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摘要

异常剪切应力通过调节复杂的信号通路在动脉粥样硬化的发展中起着关键作用。长非编码RNA（lncRNAs）直接作为RNAs发挥作用。然而，lncRNAs的差异表达及其调节细胞对剪切应力变化反应的网络仍不清楚．人脐静脉内皮细胞(HUVEC)暴露于较低的剪切应力(2达因/cm)^2.) 120分钟。差异表达(定义为fold change≥2.0，P<0.05)通过微阵列获得lncRNAs和mRNAs的表达，并通过盒散点图、热图和层次聚类进行分析。随后进行基因本体和通路分析。在剪切和正常上皮细胞之间差异表达的149个lncRNAs中，64个lncRNAs上调，85个lncRNAs下调。109个lncRNAs我们再差异表达（上调和下调30）。我们为62个差异表达的lncRNAs和35个差异表达的mRNA找到了84对匹配的lncRNAs mRNA对。确定了9条低切应力作用于细胞功能调节的途径。根据途径分析，两个上游基因（TLR4和BDNF）上调。我们的研究提供了剪切细胞（120分钟后）中lncRNA和mRNA的表达谱，并报告在84对差异表达的lncRNA mRNA中，TLR4和BDNF通路在低剪切应力诱导的细胞损伤中起着关键作用。

关键字

剪切应力，内皮细胞，长链非编码RNA，途径分析

缩写

lncRNA：长非编码RNA；EC：内皮细胞；HUVEC：人脐静脉内皮细胞；GO：基因本体；KEGG：京都基因和基因组百科全书；TLR 4：toll样受体4；LSS：低切应力

介绍

血管内皮细胞(Vascular endothelial cells, ECs)构成血管壁的内壁，直接暴露于血流模式，并在各种化学和机械刺激下发挥重要的稳态功能[1,2]。稳定的层流(10-20 dyn/cm^2.)必须通过释放许多动脉粥样硬化保护性细胞因子来维持内皮细胞的功能[3]。相反，较低（<10 dyn/cm^2.)或血流紊乱容易发生动脉粥样硬化，表现为动脉粥样硬化多发于冠状动脉树[4]的内弯和分叉区。

以往的研究报道了Ecs在较低剪切应力或流动干扰下的差异表达基因[5-7]，随后激活氧化、凋亡、细胞死亡和促炎途径[8,9]。然而，低切应力诱导的激活基因的调控机制仍有待研究。

最近，全基因组分析揭示了不编码蛋白质的大型RNA转录本的广泛转录，称为长非编码RNA (lncrna)，并为RNA在基因调控[10]中的中心性提供了一个重要的新视角。这些lncrna直接作为rna[11]发挥作用，招募染色质修饰物来介导从x失活到印迹等过程中的转录变化。不幸的是，关于lncrna的差异表达及其调控细胞对剪切应力变化反应的网络的信息缺乏。因此，本研究旨在提供全基因组分析数据，以显示lnc rna /mRNA的差异表达，以及低切应力作用于内皮细胞的途径。

材料和方法

细胞培养

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在37℃下，在含5%CO的增湿培养箱中培养_2.并在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中维持。当细胞生长到汇合的90%时，胰蛋白酶被消化，收获，重悬并播种到0.1%的明胶涂层玻璃中。粘附后，将生长在玻璃上的单层细胞施加不同时间长度的LSS。

流动研究

将硅垫圈夹在两块不锈钢板之间，并在底板上安装一个盖滑水槽，制成一个平行板流动室，可实现连续流动。放置玻璃（50 mm×30 mm）之前，对流动室和电路管的所有部件进行消毒将单层细胞放入流动室。参数设置如下：流动室高度，0.56 mm，泵速，60次/分钟。剪切应力值通过调节加载后的流量进行调整，并使用压力传感器的信息自动计算。我们流动研究中的剪切应力为2达因s/cm^2.(以ABCD 120、EFGH 120和IJKL 120标记)，循环液为1640培养液，提供2%胎牛血清。以无剪切应力培养的HUVECs为对照组(图1中以ABCD 0、EFGH 0、IJKL 0标记)。

图1所示。3个低切应力处理的内皮细胞与配对的非低切应力处理的内皮细胞中lncRNA和mRNA的表达差异．散点图是一种可视化方法，用于评估配对的两组内皮细胞之间lncRNA（a）和mRNA（B）的表达变化。散点图中X轴和Y轴的值是该组的平均标准化信号值（对数_2.绿色线表示折叠变化线（默认折叠变化为2.0）。方框图是快速可视化lncRNA（C）和mRNA（D）图谱数据集分布的便捷方法。标准化后，对数_2.九个样本之间的比率几乎相同。

