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摘要

尽管进行了大量的努力，Ras癌蛋白的有效的药理抑制剂还没有到达临床，给人的印象是Ras蛋白是不耐药的。然而，在Ras调控的几个方向上已经取得了进展。

在这篇文章中，我们描述了一种新颖和有前途的方法，专门针对Ras/Raf相互作用。我们已经确定了参与Ras与Raf结合的氨基酸序列。结合位点的氨基酸被偶联到一个优化的穿透肽，以生成一个嵌合肽Mut3DPT-Ras，能够穿透细胞并靶向Ras/Raf相互作用。我们证明这种蛋白酶抗性肽具有在体外对几种癌症细胞系和从慢性淋巴细胞白血病(CLL)分离的原代细胞的凋亡作用以及对慢性淋巴细胞白血病样和淋巴瘤异种移植模型的抗肿瘤作用。这种新生成的肽可以调节Ras/Raf的相互作用，有可能成为一种新的癌症治疗方法。

关键字

细胞穿透肽，Ras，慢性淋巴细胞白血病，异种移植模型，淋巴

简介

癌症通常以突变为特征，突变会破坏控制细胞生存、增殖、分化和凋亡的正常机制。Ras小gtpase家族由四个高度相关的成员组成:K-Ras 4A, K-Ras 4B, H-Ras和N-Ras。这些蛋白质通常位于质膜的内叶，在那里通过与多个伙伴/效应子的相互作用参与信号转导。Ras功能在gtp结合的活性表单和gdp结合的非活性表单之间切换。活性Ras与其多重效应物之一Raf丝氨酸/苏氨酸激酶(c-Raf或B-Raf)结合，并诱导其转位至Ras完全激活的质膜[1,2]。

4个Ras同源蛋白(H-Ras, N-Ras, K-Ras 4A和K-Ras 4B)在前85个氨基酸中是相同的。Ras蛋白共有85个％在c端高变量区发生了很大的分化，该区域以CAAX基motif终止，在那里发生翻译后修饰。尽管Ras通路激活在髓系疾病发展中的作用已被描述，但越来越多的证据表明，Ras在淋巴类癌症的发展中高度活跃。在表达突变体Ras[3]的原代造血细胞中观察到淋巴样转化。K-Ras和N-Ras点突变已在几种血液癌[4]中发现，以及在其他实体肿瘤如结肠、胰腺、肺、卵巢和黑色素瘤[1]中发现。

由于突变蛋白是一种膜相关信号分子，在原发肿瘤细胞中表达量高，因此Ras是合理药物发现的一个有趣靶点。然而，由于Ras循环的性质和突变的功能后果，靶向Ras在实践中非常复杂[5,6]。鉴于这些生化问题，药物研发工作主要集中在四个方面:1)直接抑制Ras, 2)阻断催化Ras翻译后修饰的酶，这对膜靶向至关重要，3)开发下游效应物的抑制剂，4)寻找突变Ras的合成致命相互作用物[1,7]。

细胞穿透肽(CPP)是一种可以在不引起膜损伤的情况下转移到细胞内的分子，因此建议将其用作细胞内运送治疗物[8]的载体。CPP可以穿过细胞膜到达细胞质和/或[9]细胞核。我们报道了使用CPP和干扰肽的实验证据，我们能够分离caspase-9/PP2A诱导的相互作用在体外而且在活的有机体内肿瘤细胞死亡而不影响健康细胞[10-13]。考虑到传统方法难以达到细胞内或核靶点，CPPs在癌症治疗中的应用非常有意义[14,15]，基于肽的策略比其他给药系统具有相当大的优势。多肽疗法的主要优点包括免疫原性降低以及货物快速进入细胞。此外，它们在生理缓冲液中稳定，通常无毒[8,12]。

