广岛市立大学综合科学研究研究生院生命系统科学专业，日本昭原727-0023
广岛市立大学生命与环境科学学院，日本昭原727-0023
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广岛市立大学综合科学研究研究生院生命系统科学专业，日本昭原727-0023
广岛市立大学生命与环境科学学院，日本昭原727-0023
德岛文利大学香川药学院，日本三之769-2193
广岛市立大学生命与环境科学学院，日本昭原727-0023
DOI: 10.15761 / IMM.1000119
我们从菠菜叶水提物中分离出三种有效成分，通过评估ige介导的大鼠嗜碱性白血病RBL-2H3细胞脱颗粒的抑制活性，并测定了它们的化学结构。这些化合物被称为SO-1、SO-2和SO-3，经鉴定为具有相同基本结构的黄酮醇葡萄糖醛酸酯。其中，SO-1在0.5~10 αg/ml浓度下抑粒活性最强。通过β-葡萄糖醛酸酶的酶处理和层析分离制备的多糖完全表现出这种抑制作用。这些化合物在相同浓度范围内对RBL-2H3细胞几乎没有细胞毒性。为了揭示其抑制机制，我们研究了SO-1对细胞中抗原刺激脱颗粒信号转导的影响。SO-1及其糖基均可降低细胞内Ca的升高２＋同时有效抑制Syk和Lyn等酪氨酸激酶的激活，这些酪氨酸激酶位于细胞内信号转导的上游，随后是抗原刺激。此外，与传统抗过敏药物相比，SO-1及其糖基均能显著抑制ICR小鼠耳内的被动皮肤过敏反应(PCA)。在这个PCA反应中，糖多糖比SO-1表现出更强的抑制活性，表明SO-1也起作用在活的有机体内通过在胃肠道中水解成糖醛酸。综上所述，我们认为菠菜含有抗过敏的类黄酮葡萄糖醛酸，表明这种化合物及其原蔬菜可能有助于预防或改善人类的过敏体质。
脱粒，类黄酮葡萄糖醛酸，PCA反应，RBL-2H3细胞，菠菜
近年来，在世界范围内，特别是在发达国家和工业化国家，1型过敏患者的数量不断增加。这是需要解决的最重要的医疗保健问题之一。I型过敏表现为急性炎症反应的症状，如哮喘和鼻炎。1型过敏反应是由肥大细胞和嗜碱性细胞表面的多价过敏原特异性结合相应的IgE受体(Fc - 1 - 1)介导的[1,2]。然后，与细胞结合的抗原立即触发细胞内信号级联，最终导致细胞内颗粒释放出化学介质，如组胺、血清素、花生四烯酸代谢物、蛋白酶、肝素等，发生急性过敏症状。因此，肥大细胞在过敏反应中起着至关重要的作用[3,4]，这表明调节肥大细胞的这种超敏反应被认为对预防和/或改善人类过敏体质非常重要。
到目前为止，包括组胺阻滞剂和脱颗粒抑制剂在内的各种类型的药物已被开发并用于医学治疗。然而，据报道，这些化学合成的药物在其有效作用的同时也表现出一些副作用。为了预防或改善I型过敏的症状，人们一直致力于筛选有前途的自然资源，包括水果、草药和植物，它们在细胞系统中具有中等的脱颗粒抑制活性。然而，很少有报道说非常受欢迎的蔬菜对人体有这样的影响在体外和/或在活的有机体内分析系统。菠菜,菠菜oleracea林恩。藜是藜科的一种知名蔬菜，在世界范围内广泛种植。在之前有关菠菜成分的论文中，它含有多种化合物，如营养素、维生素、矿物质和多酚化合物。迄今为止，有报道称菠菜具有抗氧化、抗诱变和抗炎作用[5-11]。据报道，菠菜的抗氧化作用主要是由于其类黄酮化合物，如菠菜苷葡萄糖苷、展柳素葡萄糖苷和二醇类黄酮[5,7,10]。另一方面，从其他植物中分离的一些类黄酮化合物，包括槲皮素、山酚等，已被证明可以抑制大鼠嗜碱性白血病细胞释放组胺[2,12-18]。然而，目前尚不清楚菠菜是否具有抑制ige介导的细胞脱粒的成分在活的有机体内过敏反应。
