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摘要

利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，建立了缺乏HLA I类表达的人造血源性iPS细胞克隆。考虑到“脱靶”效应的风险，我们将D10A nickase型突变体Cas9和野生型(WT) Cas9与针对β2-微球蛋白(β2m)基因位点的正义链和反义链设计的sgRNA结合使用。设计的一对sgRNA提供了高效的基因组编辑，这与sgRNA通过同源依赖性修复pCAG-EGxxFP报告质粒有效重建EGFP表达的观察结果一致。获得的缺乏HLA i类的iPS细胞显示完整的多能性，脱靶突变似乎非常罕见。这些HLA - i类缺陷的iPS细胞可能有助于研究某些先天免疫细胞和T细胞对宿主的免疫反应，为将来储备的iPS细胞的临床应用奠定基础。

关键字

β-2微球蛋白，CRISPR/Cas9, HLA I类，iPS细胞

介绍

诱导多能干细胞(iPS)[1]和利用聚集性调控间隔短回文重复(CRISPR)相关(Cas)系统的基因组编辑技术[2-5]是近几十年来生命科学领域最具划时代意义的进展。iPS细胞作为再生医学在基础疾病研究、药物评估和临床应用方面具有巨大的潜力。诱导分化为各种组织或细胞的患者源性iPS细胞，在移植到每个患者体内时，有望逃脱宿主的免疫反应。然而，个性化iPS细胞的建立和安全性考虑需要大量的时间和成本。因此，有人提出构建iPS细胞库[6]。

人类白细胞抗原(HLA)由位于6号染色体上的主要组织相容性复合体上的基因编码，是组织或细胞移植时宿主免疫系统的主要靶分子。其中HLA I类几乎在所有组织细胞类型上表达，由高度多态性的重链(包括HLA- a、HLA- b和HLA- c)和不变的轻链1组成。多态HLA I类抗原主要由宿主CD8+ T淋巴细胞识别，移植物受到它们的攻击，导致排斥反应。为了避免排斥反应，供体和宿主的HLA型必须相同，但由于HLA基因的高度多态性，并不一定能获得完全匹配的供体。

由于不变性轻链β2m对于HLA I类抗原的表面表达至关重要，因此β2m基因的破坏导致HLA I类表达几乎完全丧失[7]。因此，β2m缺失的iPS细胞及其分化的细胞可能会降低免疫原性，从而逃避宿主T细胞的攻击。在本研究中，我们利用最新强大的基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统建立了β2m-null的iPS克隆。考虑到“脱靶”效应的风险，其中Cas9核酸酶耐受某些错配导致不希望的突变，我们使用了nickase型突变Cas9、Cas9n(D10A)以及野生型(WT) Cas9[8,9]。已建立的新型β2m-null iPS细胞可能为检验缺乏HLA I类表达的iPS移植是否促进成功移植提供了有用的工具。

材料与方法

人类iPS细胞的生成

采用BD抽真空器(bd362760)从健康志愿者外周血中提取单个核细胞。收集的细胞在il -2(诺华)存在的情况下，用抗cd3 /CD28包被珠(Velitas DB11131)刺激。活化细胞通过逆转录病毒载体转染重编程因子(Oct4, Sox2, Klf4和c-myc)。Hiromitsu Nakauchi和Shin Kaneko(东京大学医学研究所，日本东京)。将感染细胞在含有10% FBS的RPMI 1640培养基中，经丝裂霉素C (MMC)处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上接种，该培养基逐渐被iPS培养基、80% DMEM F12 (Sigma D6421)、20% Knock Out血清(GIBCO 10828-028)、1%非必需氨基酸(GIBCO 11140)、1倍l -谷氨酸青霉素(Sigma G1146)和5ng/ml bFGF (Wako 060-04543)取代。已建立的iPS殖民地被捡起来并扩大。