慢性淋巴细胞白血病(CLL)是成人最常见的一种白血病，它是由细胞凋亡[16]缺陷导致的单克隆B细胞在造血器官内的积累所定义的。临床治疗基于嘌呤类似物的使用，通常与环磷酰胺[17-19]和抗cd20单克隆抗体利妥昔单抗[19-21]相关。然而，尽管CLL患者的总体生存期有显著改善，但仍需要新的临床治疗方法，特别是复发或难治性CLL。血液恶性肿瘤如CLL为解决机制问题提供了特殊的平台，因为已经建立了培养原代细胞和健壮的小鼠模型的系统。

人类b细胞恶性肿瘤小鼠模型是临床前研究的重要工具。对于人b细胞淋巴瘤，已经建立了一些小鼠模型。本研究采用Daudi细胞移植裸鼠的体积模型，具有很高的效率价值。建立永久性B-CLL细胞系的困难阻碍了CLL的研究，但目前可靠的肿瘤移植模型很少。利用我们之前的数据[23]，我们评估了嵌合肽Mut3DPT-Ras在SCID小鼠[24]中注射人Jok1细胞和CD5转染的人Jok1细胞(Jok5.3)获得的异种移植小鼠模型的效率。尽管在CLL细胞系的长期培养中，CD5通常会丢失，但通过将人CD5基因稳定转染到Jok-1细胞中获得的Jok5.3细胞显示出与原代白血病细胞有点接近的表型。我们获得的异种移植小鼠出现了类似于法国-美国-英国标准定义的CLL类型的白血病。

我们已经利用我们在设计蛋白质/蛋白质相互作用的多肽方面的知识，以确定人类K-Ras蛋白和人类B-Raf蛋白中参与复合物形成的氨基酸，以便为Ras/Raf相互作用的控制生成新的工具。在这篇文章中，我们描述了Ras与Raf结合位点的鉴定，以及嵌合肽的生成，并评估了它们对人类cll样淋巴瘤异种移植瘤模型的潜在抗肿瘤作用。该肽可作为分离肿瘤细胞中Ras/Raf复合物的治疗工具，作为一种潜在的靶向和选择性临床方法。

结果

在体外Raf相互作用Ras序列的鉴定

为了确定与激酶B-Raf相互作用的人K-Ras蛋白的残基，我们从人K-Ras蛋白中生成重叠的十二肽，将其固定在纤维素膜中。(图1A)显示了与人类Raf蛋白杂交后的整个人类K-Ras氨基酸序列。一组斑点允许识别从169到188个残基之间的线性相互作用区域。此序列对应于已解决的暴露结构(数据未显示)。嵌合肽包含我们实验室之前开发的优化的细胞穿透序列Mut3DPT-Sh1，然后选择Ras相互作用序列进行化学合成，并进一步用于功能分析。(图1B)显示了人与小鼠K-Ras的K-Ras序列比较和肽段鉴定，显示了人与小鼠Ras序列之间Ras/Raf互作序列的高度同源性。(图1C)显示了人类H-、K-和N-Ras亚型之间的序列比较。序列中最重要的差异位于三个蛋白质的c端，这强烈表明我们的K-Ras亚型肽的特异性。

图1所示。Ras与Raf结合位点的鉴定。A)对纤维素结合Ras肽的Raf结合试验。Ras序列是一系列重叠的十二肽，其中有两个氨基酸移位。用ECL系统检测斑点。与Raf相互作用的Ras肽框和序列显示。米,鼠标;h,人类。B)人(h)和小鼠(m)种K-Ras序列比较。C)人类H-， N-和K-Ras亚型的序列比较。

我们有兴趣确认Mut3DPT-Ras肽的特异性靶点是Ras/Raf复合体。为此，我们分析肽是否能够靶向在体外交互Ras /英国皇家空军。在竞争试验中，MDA-MB 231细胞系的裂解物用抗Raf抗体免疫沉淀，与Raf的相互作用与肽Mut3DPT-Ras竞争(图2)。Ras在对照Raf免疫沉淀中检测到，而与1.5 mM的Mut3DPT-Ras肽竞争后检测不到。Raf作为内控，在两种条件下检测结果相似。这一结果表明Mut3DPT-Ras肽特异性靶向人类Ras和Raf之间的相互作用。