在这项研究中，我们证明了菠菜叶水提物对ige介导的RBL-2H3细胞脱粒的抑制作用，并通过生物学评价试验分离了三种活性化合物。所有化合物都被鉴定为具有相同基本骨架的类黄酮葡萄糖醛酸酯，这是菠菜特有的。通过使用最活跃的化合物，我们研究了抑制细胞反应中脱颗粒的潜在机制。此外，我们还阐明了葡萄糖醛酸及其糖元对小鼠被动皮肤过敏反应(PCA)的抑制作用。
RBL-2H3细胞来自JCRB (Saitama, Japan)，并在细胞库推荐的培养条件下维持。Eagle最低必需培养基(MEM)，牛血清白蛋白(BSA)，小鼠抗二硝基酚(抗dnp)单克隆IgE, dnp偶联的人血清白蛋白(DNP-HSA)，钙离子载体A23187, oxatomide，阿拉伯胶，Evan 's蓝色染料和β-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.32, HP-2型)螺旋pomatia)购自Sigma (St. Louis, MO)。胎牛血清(FBS)从HyClone Laboratories (Utah, USA)获得。抗phospho- syk (Tyr525/526)兔单克隆抗体、抗phospho- lyn (Tyr507)兔多克隆抗体和辣根过氧化物酶偶联抗兔IgG(山羊)购自Cell Signaling Technology, MA, USA)。WST-1和1-甲氧基PMS为日本熊本DOJINDO实验室产品。
新鲜菠菜购自日本广岛Shobara市当地供应商。将菠菜叶(1.34千克)与2体积热蒸馏水在食品加工机中大力研磨，并在80℃下混合1小时°C在机械搅拌器中。然后，用双层纱布将菠菜混合物分离成水萃取物和残留物质。以类似的方式重复对残留物质的这一步骤。在原样品的连续稀释下，首先检测了获得的菠菜提取物对RBL-2H3细胞的ige介导的脱粒抑制活性。总水提物(6 L)经Diaion HP20柱层析(三菱化学，东京，日本)(45×3 cm)用蒸馏水和甲醇(关东化学，东京，日本)洗脱。甲醇馏分在真空中用旋转蒸发器在45℃下进行浓缩°C，并在Sephadex LH-20色谱柱(Amersham Biosciences) (30×2 cm)上进一步色谱，用蒸馏水和70%丙酮洗脱。用2柱体积蒸馏水洗脱，分离成3个不同可见颜色的馏分(Fr. W-1、W-2、W-3)，分别为黑色、红色、黄色。在这三个水馏分和丙酮馏分中，浓缩最有效馏分(Fr. W-3, 1.21 g)，用CHCl3-MeOH-H进行薄层色谱(TLC, Silica gel, Merck Ltd, Japan)2O(6:4:1)。黄色部分采用制备薄层色谱(pTLC)分离，硅胶，默克公司。日本)使用CHCl3.-MeOH-H20(6:4:1)，得到六个分数。采用高效液相色谱法(HPLC)分离活性最高的部分(fr4, 408 mg)，色谱柱为Mightysil RP-18 GP (250×10 mm, 5 αm, Kanto Chemical, Tokyo, Japan)，洗脱液为26% accn -0.02%三氟乙酸(TFA)，流速为2.0 ml/min。使用UV-VIS检测器(SPD-10A VP, Shimadzu, Japan)在260 nm处监测洗脱。有效组分(Fr.4-2、4-3、4-4)最后用22%AcCN-0.02%TFA高效液相色谱洗脱。用高效液相色谱法证实了分离化合物的纯度。Fr. 4-4产SO-1、Fr. 4-2产SO-2和Fr. 4-3产SO-3的最终产率分别为4.2、3.6和3.8 mg。
