看看最近的文章

摘要

胚胎干细胞(ESCs)是基因工程和发展干细胞基础疗法的关键工具。研究ESCs的多能性和早期谱系承诺是其转译应用的必要前提。在本研究中，我们探索了小鼠ESC分化为内耳毛细胞谱系的能力。将小鼠胚胎干细胞(E14TG2A)培养于原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)上，经EGF和IGF-1连续诱导10 d，形成胚状体(EBs)，然后经bFGF处理8 d，诱导潜在的内耳毛细胞。实时荧光定量PCR和免疫荧光分析结果显示，内耳毛细胞特异性生物标志物Espin、肌球蛋白VIIa、Math1、α9 AchR蛋白在诱导谱系中存在并表达显著增加。我们的研究为mESCs在内耳毛细胞发育过程中表达关键基因提供了证据，从而提高了它们作为再生疗法候选者的地位。

关键字

小鼠胚胎干细胞，内耳毛细胞，体外

简介

听力损失是世界上最常见的残疾之一。大约12%到17%的美国成年人(大约4000万人)表现出不同程度的听力损失[1]。此外，在美国有大量儿童被诊断为传导性听力丧失，这是由于咽鼓管功能障碍或中耳和外耳畸形造成的，每1000名儿童中有2 - 3名患有不同程度的先天性感音神经性听力丧失[2]。听力障碍的普遍存在和缺乏恢复使得先天性SNHL的治疗成为耳科和听力学领域的主要挑战。

在大多数SNHL病例中，主要病理是位于耳蜗[2]感觉上皮内的机械感觉毛细胞的丢失。内耳的毛细胞对听力和平衡至关重要。这些毛发状的结构是立体纤毛，它们会对声音做出反应而弯曲。[3]有两种类型——听觉[3]和前庭[3]。听觉毛细胞位于内耳的耳蜗中，负责探测声音。毛发的运动被转化为电信号，这些电信号被传输到大脑，并被解释为声音。还有负责我们平衡感的毛细胞[3]。这些细胞位于内耳的不同部位——前庭器官——被称为前庭毛细胞。虽然使用助听器可以补偿受损的听觉毛细胞，但对受损的前庭毛细胞没有替代或治愈方法。毛细胞不能孤立地发挥作用，而是需要通过神经纤维与大脑的听觉中枢相连。 The challenge of hair cell replacement is not only to replace damaged hair cells. New research, however, is showing that there may be a way to regenerate damaged hair cells.

目前提出了内耳毛细胞再生的方法[4-6]。了解内耳感觉细胞的发育生物学应该为从干细胞/祖细胞生成毛细胞提供分子途径[4-6]。内耳感觉上皮内源性修复的基因疗法和药物传递系统将影响祖细胞的数量和它们的细胞命运。的在体外从胚胎干细胞(ES)中生成内耳毛细胞是一种有前途的生产适合于耳聋修复和基于细胞的听觉系统替代治疗的细胞的方法。

材料与方法

4.1动物实验方案

动物实验经张家港市第一人民医院动物护理委员会批准，按动物护理机构指导原则进行。

4.2小鼠原代胚胎成纤维细胞(PMEF)

将新鲜解剖的无病原ICR小鼠胚胎(第11-13天)切碎，然后用Pierce MEF分离酶(木瓜蛋白酶)(#88290)孵育25 - 30分钟，并用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次。为了自制胰蛋白酶分离(DIY胰蛋白酶)，小鼠胚胎组织与0.25%胰蛋白酶孵卵25 - 30分钟，洗两次HBSS。两种方法的其余步骤相同。在一次细胞分离的完全DMEM(#88287)中，用装有1000 μ L尖端的移液管上下移液15 ~ 20次，以生成单细胞悬浮液，从而破坏组织。使用Invitrogen™伯爵夫人™自动细胞计数器测定细胞总产量，用台泮蓝排除试验测定细胞活力。