图2。．Mut3DPT-Ras在体外Ras/Raf相互作用中竞争。将MDA-MB231细胞系裂解，用抗Raf抗体免疫沉淀细胞质提取物。Ras/Raf与1.5 mM的Mut3DPT-Ras肽在室温下进行30min的体外相互作用。用抗ras抗体和抗raf抗体对免疫沉淀进行洗涤和免疫印迹，前者作为蛋白质装载的内控

穿透性肽Mut3DPT-Ras诱导细胞系凋亡

我们首先分析了Mut3DPT-Ras肽对结肠癌、肺癌和乳腺癌细胞株活力的影响(表1)。如图3A所示，即使在高剂量使用Mut3DPT-Ras肽，结肠癌细胞株HCT1116、SW480和HT29的活力几乎没有受到Mut3DPT-Ras肽的影响。相反，肺癌细胞系H1150、HBEC wt和HBEC Ras V12的活力在高剂量肽处理下受到显著影响(图3B)。最后，肺癌细胞系H1975、A549和H1299的活力受到高剂量Mut3DPT-Ras肽的轻微影响(图3B)。

图3。体外细胞活力和凋亡测定。A)结肠癌细胞株HCT116、SW480和HT29 (1x104/孔)分别与不同浓度的Mut3DPT-Ras肽处理。72h后记录吸光度。结果以相对于对照未处理细胞的活力百分比表示。B)肺癌细胞株H1650、HBEC wt H1975、A549、H1299和HBEC RasV12 (1x104/孔)加或不加不同浓度的肽处理72h。细胞活力分析如上所述。C) MDA-MB231、BC227(乳腺癌细胞株);用100 μ M的Mut3DPT- Ras肽处理SW620和SW480结肠癌细胞系24h, annexin V-FITC染色检测细胞凋亡情况。未处理的细胞(C)作为阴性对照。D)增加浓度的Mut3DPT-Ras肽处理Daudi和Jok1细胞24h后，annexin V-FITC染色分析细胞凋亡情况。 C; control.

表1。首先分析了Mut3DPT-Ras肽对结肠癌、肺癌和乳腺癌细胞活力的影响

起源	细胞系	突变
非小细胞肺癌细胞系	A549	k -
	H1299	n -
	H1650	Ras-wt
	H1975	喀斯特
	HBEC WT	Ras wt
	HBEC RasV12	k -
结肠癌细胞系	HCT116	k -
	HT29	k -
	SW480	k -
卵巢癌细胞系	SW626	k -
B淋巴瘤细胞系	Daudi	k -
cll样细胞系	Jok 1, Jok 5.3	-
乳腺癌细胞系	mda - mb - 231	k -
	BC227	Ras-wt

然后，我们分析了多肽Mut3DPT-Ras在几种结肠癌、卵巢癌和乳腺癌细胞系以及淋巴瘤和cll样细胞系上诱导凋亡的能力。如图3C所示，Annexin-V-FITC染色显示，该肽诱导MDA-MB 231、BBCx-17(乳腺癌细胞系)、SW626和SW480(结肠癌和卵巢癌细胞系)在处理24h后发生凋亡。对照组未处理细胞的凋亡基础水平显示。

我们进一步分析了该肽在人Burkitt淋巴瘤B细胞系Daudi和慢性淋巴细胞白血病样细胞系Jok1中的作用(图3D)。在两种细胞系中，Mut3DPT-Ras肽诱导细胞凋亡，并呈浓度依赖性，在Daudi和Jok1细胞系中，在100 μ M左右达到平台期。未处理的细胞系作为阴性对照。综合来看，这些结果表明在体外Mut3DPT-Ras肽在不同病理的人类细胞系中的凋亡效应，并相对于对照组未处理的细胞。