从菠菜中分离得到的三种化合物的化学结构通过1H-NMR (700MHz, C5D5N),13C- NMR (175MHz, CS5D5N)和2D-NMR (HMBC和ROESY)，以及先前论文中报道的描述从菠菜中分离的化合物的数据[5,7,10]。SO-1为淡黄色粉末，经鉴定为5,3 '，4 ' -三羟基-3-甲氧基-6,7-亚甲二氧黄酮-4 ' -葡萄糖醛酸。HR-ESI-MS为m/z 521.0941 [m +H]+(计算的。[521.0931]选C23H21O14)[5]。SO-2为淡黄色粉末，鉴定为腋窝素-4′-β-葡糖苷酸。HR-ESI-MS为m/z 523.1088 [m +H]+ (calcd)。523.1088 for C23H23O14)[10]。SO-3为淡黄色粉末，鉴定为jaceidin-4′-β-glucuronide。HR-ESI- MS为m/z 537.1234 [m +H]+ (calcd)。537.1244选C24H25O14)[7]。
将RBL-2H3细胞(JCRB)以细胞密度5×10的方式分配到96孔板中4使用Eagle的含有10% FBS的最低基本培养基。每孔加入50 ng/ml抗dnp IgE, 37℃孵育°在5% CO的加湿条件下，加热24小时2-95%空气用于细胞敏化。空白孔和对照孔分别加入相同体积的含有1% BSA的Tyrode HEPES缓冲液。细胞用Tyrode HEPES缓冲液洗涤2次，然后用80 α 1的Tyrode HEPES含不同浓度的样品在37℃下孵育°然后，每孔加入20 αl/孔的Tyrode HEPES缓冲液或含DNP-HSA的抗原溶液，终浓度为50 ng/ml, 37℃孵育°C作用1小时以刺激细胞。孵育后，收集每孔上清液，加入含有0.1% Triton X-100的100 αl裂解缓冲液裂解细胞。将上清和细胞裂解液以20 αl/孔的速度转移到96孔的分析板上，并与100 αl的底物溶液(4-硝基苯基- n -乙酰基-β- d -氨基葡萄糖在0.1 M柠檬酸缓冲液中，pH为4.5)在37℃孵育°加入100 αl 0.2 M硼酸盐缓冲液(pH 9.8)停止反应，使用酶标仪(550型，BIO-RAD)在415 nm处测量吸光度。所有测试样品溶解在二甲亚砜中，并用Tyrode HEPES缓冲液稀释至指定浓度(DMSO终浓度小于0.1%)。抑制β-己糖氨酸酶释放的百分比用下式计算。抑制率(%)计算为[1 - (S - B)/(C - B)]×100。式中，S、B、C分别表示只添加刺激剂的样品处理孔、空白孔和对照孔的吸光度。
细胞同样在96孔板中孵育，细胞密度为5×104细胞/在37°在5%的CO下，恒温24小时2-95%的空气。细胞用Tyrode HEPES缓冲液洗涤2次，然后用80 α 1的Tyrode HEPES含不同浓度的样品在37℃下孵育°然后加入20 αl/孔的钙离子载体A23187, 37℃孵育°C作用1小时以刺激细胞。下面的实验步骤与上述相同。
用β-葡萄糖醛酸酶(HP-2型)对SO-1进行酶处理螺旋pomatia。在0.1 M醋酸钠缓冲液(pH 5.2)-0.5 M氯化钠溶液中配制950 αl的SO-1溶液(10 mmol/l)和50 αl的β-葡萄糖醛酸酶溶液，37℃孵育°在水浴中加热3小时。在10000×g离心10分钟后，回收上清液，用高效液相色谱法纯化SO-1中的多糖。
