结果的差异。
总之，我们的基于TPG的播种方法(丸注+ TPG应用)是安全有效的，因为它实现了稳定的支架内压力，不太可能出现意外升高。此外，它不需要复杂而昂贵的生物反应器和持续的压力和流量监测。我们还需要进一步的研究来实现更高的再细胞化效率，我们的播种方法可能有助于研究开发功能全面的可植入器官。
感谢圣玛丽安娜大学医学院超微结构形态学研究所C. Sasaki女士为我们准备的扫描电镜照片;以及圣玛丽安娜大学医学研究生院动物实验研究所的工作人员，感谢他们对实验鼠的照顾。
没有竞争利益需要申报
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年10月17日
录用日期:2015年10月27日
出版日期:2015年10月31日
©2015 Hachisuka S.这是一篇根据创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Hachisuka S, Sato Y, Yoshiike M, Nakazawa R, Sasaki H，等。(2015)负压作用下肾细胞外基质支架再细胞化增强。Integr Mol Med 2: DOI: 10.15761/ im .1000175。
圣玛丽安娜大学医学院泌尿系，日本川崎216-8511宫宫宫县2-16-1 Sugao，电话:+81-44-977-8111;传真:+ 81-44-977-0415。
图1。能够抽气以创造负压环境的装置示意图。通过操纵外部杠杆控制进气量，可精确调节腔体内部压力。
图2。脱细胞支架的评价。A:连续灌注SDS 48小时后脱细胞大鼠肾脏外观。肾脏变得近乎透明，同时保留其大体外观。
B:左为肾动脉，右为输尿管。在脱细胞支架中，树状血管网(左)和盆腔间隙(右)清晰可见，没有大量的染料泄漏，表明细胞外基质固有结构的保存
C:脱细胞大鼠肾脏代表性HE染色;细胞和细胞核缺失，肾小球和管状基底膜结构保存完好。比例尺，100 μm
D:层粘连蛋白(左)和IV型胶原(右)免疫组化;肾基底膜的主要成分层粘连蛋白和IV型胶原在肾小球和肾小管腔室中显示。比例尺，100 μm。E:扫描电镜超微结构分析;一个完整的删除单元内容和一个组织良好的三维架构显示。可见管状腔(左)和肾小球毛细血管腔(右)。
图3。顺行(A, B)和逆行(C)再细胞化后细胞数的变化。A:加和不加TPG的RAE细胞数(-100 mmHg 60分钟)。在肾门横切面图像中，与对照组(仅手工注射，n=5)相比，分散的内皮细胞(手动注射+ TPG, n=5)数量更多，但未达到统计学意义(p=0.2, Student 's t检验)。
B:伴有和不伴有TPG的肾小球细胞阳性(- 100mmhg, 60min)。细胞阳性肾小球(手动注射+ TPG, n=5)明显高于对照组(仅手动注射，n=5)。(p < 0.05)。
C: NRK-52E加和不加TPG (-20 mmHg 60分钟)的数量。分散管状上皮细胞(手动注射+ TPG, n=5)较对照组(仅手动注射，n=5)显著增加(p<0.05)。
图4。灌注培养支架的组织学评估。
A: HE染色可见广泛分布的再内皮化肾小球及邻近血管。比例尺，100 μm。B:在密集再填充的肾小球中，可见KI-67阳性细胞(箭头所示)。部分内皮细胞分散于肾单位外的管周间隙。比例尺，100 μm。
图5。灌注培养支架的功能评估。答:
动脉输送KH溶液时，与无细胞、无种子的支架(n=4)相比，再内皮支架(n=5)的血管阻力[动脉压(mmHg)/流速(ml/min)]显著增加(p<0.01, Student 's t检验)。B:动脉输送KH溶液时，与无细胞、无种子支架(n=4)相比，再内皮支架(n=5)输尿管流出物显著减少(p<0.05)。