Mut3DPT-Ras对慢性淋巴细胞白血病肿瘤原代细胞有凋亡作用

图4。Mut3DPT-Ras肽对原代细胞凋亡的影响。A)采用Ficoll梯度法分离健康供体(HD)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者外周血单个核细胞(PBMC)，在存在或不存在Mut3DPT-Ras肽(100 μM)的情况下培养4h，洗涤后分析B细胞凋亡情况。B细胞在annexin V-FITC染色前用抗cd19抗体进行筛选。未处理的细胞作为对照。B)从HD或CLL患者中分离PBMC，按上述方法处理。annexin V-FITC染色检测非b细胞(T、NK、单核细胞)的凋亡情况。未处理的细胞作为对照。

为了评估该肽在来自同一来源的原代健康细胞和肿瘤细胞中的凋亡效应，我们使用来自健康供体(HD)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的外周血单个核细胞(PBMC)。将HD和CLL患者的pbmc用该肽处理4h(50µΜ)，用annexin-V染色分析细胞凋亡情况。该肽对从CLL患者分离的B细胞有重要的凋亡作用，对来自HD的B细胞有调节作用(图4A)。当分析非b细胞(T、NK、单核细胞)时，我们观察到HD和CLL患者之间的细胞凋亡水平与对照组非治疗细胞相似(图4B)。单独使用梭细胞对细胞凋亡没有影响，在HD和CLL患者样本中都没有(数据未显示)。这一结果可能提示肿瘤B细胞对肽的作用比健康B细胞更敏感。

Mut3DPT-Ras在人血清中稳定:采用质谱法测定人血清中Mut3DPT-Ras肽的稳定性在活的有机体内实验。当Mut3DPT-Ras (mw 3,732 Da)与人血清在37°C孵育时，进一步用HPLC-MS分析，我们观察到肽对蛋白水解降解表现出抗性，在37°C孵育24小时后，几乎所有肽保持完整(图5)。

图5。Mut3DPT-Ras肽在人血清中的稳定性。Mut3DPT-Ras在37孵育^o用质谱法(MS)分析了不同时间段人血清中C肽的完整性。在两个独立的实验中得到了相似的结果。每次测量均重复三次。标准偏差显示。<、控制;♦Mut3DPT-Ras。

Mut3DPT-Ras对人慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤异种移植瘤模型有抗肿瘤作用:在使用两种慢性淋巴细胞白血病Jok1和Jok5.3细胞系和人NHL Daudi细胞系的三种人异种移植模型中评估Mut3DPT-Ras的治疗效果。

图6。Mut3DPT-Ras肽具有显著性在活的有机体内人慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤异种移植模型的抗肿瘤活性。A) SCID小鼠，接种2.5 × 10⁶Jok1或Jok5.3细胞经尾静脉注射后，于第3天腹腔内(I.P.)注射5 mg/kg的Mut3DPT-Ras，连续5天，持续4周。对照组小鼠接受氯化钠。观察生存期77天。¯，Control Jok1;，Control Jok5.3;p, Mut3DPT-Ras Jok5.3;®，Mut3DPT-Ras Jok1。B) BALB/c裸鼠皮下接种10 × 10⁶以5 mg/kg的Mut3DPT-Ras处理Daudi细胞，连续5天，共4周。对照组小鼠接受氯化钠。观察肿瘤生长47天。SD各组(每组6只)平均肿瘤体积随时间的变化(*，P < 0.05;**， p <0.003)。显示6-16只小鼠/组的汇总数据。◊、控制;< Mut3DPT-Ras。C) BALB/ C裸鼠皮下接种10 × 10⁶Daudi细胞进行ip治疗。当可触及的肿瘤明显(平均:150-200毫米^3.)以5 mg/kg或20mg/kg的Mut3DPT-Ras，连续5天，持续4周。对照组小鼠接受氯化钠。监测肿瘤生长，直到肿瘤负荷达到最大伦理允许体积。◊、控制;■5毫克/公斤;▲，20 mg/kg。

Mut3DPT-Ras肽在CLL细胞系移植的SCID小鼠中注射细胞3天后开始治疗。如图6A所示，用5 mg/kg的Mut3DPT-Ras治疗Jok1和Jok5.3肿瘤获得了显著的生存效益，增加了中位生存期。对照组小鼠死于弥散性疾病，表现为中枢神经系统瘫痪，Jok1和jok5.3肿瘤接种后中位生存时间为20天。Jok1组和Jok5.3组的中位生存期分别显著延长至31天(p<0.003)和23天(p<0.01)。