细胞内钙２＋根据制造商的说明，用Calcium Kit Fura-2 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)监测其水平。将RBL-2H3细胞接种于96孔培养板，细胞密度为5×104抗dnp IgE (0.5 αg/10 αl/孔)处理°在5% CO的加湿条件下，加热24小时2-95%的空气。PBS(-)洗涤2次后，用100 αl Fura-2 AM孵育1 h。PBS洗涤2次后，按指定浓度37与样品孵育°然后，加入20 αl DNP-HSA (0.25 αg/ml)刺激细胞，并立即使用荧光微孔板读取器在340/380 nm激发和510 nm发射处测量荧光(Varioskan, Thermo Fisher Scientific, Yokohama, Japan)。
将RBL-2H3细胞接种于1.0×10的60 mm培养皿中6细胞/皿，用抗dnp IgE处理致敏，然后用样品处理，用DNP-HSA刺激，如上所述。刺激15分钟后，取出细胞，洗涤，最后用裂解缓冲液裂解。得到的细胞裂解物经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PACE)，然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脱脂牛奶中阻断1小时后，用一抗4孵育膜°使用增强型ECL试剂盒和化学发光检测器(EZ Capture, ATTO Corporation, Tokyo, Japan)检测免疫反应蛋白，室温下用辣根过氧化物酶偶联二抗孵育1小时。
将RBL-2H3细胞按细胞密度5×10分布于96孔板中4细胞/孔使用含有10%胎牛血清的MEM。将混合物在37℃下孵育3小时°C在5% CO2-95%的潮湿空气中粘附到细胞微孔板上。然后，将细胞与100 αl的样品在37℃下孵育°每孔加入20 αl/孔的WST-1溶液(5 mM WST-1-20 mM 1-甲氧基PMS)， 37℃孵育°在5% CO加湿条件下加热2小时2-95%的空气。每孔的吸光度在415 nm处用微孔板读取仪测量。根据获得的数据，计算细胞毒性百分比作为相对细胞活力。
5周龄，体重30-35 g的雄性ICR小鼠(CLEA Japan, Inc, Tokyo, Japan)，饲养于空调房间(23±2)°C) 12小时的明暗循环。给小鼠喂食商业颗粒和水随意。本研究经广岛市立大学动物使用委员会批准，动物饲养按广岛市立大学实验动物护理指南进行。
ige诱导的被动皮肤过敏反应(PCA)反应如下。每只小鼠右耳皮下注射抗dnp - ige抗体20 α 1 (5 αg/ml)，左耳皮下注射等量生理盐水。24 h后，将SO-1样品溶液或其多糖按指定剂量口服给药。将这些样品和作为阳性对照的恶唑胺均悬浮在阿拉伯胶溶液中，以0.1 ml/10 g体重的剂量给予小鼠。治疗2小时后，小鼠静脉注射含DNP-HSA (0.4 mg/ml)和1%埃文蓝(SIGMA-ALDRICH)的生理盐水。注射30 min后，脱臼处死小鼠，取耳。每只耳浸泡在500 αl的1N KOH溶液中，室温下溶解过夜。用丙酮-0.2 M磷酸溶液(13:5)提取外出的埃文蓝染料，在700×g离心20分钟，用分光光度计(V-530, Jasco)在620 nm处测定染料的量。根据所得数据，计算样品对PCA反应的抑制作用百分比。
为了评估脱粒数据，采用Bartlett’s分析确定数据方差的一致性，然后采用双向方差分析和Tukey’s检验来确定差异的统计学显著性。为了评估PCA反应数据，两组间的差异采用双尾Student 's t检验进行统计学评价。