细胞培养

将iPS细胞培养于mmc处理过的MEF上，在含有10 ug/ml Y27632 (Wako 251-00514)的iPS培养基中，每3或4天传代一次。HEK293细胞在含有10%牛血清和1倍l -谷氨酸青霉素链霉素(sigma G1146)的DMEM (Nissui 05918)中培养。

sgRNA和Cas9 mRNA的制备

通过优化后的CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu)筛选出2个靶向人β2m基因外显子1和2的引导rna。通过将tracrRNA序列连接到引导RNA序列的3 '端来设计sgRNAs。合成了含有T7启动子和sgrna的双链DNA片段。将含有或不含IRES-mCherry序列的Cas9 WT或Cas9n(D10A)克隆到含有CMV启动子/增强子、兔β -珠蛋白内含子和polyA信号序列的R522载体中。mCherry编码序列来源于克隆科技公司(632523)采购的pmCherry-N1载体。使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒(ambion AM1345)检测sgRNA和Cas9 mRNA在体外转录。然后用MEGA透明试剂盒(ambion AM1908)纯化。来检验是否sgRNA具有功能活性在体外将pcr扩增的β2m基因外显子1或2的基因组片段与合成的sgRNA和重组Cas9 (NEB M386)在37℃下孵育1小时，电泳确认消化片段。

sgrna和Cas9 mRNA的验证在活的有机体内

pCAG-EGxxFP、pCAG-EGxxFP- cetn1和pX330-Cetn1/1由Ikawa博士通过Addgene(质粒ID分别为#50716、#50717和#50718)提供。(10、11)通过PCR扩增出含有β2m外显子1 (547 bp)和外显子2 (535 bp) sgRNA靶点的基因组片段，并将其插入pCAG-EGxxFP EcoRI/SalI位点，用lipofectamin (Invitrogen 18324-012)与HEK293细胞共转染在体外转录sgRNAs和Cas9 WT-IRES-mCherry或Cas9n(D10A)-IRES-mCherry mRNA。转染48小时后，用流式细胞仪(BD LSRFoetessa)分析mcherry阳性细胞中通过同源依赖性修复重组的EGFP表达。

β2m-null iPS克隆的建立

在CRISPR/Cas9处理前，将MEF上培养的iPS细胞转入无料培养条件。简单地说，将iPS细胞的单细胞悬浮液重新悬浮在含有bFGF(10 ug/ml)和ROCK抑制剂(10 uM)的Reprocell RCHEM007培养基中，然后将其涂在涂好的geltrex (GIBCO A1413301)上。经过几天的无料培养后，使用精确酶(Thermo Fisher A1110501)收集细胞，将2.8 × 10[5]个细胞重新悬浮在10 ul Opti-MEM培养基(GIBCO 31985-070)中。然后在脉冲电压为1000 V，脉冲宽度为30 ms，脉冲数为1的条件下，用Neon转染系统(Thermo Fisher)将Cas9 mRNA和sgRNAs电穿孔细胞。电穿孔后，细胞在含iPS培养基的MEF上培养。培养后，收集的细胞用fitc标记的抗hla - abc(克隆G46-2-6, BD Pharmingen 555552)染色，阴性细胞用FACSAria (BD)分选。分选或未分选的细胞在含iPS培养基的MEF上培养，分离集落。从每个克隆的基因组DNA中扩增β2m基因外显子1区，使用遗传分析仪(Thermo Fisher 3500XL)采用Sanger法分析核苷酸序列。

脱靶效应检验

利用优化后的CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu)搜索候选脱靶位点。在164个候选脱靶位点中，以已建立的iPS零克隆(Cas9 wt介导的S1-3和Cas9n(D10A)介导的S3-7)基因组DNA为模板，通过PCR扩增出11个位于蛋白编码区(CDR)的位点，并利用遗传分析仪(Thermo Fisher 3500XL)采用Sanger法分析核苷酸序列。