如图6B所示，肿瘤大小(单位为mm^3.)与对照组相比，在daudii接种小鼠中，用Mut3DPT-Ras处理的细胞凋亡明显减慢(也就是说,(p<0.05)。NaCl处理并没有提高小鼠的存活率(图6B)。在肿瘤细胞接种后第47天，对照组小鼠因伦理原因安乐死(中等肿瘤大小，2866 mm)^3.)，而接受Mut3DPT-Ras治疗的动物记录的平均肿瘤体积为403 mm^3.．与对照组相比，肿瘤减少约81%具有统计学意义(p<0.01)。此外，我们观察到，与对照组相比，Mut3DPT-Ras治疗小鼠的肿瘤出现延迟(47天)vs。25天)。

在裸鼠中建立皮下Daudi肿瘤，使其平均肿瘤体积达到175mm^3.然后用生理盐水或Mut3DPT-Ras肽治疗，如材料和方法中所述。已建立的、体积大的实体肿瘤对治疗干预提出了重大挑战。在Mut3DPT-Ras治疗后，肿瘤体积明显减少。在以20 mg/kg/剂量治疗4周结束时，肽处理小鼠的移植瘤体积(1315±308 mm)大幅减少58%^3.)，与其他两组相比为1750±526 mm^3.(44%)和2904±693 mm^3.5 mg/kg/ Mut3DPT-Ras组和对照组差异无显著性(p<0.05，图6C)。此外，在接受20 mg/kg的Mut3DPT-Ras治疗的小鼠中，17%的小鼠肿瘤得到完全缓解而没有复发(图6C)。这一结果提示在预防和治疗治疗中都有抗肿瘤作用。

讨论

蛋白质-蛋白质相互作用是许多治疗领域的新兴分子靶点。然而，它们相对较大的相互作用表面被认为是一个风险因素，因为它可能很难调节或破坏使用小分子。当相互作用氨基酸的识别不明显时，这一障碍更为突出。新的方法，如使用细胞穿透肽(CPP)是一个很有前途的替代方式来调节蛋白质-蛋白质相互作用。

CPP作为一种新的载体，能够跨越细胞膜，克服内化问题，并将货物运送到细胞内。它们被用于细胞内运输货物，如多肽[10,11,25,26]。一种令人兴奋的靶向治疗方法是使用具有穿透能力和蛋白质-蛋白质干扰特性的嵌合多肽。我们已经发表了一种嵌合肽的使用，该肽由与caspase 9与PP2A结合位点相关的穿透序列组成[11,12]。该肽，以及优化的蛋白酶抗性变体[12]诱导细胞凋亡在体外特异性作用于原发肿瘤细胞，具有抗肿瘤作用在活的有机体内．

Ras在各种恶性肿瘤中频繁突变，包括胰腺、结肠、肺和黑色素瘤等。Ras突变与髓系病变的发展有关，越来越多的证据表明，Ras高度活跃与淋巴样癌的发展有关[3,27-29]。即使做出了重要的努力，Ras蛋白的有效药物抑制剂也没有到达临床。目前的研究主要集中在Ras的直接抑制、阻断Ras翻译后修饰、靶向Ras效应子、寻找突变Ras的致死性相互作用以及靶向Ras介导的代谢变化等方面。

我们已经确定了Ras蛋白及其效应子Raf之间的结合位点。blast序列表明所识别的序列在人和小鼠之间高度保守。

这一观察结果表明，这些序列应该具有重要的功能作用。此外，人类Ras亚型之间的序列比较显示出高度同源性，仅在c端CAAX基序存在差异。从Ras/Raf蛋白相互作用域衍生的肽与一个优化的穿梭子相关联，并评估其干扰亲本Ras/Raf相互作用的能力。该肽诱导所有测试细胞系和从慢性淋巴细胞白血病患者(CLL)分离的原代B细胞凋亡。然而，在从健康供体(HD)分离的B细胞上观察到的抑制凋亡效应可能提示一种非选择性(特异性)肿瘤效应。当我们单独分析CLL对B细胞的凋亡效应时，我们观察到5例患者样本有很强的凋亡作用，2例患者样本有较低的凋亡作用。当单独分析HD对B细胞的影响时，我们观察到一个更均匀的影响，除了一个HD，肽没有影响。