4.3内耳毛细胞诱导

小鼠胚胎干细胞(E14TG2A)来自中国科学院上海生物科学研究院干细胞库细胞库。为了诱导mES细胞分化为内耳毛细胞，需要将mES细胞与PMEF分离，在悬浮环境中培养。明胶涂层烧瓶用于分离PMEF和mES细胞。当mES菌落准备好诱导内耳毛细胞时(定义为分化第0天)，在2个T150烧瓶上涂0.1%明胶(18毫升/瓶)，室温下30分钟，然后去除多余的明胶，用1倍PBS洗涤3次。小心地用吸入法去除培养基，确保不要移走松散附着的菌落。简单加入10毫升PBS，然后抽吸除去，完成清洗步骤。从PMEF中分离mES细胞，加入0.25%胰蛋白酶/EDTA (3 ml/dish, StemCell Technologies)， 37°C孵育3-5分钟，直到干细胞和PMEF从培养皿分离。加入不含LIF和移液细胞的新鲜ES培养基15 ml上下打碎菌落(约15-20次)。然后，加入0.1%的涂有明胶的T150烧瓶中，在37°C孵育30分钟。孵育后，PMEF应附着在涂胶的表面，而ES细胞应漂浮。 Collect the floating mES cells into a 50 ml tube. Spin down at 800 rpm and resuspend cells in 10 ml of fresh Differentiation Medium (20 ng/ml EGF, 50 ng/ml IGF-1 for 10 days). Count the cells using a hemocytometer and then plate approximately 2 x 10⁶mES细胞置于100毫米细菌培养皿或悬浮培养皿上。这些平板允许悬浮培养物的生长和促进胚状体(EBs)的形成。在分化第1天，mES细胞形成小的漂浮聚集体(EBs)，在光学显微镜下可见。任何携带的PMEF附在碟上。将悬浮细胞和培养基转移到15ml试管中，低速离心(500rpm) 3分钟。仔细吸取培养基，向成球的EBs中加入10ml新鲜分化培养基(10ng /ml bFGF, 8天)，然后将细胞置于新的细菌培养皿中。除了补充介质外，这一步骤还会清除从前一步骤遗留下来的任何PMEF。

4.4实时定量PCR

为了测定小鼠Espin、myosin via、Math1和α9 AchR的表达，在mESC和诱导的mESC群体中使用SuperScript II逆转录酶和随机六聚体(Life Technologies)合成了cDNA。反应结束时进行熔融曲线分析，以评价最终PCR产物的质量。阈值循环C(t)值通过固定基础荧光在0.05单位计算。每个样品重复3次，计算平均C(t)值。ΔC(t)值计算为C(t)样本- C(t) Gapdh。以C(t)Gapdh值为参考点，用ΔΔCt方法计算表达增加或减少n倍。

4.5免疫荧光

免疫荧光检测如前所述[7]。小鼠刺激ESCs生长在20% fbs预涂膜载玻片上，在4%甲醛中固定20分钟。用0.5% Triton X-100渗透2分钟后，细胞在含有5% BSA的PBS中阻塞1小时。然后与兔抗Espin、肌球蛋白VIIa、Math1、α9 AchR抗体的混合物在4℃下孵育一夜。细胞洗涤3次后，用山羊抗兔IgG H&L (FITC)孵育1小时，用含dapi的贴壁液贴壁。荧光图像使用蔡司共聚焦显微镜(卡尔蔡司微系统)拍摄。

4.6统计分析

所有分析均使用GraphPad PRISM 4.0 (San Diego, CA)进行。结果用平均值±SEM表示，并用Student进行比较t适当的方差检验或分析。当P小于或等于0.05时，差异被认为显著。

结果

5.1在这些因子存在的条件下，mESC中产生胚状体。

由ESCs和iPSCs产生的胚状体，分别用Wnt抑制剂Dkk1(8)处理，Dkk1是Smad3 (SIS3)的选择性抑制剂，可干扰TGF-b信号[9]和IGF-1，或单独或联合使用。为了诱导mES细胞分化为内耳毛细胞，将mES菌落准备好，在室温下用0.1%的明胶诱导内耳毛细胞(定义为分化第0天)30分钟，然后去除多余的明胶，用1x PBS冲洗3次。在分化第1天，使用分化培养基(20 ng/ml EGF, 50 ng/ml IGF-1，持续10天)，mES细胞形成小的漂浮聚集体(EBs)。任何携带的PMEF附在碟上。将悬浮细胞和培养基转移到15ml试管中，低速离心(500rpm) 3分钟。仔细抽取培养基，加入10ml新鲜分化培养基(10ng /ml bFGF, 8天)，使其成球形成胚状体(EBs)，然后将细胞置于新的细菌培养皿中。胚状体源性细胞形成并附着在培养皿上(图1)。将已知细胞密度的单滴(10-20 μ L)接种于培养皿的盖上，称为挂滴，可以更精确地控制EBs的形成。悬浮态EBs的形成有利于大量EBs的形成，但对由此产生的聚集体的大小几乎没有控制能力，常常导致形状不规则的大型EBs。这些EBs概括了早期胚胎发生过程中细胞分化的许多方面，并在ES细胞分化为多种细胞类型的过程中发挥重要作用在体外．

