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摘要

目的:OM-X^®含有可食用的细菌发酵植物，在世界范围内用作膳食补充剂。该研究旨在确定OM-X的生物学效应^®。

方法: OM-X^®添加到培养的Wistar大鼠下胃肠道细胞中;胰高血糖素样肽-1(GLP-1)采用酶联免疫吸附法定量。用OM-X培养RAW264.7细胞^®或者OM-X^®加脂多糖(LPS);24 h后，测定一氧化氮(NO)和细胞因子的产生在体外。为在活的有机体内调查，1% OM-X^®用聚焦DNA芯片分析597个肝脏基因的表达。

结果:在OM-X培养的大鼠下胃肠道细胞中，GLP-1水平呈依赖性升高^®。同样,OM-X^®或者OM-X^®加LPS均增加RAW264.7细胞NO和细胞因子(IL-6和TNF-α)的产生活性。小鼠注射OM-X^®口服表现出不同的肝脏基因表达。特别是OM-X^®显著升高4个基因的表达，降低23种炎症和凋亡相关基因的表达。

结论:OM-X^®直接刺激胃肠道细胞和RAW264.7细胞，增强GLP-1、NO、IL-6和TNF-α的产生，可能调节血糖水平并刺激免疫反应。肝脏基因表达的调节表明，口服OM-X^®可能具有生物学作用，包括免疫调节和细胞保护作用。

关键字

膳食补充剂，GLP-1, NO，细胞因子，DNA芯片

介绍

OM-X^®是一种膳食补充剂，由大平一郎博士在日本使用原始的发酵方法开发。OM-X^®由多种蔬菜、水果、海藻和蘑菇制成，使用12株乳酸菌和双歧杆菌发酵。这些材料是从日本农场和丘陵地区严格挑选的自然环境中获得的。收集材料后，在BIOBANK Co.， Ltd， (Okayama, Japan)的专用洁净工厂中进行混合和室温发酵数年。OM-X^®严格按照国际标准化组织(ISO) 9001标准制造。营养,OM-X^®提供碳水化合物(低聚糖和膳食纤维)、脂肪(短链脂肪酸)、蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质[1]。OM-X^®已在许多国家使用，未见严重不良反应报告。此外，其安全性已通过动物试验(诱变性和急性毒性试验)和人体临床试验(一期)得到证实[2]。

先前报道的关于OM-X的研究^®揭示了多种功能，包括通过肠道上皮细胞的增殖改善漏肠综合征(LGS)的细菌感染模型小鼠，抗炎作用Citrobact呃rodentium-感染性肠炎小鼠[3]。人为干预研究表明，OM-X^®增加健康男性和女性受试者的骨密度，增加最大耗氧量(VO)₂运动员的Max)[4]。改善便秘/腹泻，缓解肺炎，对ⅰ型过敏模型小鼠有抗炎作用[1]，对强迫游泳模型小鼠有抗疲劳作用[5]。

然而，OM-X的作用机制尚不清楚^®还没有完全检查过。在本研究中，为了检验OM-X^®功能,在体外使用小鼠细胞(胃肠道细胞，RAW 264.7细胞)和在活的有机体内使用正常小鼠进行研究。口服OM-X的效果^®肝脏基因表达的功能，其中吸收了OM-X^®成分被代谢，被研究。

材料与方法

化学物质和试剂:OM-X^®(批号t101)购自BIOBANK Co, Ltd，(冈山，日本)。脂多糖(LPS)从Macrophi Inc.(四国，日本)获得。Dulbecco的改良鹰培养基和胎牛血清购自Gibco Co.， Ltd (New York, USA)。大鼠GLP-1细胞试剂盒购自ReproCELL Co.， Ltd (Kanagawa, Japan)。GLP-1活性酶联免疫吸附测定试剂盒购自Shibayagi Co.， Ltd (Gunma, Japan)。一个MILLIPLEX^®MAP小鼠细胞因子/趋化因子磁珠检测板购自Luminex Co.， Ltd (TX, USA)。RNAlater^®溶液购自赛默飞世尔科学公司(MA, USA)。RNeasy脂质组织迷你试剂盒购自Qiagen Co, Ltd (Venlo, Netherlands)。RNA 6000纳米试剂盒购自Agilent Technologies Inc. (CA, USA)。MessageAmp生物素增强扩增试剂盒购自Applied Biosystems Japan (Tokyo, Japan)。所有其他实验室化学品均由商业供应商提供最高纯度。