通过顺序稀释的样品，菠菜叶水提物对RBL-2H3细胞中ige介导的脱粒有明显的抑制作用(图1)。通过Diaion HP20和Sephadex LH-20柱层析、制备薄层析和重复高效液相色谱对提取物进行分离。在细胞脱粒抑制活性测定的基础上，分离得到三种具有相似色谱行为的淡黄色化合物。隔离流程图如图2所示。根据对SO-1的NMR和MS分析数据，确定其化学结构为5,3 '，4 ' -三羟基-3-甲氧基-6,7-亚甲二氧黄酮-4 ' -葡糖苷(图3)，与Bergman报道的6-(3,4-二羟基苯基)-9-羟基-7-甲氧基-[1,3]二氧基[4,5-g]铬-8- 1 -4 ' -β-葡糖苷相同et al。[5]。在那篇论文中，这种化合物被报道具有抗氧化活性，被认为是菠菜特有的成分。同样，SO-2和SO-3的NMR和MS数据也分别与文献中axillarin-4′-β-glucuronide和jaceidin-4′-β-glucuronide的值一致[7,10](图3)。因此，这三种化合物在化学结构上具有非常相似的特征，如黄酮醇的基本骨架相同，β-构型中C′4处存在葡萄糖醛酸。
图1所示。菠菜水提取物对RBL-2H3细胞抗原刺激脱颗粒的抑制作用。
图2。菠菜中活性化合物的分离流程图。
所以1
所以2
所以3
图3。菠菜中SO-1、SO-2和SO-3的化学结构
从菠菜中分离的三种黄酮醇葡糖苷类化合物中，有一种名为SO-1的化合物对RBL-2H3细胞中ige介导的脱粒有显著的抑制作用，而另外两种名为SO-2和SO-3的化合物在相同的检测系统中表现出较弱的抑制作用(图4)。SO-1即使在0.5 αg/ml及其IC浓度下也能抑制ige介导的脱粒50值为0.97 αg/ml (1.85 αM)。该活性明显高于富马酸酮替芬，富马酸酮替芬是一种真正的抗过敏药物，具有其IC50值为114 αM(图4)。由于这些化合物具有与上述相似的化学结构，因此评估它们之间的构效关系是有意义的。我们发现，在类黄酮a环的C6和C7上存在一个亚甲基二氧基连锁被认为是脱粒抑制活性所必需的。然而，这三种化合物对钙离子载体a23187诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒没有抑制作用(数据未显示)。
(一)
(B)
图4。SO-1、SO-2和SO-3对RBL-2H3细胞抗原刺激脱粒的抑制作用。RBL-2H3细胞分别用菠菜(A)或指定浓度富马酸酮替芬盐(B)中的每种化合物处理，并用DNP-HSA刺激。酶促法测定-己糖氨酸酶的释放量。数值以平均值±标准差表示三个独立分析的结果。
为了进一步阐明SO-1分子的功能片段，我们利用β-葡萄糖醛酸酶对SO-1进行酶解制备了SO-1的糖元(螺旋pomatia),然后进行色谱分离。通过HPLC洗脱谱图和与SO-1的紫外光谱吻合(数据未显示)证实了其纯度。在此处理中，从18.6 mg SO-1中回收了11.9 mg的糖酰形式。我们比较了SO-1及其糖元对RBL-2H3细胞β-己糖氨酸酶释放的抑制作用。多糖和SO-1在相同浓度范围内强烈抑制ige介导的脱颗粒(图5)。它比SO-1在IC中的活性更强50值为0.51 αg/ml (1.47 αM)，表明SO-1的脱粒抑制活性是由其黄酮醇部分构成的葡糖苷形式引起的。然而，在细胞实验中，SO-1的多糖对钙离子载体a23187刺激的β-己糖氨酸酶释放也没有抑制活性。
图5。SO-1及其糖基对RBL-2H3细胞抗原刺激脱颗粒的抑制作用。RBL-2H3细胞分别用指定浓度的化合物处理，并用DNP-HSA刺激。酶促法测定-己糖氨酸酶的释放量。数值以平均值±标准差表示三个独立分析的结果。