图1所示。在这些因子的作用下，mESC中产生了胚状体

5.2 mES细胞来源的内耳毛细胞的表征

在ESC分化协议的背景下，EB的形成经常被用作启动三个胚系的自发分化的方法。EB分化开始于外部细胞向原始内胚层表型[10]的规范。接下来，我们利用内耳毛细胞的特定生物标记物对诱导表型进行了表征。对诱导的内耳毛细胞群体进行实时荧光定量PCR，结果显示，与mESC细胞相比，诱导群体中Nanog的信使RNA表达及早期耳炎标志物Espin、myosin VIIa、Math1、α9 AchR的表达显著增加(图2)。此外，免疫荧光分析也显示，Espin、myosin VIIa、Math1、α9 AchR的存在及表达显著增加(图2)。α9 AchR蛋白在诱导内耳毛细胞群中的表达(图3)。这些数据表明内耳毛细胞成功生成在体外取自小鼠胚胎干细胞。

图2。实时荧光定量PCR分析Nanog与早期耳炎标志物Espin、myosin VIIa、Math1、α9 AchR的表达。所示数据经三次独立实验重复，用均值±SEM表示。以Gapdh作为数据归一化的对照。

图3。mES细胞来源的内耳毛细胞的特性。免疫荧光染色为Espin, myosin VIIa, Math1， α9 AchR FITC染色(绿色)。DAPI(蓝色)用于核的识别。X400。图A、D、G、J显示内耳分化生物标志物的表达;B、E、H、K显示细胞核DAPI染色。C、F、I、L表现为合并染色。

讨论

在本研究中，我们提出了小鼠ESC可以成功分化为内耳毛细胞谱系的证据。内耳毛细胞的质量是内耳毛细胞高效生成的最关键参数。mES细胞必须在PMEF上培养以防止自发分化。加入LIF有助于维持mES细胞处于未分化状态。由于mES细胞每12-15小时分裂一次，培养基迅速耗尽，必须每天更换。为了进一步提高分化效率，我们在内耳毛细胞分化步骤之前增加了一个10天的毛细胞诱导步骤。这种方法利用的事实是，当胚胎细胞首次进入内耳细胞谱系时，IGF-1和FGF信号都对毛细胞诱导的早期阶段至关重要。除了毛细胞的诱导，FGF信号维持培养作为内耳毛细胞。bFGF在发育中的内耳毛细胞中孵育可导致内耳毛细胞数量的急剧增加。fgf和IGF-1的组合协同作用，通过促进内耳后侧毛细胞的识别来诱导毛细胞的形成。 Thus the 10-day hair cell population induction step is designed to direct the mES cells towards the hair cells lineage prior to initiation of the process of inner ear hair cells specification.

已知哺乳动物内耳发育过程中发生的形态事件和细胞命运决定[4-6]。膜性迷宫在相应胚胎期的发育情况显示在中间的柱状图中。在E9处，常见的内耳干细胞形成外胚层增厚，即耳部基板，它位于神经板的第5和第6菱形体附近。中间一列显示的是神经板和耳部基板的横切面。E10.5时，耳膜底板内陷并闭合形成上皮囊，即耳囊肿。接下来，耳囊肿发生形态发生变化，包括后背侧的内淋巴管和囊的延伸和前腹侧的耳蜗管的延伸。最后，在这一阶段，耳囊肿附近的原位听觉神经节雏形已经形成。在E13.5时，耳蜗管不到一个转，细胞已达到前感觉期。到E17时，耳蜗管已经长到几乎完整的长度，感觉细胞也基本完成。如前所述，分离、扩展并引导干细胞走向特定细胞命运的能力对临床和基础听觉研究都具有巨大的潜力。 However, a key step in this process is the demonstration that an isolated stem cell can develop as a functional hair cell. Oshimaet al。[11]最近证明，一种模仿早期胚胎发育的逐步方案可以用于引导ESCs向内耳，然后，毛细胞的命运。以这种方式产生的esc诱导毛细胞表达与毛细胞形成一致的基因，并发展出与毛细胞表型一致的立体纤毛束样突起。最重要的是，电生理学研究证明这些esc来源的毛细胞具有功能性的立体纤毛束和机械敏感性。虽然这些结果提供了在体外驱动ESCs发展为功能性毛细胞的能力的决定性证据，但重要的是要考虑几个警告。