下胃肠道细胞GLP-1生成测定从Wistar大鼠中分离下消化道细胞，在5% CO中培养₂按照大鼠GLP-1细胞试剂盒说明书，在37°C下培养。12小时后，OM-X^®加入终浓度1 ~ 1000 μg/ml, n = 3)，再培养40min后收集上清，采用ELISA法定量培养上清中胰高血糖素样肽-1(活性)(GLP-1)。

RAW264.7细胞NO及细胞因子生成测定巨噬细胞(RAW264.7)细胞悬浮在1.6 × 10的培养基中⁶将细胞/ml以100µl/孔的浓度滴入96孔板的孔中，37℃CO培养₂孵化器。六小时后，OM-X^®溶液(终浓度，10 - 1000µg/ml;n = 2)或脂多糖(LPS)溶液(终浓度，8.0 ng/ml;在孔中加入N = 2)，在培养箱中继续培养。24 h后收集培养上清，加入100µl Griess试剂(7.5%磷酸水溶液含3%磺胺和0.15%萘乙二胺溶液按1:2比例混合)，孵育10 min，用酶标仪测定吸光度(主波长550 nm;次波长，750纳米)。同样，使用MILLIPLEX测定获得的上清液中的细胞因子^®(肿瘤坏死因子-α干扰素-γ,il - 1β,il - 4、il - 6、il - 12 (p40) IL-13, IL-17, MIP-1α)面板组件。

口服OM-X^®老鼠:OM-X^®在蒸馏水中溶解，得到浓度为1% (w/v)的溶液，6周龄雄性ICR小鼠随意给予7天(n = 5)。同时，对照小鼠只给予蒸馏水(n = 5)。最后，收集血浆和肝脏，提取肝脏总RNA用于聚焦DNA微阵列分析。检测所有患者血浆中谷草转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平。本研究(方案批准号:H27-010)符合北海道药科大学《实验动物护理和使用指导原则》(1998年出版，2001年和2007年修订)。

RNA提取:肝脏解剖后保存于RNAlater^®在−80°C下放置7天。提取肝脏总RNA (n = 2, OM-X)^®治疗组;n = 1，正常小鼠)，使用RNeasy脂质组织迷你试剂盒。根据制造商的说明，使用RNA 6000纳米试剂盒在2100生物分析仪上评估提取RNA的质量和数量。

DNA微阵列:从RNA制备cDNA，生物素标记的RNA按照制造商的说明使用MessageAmp生物素增强扩增试剂盒进行转录和扩增。将生物素化的扩增RNA (aRNA)用片段化试剂进行片段化，然后在94℃下孵育7.5 min。加入试剂盒停止液终止片段化反应。先天免疫芯片(183个基因)、抗衰老芯片(219个基因)和代谢芯片(195个基因)具有表面芯片探针，用于DNA微阵列。杂交信号采用多束激发技术(Genopal)的DNA微阵列读取器获取^®(日本东京横河电机株式会社)。

统计分析:GLP-1、NO、细胞因子产生和血液标志物结果以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示。这些检验通过单向方差分析和Tukey检验进行比较。对于DNA微阵列分析，通过信号强度比(SIR = log2[样本信号强度/对照信号强度])测量的2.0倍表达变化被解释为差异表达基因(DEGs)。

路径分析:将预测的靶基因与Database for Annotation进行比对。参考最新的京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG, http://www.genome.jp/kegg)对DEGs进行通路分析。该分析能够确定显著富集DEGs的生物学途径。

结果

下胃肠道细胞GLP-1生成测定在OM-X存在下培养的大鼠下胃肠道细胞中观察到GLP-1产生的显著增加^®1 - 1000µg/ml OM-X^®相对于未处理的细胞(图1)。

图1所示。OM-X处理大鼠下胃肠道细胞产生GLP-1。将OM-X加入到终浓度为1 - 1000(µg/ml)的培养液中，4小时后用ELISA检测上清中产生的活性GLP-1。**P < 0.01，与NT(未治疗组)比较。

RAW264.7细胞NO及细胞因子生成测定添加OM-X^®与对照相比，RAW264.7细胞产生了显著的NO (Medium;Med)在OM-X^®浓度分别为100和1000µg/ml。添加OM-X^®(1000µg/ml)加LPS也导致NO的产生显著高于仅LPS (Med + LPS)(图2A)。