到目前为止所采用的大多数策略都没有区分野生型和致瘤型Ras。在这种情况下，Ras抑制剂对癌细胞而非野生型细胞的选择性作用原理主要依赖于癌细胞对Ras功能的药理抑制剂[30]更加敏感的“致瘤添加”现象。我们不能排除致癌Ras和野生型Ras利用不同的途径，从而特异性抑制致癌Ras。这表明这种肽主要阻止癌症，但不能或很少阻止正常细胞。在分析该肽的作用时在活的有机体内使用淋巴瘤的异种移植模型，我们观察到即使使用低剂量的肽，如5 mg/kg，在预防和治疗两种治疗中都有很强的抗肿瘤作用。我们观察到对CLL有中等效果，如异种移植模型Jok1和Jok5.3。

Pincus和他的同事们使用了一种基于计算机的分子建模方法，从Ras蛋白中设计了两种肽，可以阻止癌细胞的增殖。他们方法的合理性是识别Ras中的肽结构域，这些肽结构域会根据氨基酸取代改变构象。他们通过构象能计算比较了致癌型和野生型Ras的低能量平均结构。然后合成与细胞穿透序列穿透蛋白相关的多肽。据报道，Ras的38 - 47个氨基酸区域是Ras所有已知靶点的结合位点，包括Raf、GAP、SOS和PI3K[31-37]。同样的作者指出，Ras的55和71氨基酸之间的区域也与GAP和SOS蛋白有联系。Pincus和同事证实他们的多肽PCN-7(35-47)和PCN-2(96-110)阻断了与Raf的相互作用，并对细胞系具有抗肿瘤作用。他们还证实，这两种多肽诱导HT-1080细胞系表型逆转为非转化细胞，但导致MIA-PaCa2细胞系的肿瘤细胞坏死。他们推测PCN-2可能通过抑制Ras与JNK的相互作用来阻断致癌Ras。PCN-7可阻断致瘤Ras与Raf的相互作用[38,39]。 They suggest that both oncogenic and wild type Ras requires Raf activation, and assume, without demonstration, that each Ras protein interacts with Raf in different ways, resulting in differential activation of downstream kinases. In addition, they also mention, again without experimental demonstration, that their peptides block oncogenic Ras but have not effect on intracellular wild type Ras.

在这里，我们提出了一个类似的嵌合肽策略，但存在很大差异。首先，我们使用了一个专有的CPP它被专门设计来提供稳定性在活的有机体内应用[12]。第二，更重要的是，双功能肽的干扰域被设计为专门针对Ras和Raf之间的相互作用，这与Pincus使用的方法相反。通过这种直接靶向，我们不应该影响其他Ras或Raf功能，避免可能的不良影响。最后，我们做了概念的证明在活的有机体内使用cll样和淋巴瘤的异种移植模型，并证明了我们的肽的抗肿瘤作用。

尽管Ras参与多种类型的癌症，但临床上还没有针对Ras的有效抗癌药物，Ras被认为是“不能药物”的靶点。然而，最近的研究发现了新的表面包，可以接受小分子的活性和非活性形式。这些新的Ras抑制剂是在结构信息的基础上发现的。在Ras抑制剂的开发中，第一次努力是产生Ras的膜靶向抑制剂，如用于单药治疗或与其他细胞毒性药物联合使用的香叶酰化、戊烯酰化、法尼基化、豆蔻酰化或棕榈酰化的抑制剂[40-42]。不幸的是，除了对其他具有相同翻译后修饰的蛋白质的非特异性活性外，大多数这些抑制剂没有临床疗效。