为了揭示SO-1及其糖基对RBL-2H3细胞中ige介导的脱颗粒抑制作用的机制，我们检测了细胞内Ca的升高２＋细胞内抗原刺激诱导的信号蛋白激酶的浓度和磷酸化。如图6所示，抗原刺激立即增加Ca的释放２＋离子从内质网进入细胞质，细胞内钙离子升高２＋SO-1及其glycon以剂量依赖的方式有效抑制其水平。因此，这两种化合物被证明具有抑制脱颗粒信号传导的晚期事件的能力。此外，我们进一步研究了脱颗粒的早期事件，如Lyn和Syk分子的磷酸化，它们位于抗原-抗体偶联的Fc -农地- RI复合物的下游。如图7所示，SO-1及其glycon均以剂量依赖性方式显著抑制Syk的磷酸化，而在相同浓度下，它们对Lyn的磷酸化表现出较弱的抑制作用。这些结果表明，SO-1及其glycon的脱颗粒抑制作用主要是由于抗原刺激后Syk的活性得到有效抑制。版权所有OAT。版权所有
图6。SO-1及其糖原对抗原刺激下RBL-2H3细胞内Ca2+水平升高的影响。将ige致敏的RBL-2H3细胞按指定浓度加或不加样品处理30分钟。抗原刺激20秒后，测量细胞内Ca2+水平。给出了三个独立实验的代表性结果。
(A)
(B)
图7。SO-1及其糖元对RBL-2H3细胞抗原刺激的Lyn和Syk激酶磷酸化的影响。在指定的浓度下，用或不用样品处理ige致敏的RBL-2H3细胞。抗原刺激15分钟后，细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blot分析。计算磷酸化Lyn 1和2 (p-Lyn 1和p-Lyn 2) (A)和Syk (p-Syk) (B)与对照的相对密度比。在每种情况下，给出了两个独立实验的代表性结果。
我们评估了SO-1及其糖元对ICR小鼠PCA反应的影响，并与抗过敏药物oxatomide作为阳性对照。本实验采用胃插管给药的方法，将阿拉伯胶溶液中悬浮液中的所有化合物给药。抗原刺激2小时后，提取各组耳外渗埃氏蓝染料，分光光度法测定其含量。如图8所示，SO-1及其糖基均能显著抑制抗原刺激引起的染料外溢。52 mg/kg (100 αmol/kg)剂量的SO-1对PCA反应的抑制作用强于43 mg/kg (100 αmol/kg)剂量的oxatomide。相比之下，8.5 mg/kg (25 αmol/kg)较低剂量的糖多糖完全抑制抗原刺激引起的染料外渗，表明糖多糖比SO-1和oxatomide更有效地抑制PCA反应。
图8。SO-1及其糖元对小鼠PCA反应的影响。A、给小鼠注射SO-1糖糖(50、100mol/kg)或Oxatomide(100mol/kg)。B，给小鼠注射50、100mol/kg的SO-1。每个值代表4-5只小鼠的平均值±SEM。*p<0.05或#p<0.05与对照组或oxatomide组比较。
在相同浓度范围内，测定了菠菜黄酮醇葡糖苷(SO-1、SO-2和SO-3)和SO-1糖多糖对RBL-2H3细胞的细胞毒性。在1~10 αg/ml浓度下，SO-1及其糖基无细胞毒性，而SO-2和SO-3的细胞毒性较弱。
近年来，人们一直致力于寻找食物及其成分来抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞的细胞反应，从而预防或改善过敏症状。此外，有必要有一系列的证据来支持这两个观点在体外和在活的有机体内这些有前途的材料的有效性。几种黄酮类化合物，包括槲皮素、木犀草素、山奈酚和杨梅素，已知可抑制人嗜碱性粒细胞和大鼠嗜碱性白血病细胞释放组胺[12,14]。也有报道称，一些类黄酮苷或葡萄糖醛酸苷对ige介导的脱粒有抑制作用[1,2,14-17]。在这项研究中，我们基于抑制RBL-2H3细胞中ige介导的脱粒，从菠菜的水提取物中分离出3种成分。这三种化合物均为黄酮醇葡萄糖醛酸酯，化学结构非常相似，其中一种化合物(SO-1)在极低浓度(1 αg/ml)下表现出显著的活性，其活性高于槲皮素和木犀草素。