对于细胞因子的产生，添加OM-X^®与添加LPS (Med + LPS)相比，(10-1,000µg/ml)加LPS可显著产生IL-6(图2B)。添加OM-X^®(100µg/ml)导致TNF-α的产生显著高于对照(Med)和OM-X的TNF-α水平^®(1000µg/ml)，所有LPS的添加量均大于检出限(10,000 pg/ml)(图2C)。

图2。(A): OM-X处理RAW264.7细胞24小时的NO产量。将OM-X添加到培养物中，最终浓度为10-1,000 μ g/ml或OM-X加LPS (8 ng/ml)。24h后用Griess试剂测定上清液中NO生成量(n = 2)。*P < 0.05，**P < 0.01，vs。Med(中)，†P < 0.05;vs。Med + LPS。(B): OM-X处理RAW264.7细胞24小时后IL-6的生成。将OM-X添加到培养物中，最终浓度为10-1000µg/ml或OM-X加LPS (8 ng/ml)。24小时后使用MILLIPLEX panel kit检测上清中产生的IL-6 (n = 2)。††P < 0.01，vs。Med (Medium) + LPS。(C): OM-X处理RAW264.7细胞24小时后TNF-α的生成。将OM-X添加到培养物中，最终浓度为10-1,000 μ g/ml或OM-X加LPS (8 ng/ml)。24小时后，使用MILLIPLEX面板(n = 2)检测上清液中产生的TNF-α。OM-X的TNF-α水平(1,000µg/ml)和所有LPS的添加量均超过检测限(10,000 pg/ml)。** p < 0.01;vs。地中海(媒介)。

血浆分析和肝脏基因表达的DNA微阵列分析各组AST、ALT均在正常水平(数据未显示)。

OM-X基因表达的DNA芯片分析^®597个基因中有4个基因上调，597个基因中有23个基因下调(图3)(表1)。

图3。口服OM-X小鼠肝脏基因表达变化分析。

聚焦DNA微阵列芯片鉴定的deg数(变化2.0倍)。

表1。使用聚焦DNA微阵列芯片确定OM-X处理小鼠中27个差异表达基因的列表。

基因符号	基因名字	信号强度比
Traf1	TNF受体相关因子1	10.2±1.8
Traf2	TNF受体相关因子2	9.4±2.1
Socs4	细胞因子信号传导抑制因子	1.5±0.1
Cyp3a11	细胞色素P450，家族3，亚家族a，多肽11	1.3±0.1
Il1a	白细胞介素1(小家鼠)	−1.7±0.7
Spp1	分泌磷蛋白1	−2.4±0.5
Casp8	半胱天冬酶8	−2.4±0.7
Il28a	干扰素2	−3.7±1.2
Ucp2	解偶联蛋白2	−6.8±1.6
Map3k5	丝裂原活化蛋白激酶激酶	−8.1±2.5
肿瘤坏死因子	肿瘤坏死因子	−8.2±1.2
Cxcl5	趋化因子(C-X-C motif)配体	−9.5±1.1
OmpA	外膜蛋白A	−9.7±2.3
Casp4	Caspase 4，凋亡相关半胱氨酸肽酶	−9.7±2.4
Nlrp3	NLR族，含pyrin结构域3	−9.8±2.3
Ccl2	血红素(C-C基序)配体	−9.9±2.3
Il28b	干扰素3	−10.1±0.6
Il1b	白细胞介素1	−10.4±1.7
Ifng	干扰素γ	−10.5±2.0
Zbp1	Z-DNA结合蛋白	−11.1±1.5
Icam1	细胞间粘附分子	−11.1±0.6
Bcl10	B细胞白血病/淋巴瘤	−11.3±0.6
Tnfsf10	肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员10	−11.4±1.5
Il12b	白介素12 b	−11.5±2.7
Il17ra	白细胞介素17受体A	−12.2±1.1
Casp9	半胱天冬酶9	−13.4±0.6
Bcl6	B细胞白血病/淋巴瘤	−15.1±0.6