在耳膜基板阶段，基板内的所有细胞都表达转录因子Pax8、Dlx5和Pax2[12]。Pax8是这些基因中第一个被表达的，这表明它可能在耳炎诱导中起作用。然而，在Pax8缺失的小鼠[13]中，内耳发育正常，这表明Pax8的作用要么与另一个基因冗余，要么可能在对缺失的响应中得到补偿。Dlx5局限于耳膜囊泡背外侧腔室，缺失影响感觉和非感觉前庭结构的形态发生，其特征是缺少1 ~ 3个半规管和内淋巴管[14]缩短。小鼠内耳Pax2缺失导致耳蜗发育不全或严重畸形，内耳前庭区及听觉和前庭神经节[15]出现不同程度的缺损。大量研究表明bHLH蛋白Atoh1(以前称为Math1)是一种承诺因子，驱动前感觉细胞发育为毛细胞。所有的毛细胞，包括听觉和前庭细胞，在Atoh1突变小鼠[16]中都不存在，强制表达Atoh1足以在耳蜗的前感觉区域[17]甚至非感觉区域诱导毛细胞命运。过表达Math1后，成熟耳蜗中的非感觉细胞仍保留产生新毛细胞的能力在活的有机体内Math1是指导这些成熟的非感觉细胞[18]中毛细胞分化的必要和充分条件。Espin在其N端含有一个额外的肌动蛋白结合位点，是支持细胞-精细胞外质特化连接斑块[19]的主要肌动蛋白捆绑蛋白。聋跳鼠突变表明，编码毛细胞静纤毛肌动蛋白捆绑蛋白的基因缺乏肌动蛋白[20]。此外，肌动蛋白-espin系统的结构多态性表明，静纤毛[21]中存在一个典型的丝状和连接子系统。

激活内耳内的内源性干细胞群可能是修复感觉上皮细胞的理想来源。然而，现有的数据表明，一个成熟的耳蜗内的内源性干细胞的数量可能很低，甚至不存在。此外，激活这些细胞所需的程序/治疗方法仍然未知。因此，一种替代策略可能是将外源性干细胞移植到内耳。这种方法有几个优点，比如在移植前激活干细胞并使其偏向内耳或毛细胞，也有几个挑战，最重要的是很难将移植细胞定位到耳蜗的正确部分。将细胞直接输送到Corti器官将是理想的，但它的体积小，相对难以接近，这带来了一些挑战。将干细胞移植到螺旋神经节似乎是一种更有前途的方法。增加神经节内神经元的数量有利于人工耳蜗植入的效果。血管纹和螺旋韧带。很大比例的先天性听力损失是由与离子运输、间隙连接通信和内淋巴稳态相关的基因突变引起的。 Therefore, transplantation of stem cells that express wildtype alleles of some of these genes could be an option for the treatment of hearing loss. A final strategy might be to transplant genetically engineered cells that produce and secrete factors that might protect hair cells or attract spiral ganglion peripheral axons into the scala vestibuli or scala media.