由SO-1酶解得到的糖多糖也比SO-1具有更强的活性，说明SO-1的活性部分是黄酮醇，而不是葡萄糖酸盐。由此可见，SO-1及其glycon对RBL-2H3细胞中ige介导的脱粒、槲皮素和木犀草素的抑制机制相同。事实上，SO-1及其glycon被证明可以抑制细胞内Ca的升高２＋酪氨酸激酶(Syk)的激活。然而，研究发现SO-1及其多糖的活性完全是由于C-6和C-7位置存在亚甲二氧基，其活性明显高于槲皮素和木草素，这表明菠菜是有希望改善抗过敏体质的蔬菜之一。
与其他富含类黄酮的蔬菜如西兰花和红洋葱相比，菠菜具有显著的类黄酮含量。关于菠菜中分离的黄酮类化合物的生物学效应，如抗氧化和抗诱变活性的报道很少[5-7]。最近，石田et al。[19]报道了菠菜水提物对RBL-2H3细胞脱粒的抑制作用。在这篇论文中，他们指出活性化合物是热稳定和抗胰蛋白酶的化合物，分子量为0.5~14 kDa，假设它们可能是多肽或水溶性多糖，而不是植物化学物质。有趣的是，他们的菠菜提取物抑制细胞内钙的升高２＋抗原刺激引起的Syk激酶磷酸化。因此，尽管在不同的实验室中也观察到菠菜水提取物对ige介导的RBL-2H3细胞脱粒的抑制作用，但我们可以在本研究中确定一种有效成分黄酮醇葡萄糖醛酸盐。该化合物被发现能剂量依赖性地抑制细胞内钙的升高２＋抗原刺激诱导的Syk激酶磷酸化。此外，用SO-1制备的糖元完全证实了这些作用，表明SO-1是菠菜水提液中的有效活性成分。
虽然在0.5~10 αg/ml浓度下，SO-1及其苷元能有效抑制ige介导的脱粒，但在相同浓度下，这两种化合物对钙离子载体a23187诱导的脱粒无抑制作用。这些结果表明，剂量依赖性抑制细胞内钙２＋这是由于信号通路上游组分如Syk激酶的失活，而不是抑制细胞外钙的内流２＋离子。可见，SO-1及其glycon对抗原刺激下的Syk激酶活化具有有效抑制作用，而对Lyn激酶的抑制作用较弱。Syk是ige介导的脱粒过程中最重要的信号分子之一[20-22]，许多天然物质的脱粒抑制活性都是通过Syk的失活介导的。然而，很难推测这些化合物可以直接调节细胞内酪氨酸激酶，因为SO-1被认为由于其糖苷形式很难跨细胞膜运输。此外，许多文献表明，黄酮类化合物可能不是生理上并入细胞。因此，我们可以推测，类黄酮化合物如SO-1及其糖元、槲皮素、木犀草素等可能与RBL-2H3细胞表面抗原-抗体偶联的Fc - 16ri复合物相互作用。例如，在黄酮类化合物的存在下，细胞表面可能发生抗原与IgE结合的紊乱、受体复合物的聚集形成和构象变化。本研究明显证明抗原刺激诱导的Syk激酶磷酸化被SO-1及其glycon有效抑制。综上所述，SO-1及其糖基可抑制Syk激酶失活引起的抗原刺激对RBL-2H3细胞的脱粒作用。然而，这些类黄酮导致Syk激酶失活的确切作用点还需要进一步的研究。
一些葡糖苷，如槲皮素3-O-葡糖苷和芹菜素7-O据报道，与它们的糖聚物[2]相比，-葡糖苷对ige介导的脱粒有较低的抑制作用。而从菠菜中分离得到的黄酮醇葡糖苷SO-1则表现出与其苷元相似的抑制活性。这些结果表明，类黄酮的A环和C环上的糖偶联明显降低了它们的潜在活性，而类黄酮如SO-1的B环上的糖偶联对活性没有影响。此外，SO-2和SO-3的活性低于SO-1及其糖基，表明A环上的亚甲基二氧基键对活性的增强至关重要。A环C5位置的羟基也被认为是活性所必需的，这与槲皮素、山奈酚、黄芩素和木犀草素的研究结果一致[14,17]。SO-1主要分布在菠菜中，因为这种化合物尚未从其他蔬菜中分离出来。