RNA提取

根据制造商的协议，使用RNeasy微型试剂盒（德国希尔登Qiagen）从细胞中分离出细胞总RNA，然后使用NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）进行定量在提取RNA后和标记样品前，使用标准变性琼脂糖凝胶电泳评估每个样品的RNA完整性。

标记和杂交

去除rRNA（仅mRNA）后，从总RNA中纯化细胞总RNA（每个200纳克）™ 真核细胞mRNA分离试剂盒，Epicentre）。然后，在0.8µL随机引物和2µL无3'偏倚的加标混合物存在下，使用单色RNA加标试剂盒（安捷伦）将每个样本扩增并反向转录成cDNA，使用随机引物方法。然后根据安捷伦基因表达分析协议，使用安捷伦快速Amp标记试剂盒对这些cDNA样本进行清洗和标记。这些标记的cDNA样本用作探针，使用安捷伦SureHyb杂交室中的安捷伦基因表达杂交试剂盒在65℃下与微阵列杂交17小时。将标记的cRNA杂交到人LncRNA阵列v3.0（8 x 60K，Arraystar）上。杂交后，用安捷伦洗涤缓冲液试剂盒（安捷伦）洗涤微阵列，并用安捷伦微阵列扫描仪G2505C扫描。

lncRNA和mRNA微阵列

Arraystar人类LncRNA微阵列V3.0（中国上海康城有限公司）设计用于人类LncRNAs和蛋白质编码转录本的全局分析，检测到30586个LncRNAs和26109个编码转录本。LncRNAs是使用最受尊敬的公共转录组数据库（Refseq、UCSC已知基因、Gencode等）以及里程碑式出版物精心构建的。每个转录本由一个特定的外显子或剪接连接探针表示，该探针可以准确识别单个转录本。管家基因的阳性探针和阴性探针也打印到阵列上，用于杂交质量控制。每个转录本都使用1-5个探针来表示，以提高统计可信度。

数据分析

使用GenePix Pro 6.0软件(Axon)引导的安捷伦微阵列扫描仪，以5µm/像素分辨率扫描微阵列。然后将扫描图像(TIFF格式)导入安捷伦特征提取软件进行网格对齐和表达式数据分析。表达数据通过分位数归一化和安吉伦软件中的鲁棒多芯片平均(RMA)算法进行归一化。规范化后生成探针级文件和mrna级文件。所有基因级文件导入安捷伦genspring GX软件(11.5.1版)进行进一步分析。对原始数据进行分位数归一化后，选择6个样本中至少3个在Present或Marginal中有标记的lncRNA或mrna进行差异表达lncRNA或mrna筛选。通过fold change filtering识别差异表达的lncrna和mrna。

散点图

散点图是一种可视化方法，用于评估两个比较样本或组之间的LncRNA/mRNA表达变异(或重现性)。散点图中X轴和Y轴的值为样本或组的归一化信号值(log)_2.绿色线为折叠变化线（给出的默认折叠变化值为2.0）。顶部绿色线上方和底部绿色线下方的LncRNAs/mRNAs表示两个比较样本或组之间的LncRNAs/mRNAs变化超过2.0倍。

箱线图

箱图是一种快速可视化数据集分布的便捷方法。它通常用于比较所有样本的强度分布。归一化后，所有测试样本之间的log2比率分布由该箱图评估。

差异表达LncRNAs筛选

为了识别具有统计学意义的显著差异lncrna / mrna，我们在两组之间进行了火山图过滤。阈值为Fold Change≥2.0,p-value<0.05。差异lncrna定义为p值<0.005,FDR<15%， fold change>2.0。

热图和层次聚类

层次聚类是分析LncRNA/mRNAs表达数据最常用的聚类方法之一。聚类分析根据样本的表达水平将样本分组，这使我们能够假设样本之间的关系。树状图显示样本LncRNA/mRNA表达模式之间的关系。

基因本体(GO)分析

氧化石墨烯分析是一种将差异表达基因与氧化石墨烯分类联系起来的功能分析，包括生物过程、细胞成分和分子功能。GO类别来源于基因本体论(http://www.geneontology.org)，它由描述基因产品属性的定义术语的三个结构化网络组成。p值表示GO Term在差异表达基因中富集的重要性。p值越小，GO Term越显著(推荐p值<= 0.05)。