总之，我们的研究证明了小鼠ESC细胞分化为内耳毛细胞系的潜在能力。将这些“潜在毛细胞”移植到有听力损失的动物模型中进行进一步的研究，这可能是未来治疗人耳聋的一种潜在方法。

披露的信息

手稿的作者没有经济利益冲突需要披露。

版权所有OAT。版权所有

参考文献

1. Lam BL, Lee DJ, Gomez-Marin O, Zheng DD, Caban AJ(2006)并发视力和听力障碍与死亡风险:国家健康访谈调查。角膜切削124: 95 - 101。［Crossref］
2. Mehra S, eveey RD, Keamy DG Jr(2009)美国听力障碍的流行病学:新生儿，儿童和青少年。耳鼻咽喉头颈外科140: 461 - 72。［Crossref］
3. Devarajan K, Staecker H, Detamore MS(2011)内耳毛细胞再生的基因传递和干细胞疗法综述。J Funct Biomater2: 249 - 70。［Crossref］
4. Kamiya K(2015)通过激活干细胞归巢因子靶向遗传性耳聋的内耳细胞治疗。前药物杂志6: 2。［Crossref］
5. 肢体CJ(2012)内耳干细胞治疗成为现实。趋势Amplif16: 3。［Crossref］
6. Okano T, Kelley MW(2012)内耳干细胞治疗:最新进展和未来方向。趋势Amplif16: 4-18。［Crossref］
7. Liu G, Park YJ, Abraham E(2008)白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK) -1介导的NF-kappaB激活需要胞质和核活性。美国实验生物学学会联合会J22日:2285 - 96。［Crossref］
8. Glinka A, Wu W, Delius H, Monaghan AP, Blumenstock C, Niehrs C (1998) Dickkopf-1是一种新的分泌蛋白家族成员，在头部诱导中起作用。自然391: 357 - 62。［Crossref］
9. Jinnin M, Ihn H, Tamaki K (2006) Smad3的新型特异性抑制剂SIS3的表征及其对转化生长因子- β - 1诱导的细胞外基质表达的影响。摩尔杂志69: 597 - 607。［Crossref］
10. Chen Y, Li X, Eswarakumar VP, Seger R, Lonai P(2000)成纤维细胞生长因子(FGF)通过pi3 -激酶和Akt/PKB信号传导是胚状体分化所必需的。致癌基因19日:3750 - 6。［Crossref］
11. Oshima K, Shin K, Diensthuber M, Peng AW, Ricci AJ，等(2010)来自胚胎和诱导多能干细胞的机械敏感毛细胞样细胞。细胞141: 704 - 16。［Crossref］
12. normly S, Grainger RM(2002)胚胎内耳的测定。J一般53: 100 - 28。［Crossref］
13. Mansouri A, Chowdhury K, Gruss P(1998)甲状腺滤泡细胞需要Pax8基因功能。Nat麝猫19日:87 - 90。［Crossref］
14. Acampora D, Merlo GR, Paleari L等人(1999)缺乏远端缺失相关基因Dlx5的小鼠的颅面、前庭和骨缺损。发展126: 3795 - 809。［Crossref］
15. Burton Q, Cole LK, Mulheisen M, Chang W, Wu DK (2004) Pax2在小鼠内耳发育中的作用。开发生物272: 161 - 75。［Crossref］
16. Bermingham NA, Hassan BA, Price SD, Vollrath MA, Ben-Arie N, et al. (1999) Math1:内耳毛细胞生成的必要基因。科学284: 1837 - 41。［Crossref］
17. Jones JM, Montcouquiol M, Dabdoub A, Woods C, Kelley MW(2006)分化和DNA结合抑制剂(Ids)在Corti器官发育过程中调节Math1和毛细胞形成。J >26日:550 - 8。［Crossref］
18. Kawamoto K, Ishimoto S, Minoda R, Brough DE, Raphael Y (2003) Math1基因转移在成熟豚鼠体内产生新的耳蜗毛细胞。J >23日:4395 - 400。［Crossref］
19. 陈斌，李安，王东，王敏，郑磊等(1999)Espin在其N端含有一个额外的肌动蛋白结合位点，是支持细胞-精细胞外质特化连接斑块的主要肌动蛋白捆绑蛋白。Mol Biol细胞10: 4327 - 39。［Crossref］
20. 郑l, Sekerkova G, Vranich K, Tilney LG, Mugnaini E, et al.(2000)聋哑跳鼠毛细胞静纤毛的espin肌动蛋白束蛋白编码基因发生突变，缺乏espin。细胞102: 377 - 85。［Crossref］
21. Purdy KR, Bartles JR, Wong GC(2007)肌动蛋白-弹力蛋白系统的结构多态性:静纤毛中细丝和连接子的典型系统。物理牧师莱特98: 058105。［Crossref］