小鼠PCA反应是其中最重要的一种在活的有机体内评价抗过敏作用的模型。SO-1及其glycon在口服剂量下以及原药oxatomide均显著降低PCA反应。与SO-1相比，该多糖具有较强的抑制作用，说明该多糖是SO-1的活性成分。结果表明，黄酮类化合物的糖元比其苷元更容易被小肠膜吸收，并且被吸收的糖元被代谢在活的有机体内到它们的共轭形式，如葡萄糖醛酸盐、硫酸盐和汞酸盐[23,24]。因此，SO-1的糖基在吸收后可能再次代谢为葡萄糖醛酸盐形式，其在靶细胞(包括肥大细胞和嗜碱性细胞)周围仍具有强效的抑芽活性。
本文首次报道了从菠菜中分离的类黄酮葡糖苷(SO-1)的抗过敏作用，证明了这种化合物对改善人类过敏症状的有用性。需要进一步的研究来调查菠菜作为一种功能性蔬菜的有效性，以预防和/或改善I型过敏。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年1月10日
录用日期:2015年1月23日
发布日期:2015年1月27日
©2015 Morishita Y.这是一篇根据知识共享署名许可协议发布的开放获取文章，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是要注明原作者和来源。
Morishita Y, Saito E, Takemura E, Fujikawa R, Yamamoto R，等。(2015)菠菜中分离的类黄酮葡萄糖醛酸酯抑制小鼠嗜碱性白血病RBL-2H3细胞中ige介导的脱粒和被动皮肤过敏反应。integrated Mol Med 2: DOI: 10.15761/IMM.1000119
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图1所示。菠菜水提取物对RBL-2H3细胞抗原刺激脱颗粒的抑制作用。
图2。菠菜中活性化合物的分离流程图。
所以1
所以2
所以3
图3。菠菜中SO-1、SO-2和SO-3的化学结构
(一)
(B)
图4。SO-1、SO-2和SO-3对RBL-2H3细胞抗原刺激脱粒的抑制作用。RBL-2H3细胞分别用菠菜(A)或指定浓度富马酸酮替芬盐(B)中的每种化合物处理，并用DNP-HSA刺激。酶促法测定-己糖氨酸酶的释放量。数值以平均值±标准差表示三个独立分析的结果。
图5。SO-1及其糖基对RBL-2H3细胞抗原刺激脱颗粒的抑制作用。RBL-2H3细胞分别用指定浓度的化合物处理，并用DNP-HSA刺激。酶促法测定-己糖氨酸酶的释放量。数值以平均值±标准差表示三个独立分析的结果。
图6。SO-1及其糖原对抗原刺激下RBL-2H3细胞内Ca2+水平升高的影响。将ige致敏的RBL-2H3细胞按指定浓度加或不加样品处理30分钟。抗原刺激20秒后，测量细胞内Ca2+水平。给出了三个独立实验的代表性结果。
(A)
(B)
图7。SO-1及其糖元对RBL-2H3细胞抗原刺激的Lyn和Syk激酶磷酸化的影响。在指定的浓度下，用或不用样品处理ige致敏的RBL-2H3细胞。抗原刺激15分钟后，细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blot分析。计算磷酸化Lyn 1和2 (p-Lyn 1和p-Lyn 2) (A)和Syk (p-Syk) (B)与对照的相对密度比。在每种情况下，给出了两个独立实验的代表性结果。
图8。SO-1及其糖元对小鼠PCA反应的影响。A、给小鼠注射SO-1糖糖(50、100mol/kg)或Oxatomide(100mol/kg)。B，给小鼠注射50、100mol/kg的SO-1。每个值代表4-5只小鼠的平均值±SEM。*p<0.05或#p<0.05与对照组或oxatomide组比较。