通路分析

将上述预测的靶基因输入数据库进行注释。基于最新的KEGG(京都基因和基因组百科全书)，http://www.genome.jp/kegg)在数据库中，我们对差异表达的mRNAs进行了通路分析。该分析可以确定差异表达基因显著富集的生物学途径。此外，我们还使用了可视化和集成发现（DAVID；http://david.abcc.ncifcrf.gov/)及BioCarta (http://www.biocarta.com)分析这些靶基因在通路中的潜在功能。P值表示该通路的重要性。越少P-value的值越大，路径越重要(theP-value cut-off为0.05)。

统计分析

所有数据均以平均值±标准差表示。使用Student’s进行统计分析T-测试比较两个变量的微阵列数据。例如，微阵列结果的统计意义是通过fold change来分析的，并且与P<0.05被认为具有统计学意义。还计算了错误发现率以纠正错误P我们用来筛选差异表达的lncRNAs和mRNAs的阈值是一个倍数变化≥2.0 (P< 0.05)。此外，每个lncRNA在剪切和非剪切内皮细胞之间的差异表达使用Student的T-测试与SPSS(版本16.0 SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。P<0.05被认为是显著的。

结果

内皮细胞中lncrna表达差异

为了分析内皮细胞中差异表达的lncRNA，我们对低切应力处理120分钟后内皮细胞和正常内皮细胞中lncRNA和mRNA的表达进行了全基因组分析(图1）.通过权威数据来源，我们发现有149个lncrna存在差异表达(fold change≥2.0，P<0.05），其中64个lncRNAs表达上调（剪切细胞比正常细胞高出两倍以上），85个lncRNAs表达下调（高出两倍以上）；P<0.05;表S1）.此外，我们根据p值进行了逐步基因组分析。在p值<0.01(超过2倍)时，有29个lncRNA上调，33个lncRNA下调。当采用严格的标准(p值<0.005)时，只有5个lncRNA表达上调，8个lncRNA表达下调(2倍以上)。最后，当采用我们严格的标准(p值<0.005,FDR<15%， fold change>2.0)时，上调的lncrna为C17orf76-AS1、BC079832和LEF1-AS1;下调的lncRNA包括xlo -007914和RP11-473M20.16(表S1)。

内皮细胞mrna表达差异

同样，我们发现109个mRNA在剪切内皮细胞和正常内皮细胞之间差异表达（超过两倍，p<0.05）（表S2）。其中79个mRNA上调，30个下调（p<0.05）.当p值设计为小于0.01时，分别有9个mRNA上调和7个下调。最后，根据我们的stric标准（p<0.005），6个mRNA上调和5个下调。我们为62个差异表达的lncRNA和35个差异表达的mRNA找到了84对匹配的lncRNA mRNA对（表S3）。

围棋与网络分析

通过GO分析，我们发现这些lncrna转录本的低调控和上调与细胞过程(本体论:生物过程)、细胞(本体论:细胞成分)和结合(本体论:分子功能)相关(图2和表S4).途径分析确定这些lncRNAs可能靶向与转录本对应的23条基因途径，即。，“细胞内部分”和“细胞内”由23个靶基因组成（推荐P-数值<0.05）(图2和表S5）.

基于这些GO数据，我们分析了差异lncRNA的网络结构(图S1)，分别按照生物过程、细胞成分和分子功能进行分类。

图2。基因本体论（GO）lncRNA靶基因的富集分析。（A）根据生物过程对lncRNA靶基因进行GO分析，（B）根据细胞成分对lncRNA taget基因进行GO分析，（C）根据分子功能对lncRNA靶基因进行GO分析。

通路分析

随后，我们进行了富集分数分析（图3）和路径分析。我们发现低切应力作用于细胞功能调节的9条途径（表S5）。在这9条途径中，2条与病毒相关（measeles为hsa 05162，肝炎为hsa 05161）和1条与非小肺癌相关（has 05223）被排除在分析之外。血管平滑肌收缩、心肌细胞中的肾上腺素能信号以及神经营养素相关信号通路也未从该分析中分析。最后，NF-kB、MAPK和Jak-STAT通路被认为是低切应力调节内皮细胞的主要通路，涉及9个基因（BDNF、DUSP4、GADD45B、MAP2K5、PLA2G4C、DDX58、GADD45B、TLR4、IL6ST、SPRY1、STAT5A）。

通过通路分析，两个上游基因TLR4和BDNF表达上调(图4和表S5)。TRL4是一种细胞膜定位蛋白，被认为是LSS的受体。如图4所示，低剪切胁迫显著上调TLR4和NF-kappa B相关基因。同样，低剪切应激激活的神经营养因子信号通路也存在于ECs和MAPK通路中，均通过BDNF的激活。BDNF是一种被报道由ECs产生的因子，在AS的进展中起着至关重要的作用。