畸胎瘤的形成

检验多能性在活的有机体内将5x10[5]的β2m -/- iPS细胞单悬液在5ul DMEM中移植至肾包膜与肾皮质之间。6周后，受体小鼠给予戊巴比妥过量(60 mg/kg, i.p)，并经左心室灌注0.01M温磷酸缓冲盐水(PBS)，再用4%多聚甲醛/0.1M磷酸缓冲液(4% PFA/PB)固定。然后取出肾脏，在4% pfa /PB中重新固定过夜，用0-25% /0.01M PBS系列分级蔗糖洗涤，用液氮预冷的异戊烷快速冷冻，然后在- 80°C保存至使用。取7µm切片进行组织学染色。移植的人细胞用抗人核抗原(HNA, 1:100, 4℃过夜)检测;克隆235-1,Cy3共轭，Millipore, Temecula, CA)。采用生物素偶合兔多克隆抗e - cadherin(1:50, 4°C过夜，eBioscience 13-3249克隆:DECMA-1, San Diego, CA)检测表皮细胞，兔多克隆抗gfap(1:10, 4°C过夜，LAB vision, RB-087-A, Fremont, CA)检测胶质细胞，兔多克隆抗骨骼肌肌动蛋白(1:10，室温下1 h, Abcam, ab15263, Cambridge, UK)检测骨骼肌细胞，证实细胞分化为内胚层、外胚层和中胚层。用Alexa fluor -488偶联的山羊抗兔和抗大鼠抗体(1:500)在室温下观察反应2小时;分子探针，尤金，OR)。细胞核用DAPI(4′，6-二氨基-2-苯基吲哚，VECTOR实验室H-1200)反染色。 All animal experiments were approved by the Tokai University School of Medicine Committee on Animal Care and Use (Kanagawa, Japan), and were performed in the Tokai University School of Medicine.

结果

带有Cas9 WT和Cas9n(D10A)突变体的sgrna的设计和验证

Cas9核酸酶，来源于酿脓链球菌在“PAM”基序(NGG)之前，sgRNA与约20个核苷酸的DNA杂交形成复合物，并在PAM位点上游3bp处发生双链断裂(DSB)。该系统被称为“CRISPR-Cas9系统”，在最近的许多报道中被广泛应用于哺乳动物受精卵和培养细胞系统中高效编辑所需的基因组位点[2-5]。然而，人们一直担心该系统会以某种频率影响不需要的基因组位点(脱靶效应)。另一方面，cas9d10a突变体Cas9n(D10A)在单链DNA上产生缺口，而不是DSB。Cas9n(D10A)利用几个碱基对中的两个为正义链和反义链设计的sgrna，切割每一条单链，从而形成具有一些内聚序列的DSB。有研究表明，与Cas9 WT相比，使用Cas9n(D10A)体系可以降低脱靶率[8,9]。

我们设计了β2m基因外显子1和2区域的两对引导RNA(图1)，然后合成了含有T7启动子序列的DNA，设计了上述引导RNA和与Cas9形成复合物的tracrRNA。利用这些DNA片段作为模板，“sgRNA”可以通过T7 RNA聚合酶在体外转录。我们最初证实，在外显子1或2处含有目标序列的DNA片段明显被酶切在体外转录sgRNA和重组Cas9在体外(数据未显示)。接下来，我们验证sgRNA在活的有机体内使用EGFP表达盒，该表达盒将在插入的靶序列上用DSB重组，并进行同源性依赖修复[10,11]。用含有β2微球蛋白基因外显子1或外显子2区域的EGFP表达盒和表达设计的sgRNA和Cas9-IRES-mCherry的DNA载体转染Hela细胞。如图2所示，转染外显子1的sgRNA时，12-23%的细胞表达mCherry，转染外显子2的sgRNA时，大量mCherry阳性细胞表达EGFP，而转染外显子1的sgRNA时则没有表达EGFP。Cas9 WT和D10A突变体表现出相似的结果。

图1所示。人b2微球蛋白外显子1和2位点的引导RNA序列。每个导RNA对分别间隔9和6 bp。引导RNA对的PAM序列(NGG)是外向的。

图2。使用EGxxFP系统验证sgrna。

外显子1/2的sgrna和Cas9 IRES mCherry的mrna分别为在体外转录。将合成的rna和pCAG EGxxFP b2m外显子1或pCAG EGxxFP b2m外显子2转染到HEK293细胞。48小时后，用流式细胞仪分析细胞。使用Flow Jo 7.6 (Tomy Digital Biology)分析数据。值是盒装区域的百分比。