数据为差异基因表达，定义为2.0倍变化，表示为信号强度比(SIR) > 1.0或< -1.0。

路径分析:表2列出了通过KEGG Mapper中的通路分析工具获得的与OM-X的DEGs相关的疾病和通路^®小鼠肝脏。

表2。通过KEGG软件分析路径搜索结果。经OM-X治疗的肝脏的deg被发现与炎症疾病和途径相关。

相关疾病或途径	相关基因数/DEGs
甲型流感	10/27
细胞因子-细胞因子受体相互作用	9/27
肺结核	8/27
TNF信号通路	8/27
单纯疱疹感染	8/27
类风湿性关节炎	7/27
细胞凋亡	7/27
nf - κ B信号通路	6/27
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)	6/27
AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用	5/27
炎症性肠病(IBD)	5/27

结果是KEGG的计算机预测。

http://www.genome.jp/kegg-bin/color_pathway_object

版权所有OAT。版权所有

讨论

检查OM-X^®功能性方面，考虑了以下几点。首先，口服摄入的食物成分一般在肠道内消化，部分成分在肝脏被吸收代谢，进入血液循环。因此,OM-X^®可能经历类似的消化和吸收。此外，在对外界物质的免疫应答中，首先刺激的是包括巨噬细胞和树突状细胞在内的先天免疫系统;然后，免疫信号被传递给t淋巴细胞和其他细胞，触发二次免疫反应[6,7]。因此，口服OM-X的效果^®对胃肠道、肝功能、先天免疫进行探索性评价。

最初，OM-X的影响^®对大鼠下消化道细胞GLP-1产率的影响。GLP-1是在进食时对营养刺激的反应中产生的，并通过刺激胰腺中的β细胞促进胰岛素分泌来控制血糖[8]。研究结果表明，OM-X^®以浓度依赖的方式增加GLP-1的产生。因为GLP-1的产生是由营养物质诱导的，包括葡萄糖和脂质，OM-X^®这种作用可能是由OM-X中的碳水化合物和脂质介导的^®[9]。

巨噬细胞(RAW264.7细胞)负责先天免疫。巨噬细胞在感染和肿瘤发生的早期阶段识别和消除异物对预防疾病至关重要。toll样受体(TLRs) 2、4和6通过病原体相关分子模式(PAMPs)参与巨噬细胞活化。例如，某些微生物来源的物质，包括β-葡聚糖和脂多糖，刺激这些受体，从而促进细胞因子的产生，如IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α[10,11]。

在本研究中，添加OM-X^®或者OM-X^®加上LPS增加NO、IL-6和TNF-α的产生。因此，有可能OM-X^®或者OM-X^®LPS直接激活巨噬细胞的tlr，这种现象是OM-X中多糖成分增强LPS刺激的启动作用^®。OM-X^®含有12株乳酸菌和双歧杆菌，其中嗜酸乳杆菌，l .短，l . bulgaricus，l .干酪乳杆菌，酵母，l . helveticus，l .杆菌，双歧杆菌谕令，b . longum，b .对象，乳酸链球菌,粪肠球菌TH10。特别是,E。粪OM-X的TH10^®是一种从东南亚传统发酵食品豆豉中分离出来的乳酸菌。因此，OM-X细菌的PAMPs^®刺激tlr，诱导多种细胞因子[12]。

最后，聚焦DNA微阵列(Genopal^®)被用来分析肝脏中表达的基因变化作为口服OM-X对肝脏的影响^®小鼠[13]。

OM-X对肝脏差异表达的基因信息^®使用KEGG Mapper中的通路分析工具对给药情况进行分析。因此，根据对除Traf1/2外的基因的强烈抑制，预测OM-X^®涉及传染病(甲型流感、肺结核、单纯疱疹炎症性疾病(类风湿关节炎、NAFLED、糖尿病并发症、IBD)和炎症相关通路(TNF信号、NF-kappa B)，并以抑制方式作用于这些炎症反应[14,15,16]。鉴于结果表明OM-X^®倾向于抑制凋亡途径，OM-X^®可以通过抑制肝细胞在各种感染和炎症反应中发生的细胞死亡来预期对肝细胞具有细胞保护作用[17,18]。

此外,OM-X^®口服给药小鼠可抑制炎症基因，包括肝脏中的TNF，同时对巨噬细胞有直接刺激作用，以增强其TNF-α的产生，这表明OM-X^®是一种具有免疫调节活性的生物反应调节剂[19,20,21,22]。

致谢

我们感谢Togawa直之先生(三菱人造丝生物装置研究小组)的协助。Co.， Ltd.， Tokyo, Japan)，在研究期间提供了DNA微阵列分析的技术信息。本研究由BIOBANK Co.， Ltd (Okayama, Japan)资助。

利益冲突:

没有一个

参考文献

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