图3。浓缩评分评估。根据它们的评分，我们评估了8条由低剪切应力上调的通路(上列)和1条下调的通路(下列)。分数表示富集的强度。

图4。路径分析。通过通路分析，BDNF和TLR4两个基因在低剪切胁迫下表达上调。KEGG数据库显示了BDNF-(左)和TLR4-(右)相关通路。

讨论

我们的研究提供了剪切细胞（120分钟后）中lncRNA和mRNA的表达谱，并分析了细胞对低剪切应力（2dyn/cm）反应的可能机制^2.)结果表明，在84对差异表达的lncRNA mRNA中，TLR4和BDNF通路在低切应力诱导的细胞损伤中起关键作用。

人们对RNA的生物学功能非常感兴趣。根据高通量分析[10,11]，调节非编码RNA (regulatory non-coding RNA, ncRNA)可分为短(长度<30 nt)、中(长度20-300 nt)和lncRNA(长度>200 nt)。到目前为止，大多数的lncRNA可能是功能性的，但只有相对较小的比例被证明与生物学相关，如调节细胞[12]的基础转录机制功能。不同来源的内皮细胞表达相对较高水平的保守长链非编码rna[13]。有报道称几种lncrna与动脉粥样硬化和内皮细胞功能障碍相关[14-16]。然而，在低剪切应力下的内皮细胞中缺乏差异表达的lncrna。在这里，我们首次报道了内皮细胞在低剪切应力(2.0 dyn/cm)处理后，3个lncrna (C17orf76-AS1、BC079832和LEF1-AS1)表达上调，2个lncrna (xoc -007914和RP11-473M20.16)表达下调^2.)120分钟。

C17orf76-AS1，也称为LRRC75A-AS1，动态地将激活的表皮生长因子和细胞外信号调节激酶（EGF/ERK）信号级联传递给网络中的直接相关蛋白和更远处的蛋白[17,18]，这与我们之前的发现一致，即低切应力激活ERK/MAPK信号通路[9]。LRRC75A-AS1和BC079832主要调节锌指和含BTB结构域的蛋白37（ZBTB37）基因，该基因参与MAPK信号的调节[17-19]。

LEF1-AS1是另一个反义转录本。调控KIAA1731基因的表达[20,21]。

随后，我们测量了低切应力处理后内皮细胞mRNA的表达。我们发现，两个主要的膜基因TLR4和BDNF都受到了显著的调控。TLR4与NF-κB信号通路的激活相关，并作为NF-κB的监测因子[22,23]。大量研究表明，TLR4/NF-κB系统参与了AS的形成和加速[24-27]。杨等．在lss处理的细胞中发现TLR4表达增加，激活NF-kB信号，在TLR4突变体[24]中抑制炎症。Michelsen还报道，在载脂蛋白e缺陷小鼠[27]中，TLR4基因缺陷导致主动脉斑块面积显著减少。TLR4通路的触发导致NF-κB信号通路的激活，进而调控炎症基因。在本研究中，我们发现LSS显著促进了TLR4、DDX58、GADD45B的表达，这些基因参与了NF-κB信号通路。此外，我们的研究首次发现TLR4是定位LSS受体的膜，是LSS诱导的内皮损伤的起始体。

我们检测了剪切细胞中的BDNF基因，发现其表达增加，我们认为BDNF参与了AS的进展。十年前，Nakahashi检测ECs在高剪切应力（24达因/厘米）下产生BDNF^2.)，[28]下降。单倍体缺陷bdnf受体与病变[29]中AS减少、平滑肌细胞增殖和胶原聚集相关。这些证据表明BDNF参与了AS的发生发展。然而，内皮细胞衍生的BDNF依赖于内皮功能，而不是人工刺激[29]。其他人也报道了AS患者血清[30]中BDNF的减少。虽然BDNF的确切作用还不是很清楚，但不建议否定BDNF与AS的关联，这需要进一步探讨。

结论

本研究报道了低切应力作用120分钟后内皮细胞中lncRNAs和mRNAs的差异表达。通路分析表明BDNF和TLR4基因在低切应力诱导的细胞损伤中起重要作用。

2021年版权燕麦。所有权利reserv

竞争利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益

作者的贡献

本研究由CSL设计并撰写。WZM进行了剪切应力实验、分子遗传学研究，参与了序列比对并起草了手稿。HZY进行了基因研究。LB参与了研究的设计并进行了统计分析。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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