β2微球蛋白基因修饰人iPS细胞的制备

我们从健康志愿者的外周血T细胞中建立了iPS细胞。其中克隆441制备单细胞悬液，利用Neon电穿孔系统转染Cas9 WT或Cas9n (D10A) mRNA以及外显子1或2的sgRNA对。电穿孔后，用常规iPS细胞培养基在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上培养细胞。几天后，收集细胞并进行流式细胞术分析。外显子1 sgRNA处理的iPS细胞显示HLA I类(HLA- abc)表达降低，而外显子2 sgRNA处理的细胞则没有(图3)，这表明通过外显子1 sgRNA加Cas9破坏β2m基因导致HLA I类表面表达缺失。在Cas9 WT和Cas9n (D10A)处理的iPS细胞中均观察到HLA I类表达降低。这一结果与EGFP表达实验一致，表明外显子1的sgRNA比外显子2的sgRNA更有效地进行基因组编辑，并且频率在Cas9 wt处理的细胞和Cas9n(D10A)处理的细胞之间没有差异(图2)。然后，在HLA i类阴性分数分选之前或之后分离克隆。所有来自外显子1处理细胞的克隆均为HLA i类阴性(图4，数据未显示)。接下来，我们确认了获得的克隆在β2m外显子1区域的基因组序列(表1)。所有测试的克隆在两条染色体上都含有突变等位基因，这表明当选择合适的sgRNA时，CRISPR/Cas9系统的基因组编辑效率很高。

图3。野生型和D10A缺口酶Cas9突变体有效生成HLA i类缺陷的iPS细胞。

用fitc标记的抗HLA-ABC抗体(克隆G46-2-6)对转染了sgRNAs和Cas9 WT或Cas9n(D10A)的iPS细胞进行染色。数据分析使用CellQuest Pro程序(BD Bioscience)。

图4。HLA i类缺陷iPS克隆。

克隆的CRISPR处理的iPS细胞用抗人HLA ABC抗体染色。典型结果显示，但所有其他克隆检测HLA - abc阴性。

表1。基因组编辑的iPS克隆b2m外显子1区核苷酸序列。下划线序列是sgrna的靶位点。“-”对应于缺失的核苷酸。小写字符是插入的核苷酸，而大写字符是与原始序列相同的核苷酸。红色字母与开始密码子和停止密码子对应。

基因组编辑的iPS克隆的质量评估。

为了证实基因组编辑过程不损害iPS细胞的多能性，我们将β2m无效iPS克隆(克隆S3-7)移植到胸腺裸鼠肾被膜下。3个月后，β2m缺失的iPS细胞形成畸胎瘤(图5)，其中三个胚胎层都发育成熟。检测到表达E-cadherin的上皮样细胞(内胚层)、表达gfap的神经细胞(外胚层)和表达肌细胞谱系细胞(中胚层)的骨骼肌肌动蛋白(SK-actin)，表明基因组编辑的iPS细胞保持了多能性。

图5。建立的HLA - i类缺陷iPS细胞保持多能性。

为了研究建立的HLA - i型缺陷iPS细胞是否保留多能性，我们将t - iPS细胞移植到裸鼠肾囊中。6周后处死小鼠。肿瘤仅在移植肾(左)发生，未治疗肾(右)未发生。组织切片采用抗E-Cadherin抗体(E-Cad)作为内胚层标记，抗GFAP抗体作为外胚层标记，抗骨骼肌肌动蛋白抗体(SK-actin)作为中胚层标记进行染色。所有切片均经抗人核抗体(HNA)染色，证实细胞来源于人。比例尺分别为20µm(左)、50µm(中)和20µm(右)。

接下来，我们检查了β2m无效的iPS细胞中是否出现了“脱靶”突变。计算选择了164个Ex1-1和Ex1-2 sgrna的候选脱靶位点。15个位点3个碱基不匹配，149个碱基不匹配。其中，位于蛋白编码区(CDR)内的脱靶位点有4个(3个错配)和7个(4个错配)(表2)。在克隆S1-2 (Cas9 wt介导)和S3-7 (Cas9n (D10A)介导)中检测了这11个候选脱靶位点的核苷酸序列。我们在两个克隆中都没有发现变化，这表明由Cas9 WT和D10A引起的脱靶突变非常罕见。