人们也在努力阻止Ras的激活。除了正常细胞需要功能性Ras野生型的问题外，大多数鉴定的分子没有特异性和选择性。对于抑制Ras效应相互作用，这是最有前途的策略。几个团队设计了抑制Ras/Raf结合的化合物。但缺乏细胞功效的证据，结合亲和力低，特异性低，抑制作用弱，可能阻碍其进一步优化[30,43-47]。

我们之前曾使用CPP与干扰肽相关联的策略，从疗效和安全性的角度提供可能对癌症靶向治疗有用的工具[10,11]，表明Mut3DPT-Ras也可以共享这些有利的特性，正如使用慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的异种移植模型所获得的结果所表明的那样。在这两种情况下，肽显示出很强的抗肿瘤作用，没有明显的毒性。我们的数据进一步证实了Mut3DPT-Ras可能作为治疗CLL和淋巴瘤的新药物。

材料与方法

细胞系和试剂

H1975、H1299、H1650、HBEC wt、HBEC RasV12和A549是人非小细胞肺癌细胞系[48]。H1975、H1299和H1650 (NCI-60组)在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。HBEC wt、HBEC RasV12和A549在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养。MDA-MB231 (ATCC)和HBCx-17(从Decaudin博士实验室的原发性乳腺癌肿瘤中分离出来的细胞系，LIP)是乳腺癌细胞系，在添加10%胎牛血清的DMEM中培养。HCT116、HT29ans SW480是结肠癌细胞系，从CNIO收集的NCI60中获得。在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。SW626是在添加10%胎牛血清的DMEM中维持的卵巢癌细胞系。人淋巴瘤细胞系Daudi (ATCC CCL-213)和人慢性淋巴细胞白血病Jok1和Jok5.3[23]在添加10%胎牛血清、l -谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI中培养。细胞系的特征见表1。

Raf蛋白来自Emzo生命科学公司。抗ras抗体和抗raf抗体分别来自Merck Millipore和Abcam。二抗来自Dako。多肽由中国上海GL生物化工有限公司合成。Clarity ECL来自Bio-Rad。MTT活力测定试剂盒来自Bio-Rad。老鼠是从Janvier那里买来的。

版权所有OAT。版权所有

通过注射两种人慢性淋巴细胞白血病细胞系获得异种移植模型。用携带人CD5 cDNA的pLNCX载体稳定转染人细胞白血病Jok1 (CD5-， HLA-DR+， CD71+， CD20+)。通过有限稀释和扩增，筛选出稳定表达人CD5+的亚克隆Jok5.3在体外．通过标准免疫分型和FACS分析，细胞稳定地保持CD5表达水平，与CLL[24]观察到的水平相似。我们验证Jok5.3具有以下表型:CD5-， HLA-DR⁺、CD71⁺, CD20⁺．所有细胞株在添加10%胎牛血清(FCS)和2 mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养。

肽的合成和序列

多肽合成在一个自动化多肽合成器中，采用固相程序和标准的Fmoc化学。用反相高效液相色谱法和质谱法对肽段的纯度和组成进行了验证。该肽Mut3DPT-Ras序列已受到专利(EP13305945)的保护。

含Ras序列的纤维素结合肽的raf结合试验

扫描完整人类K-Ras序列的重叠十二肽通过自动斑点合成(Abimed, Langerfeld, Germany)在氨基来源的纤维素膜上制备，如所述[49,50]。用3%脱脂干乳/3% BSA饱和细胞膜，用纯化的Raf蛋白(4µg/ml)孵育，洗涤几步后，用抗Raf抗体孵育，然后用po -偶联二抗(Dako)孵育。阳性斑点用ECL系统(Bio-Rad)可视化。使用Image Quant LAS 4000软件获取图像。

分离细胞群和培养

来自健康献血者(HD)的新鲜血液从Etablissement Français du Sang (EFS)获得。慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者样本经患者书面同意后从血液科获得。采用Ficoll梯度离心法制备HD和CLL患者外周血单个核细胞(PBMC)。细胞在添加10% FCS、1%非必需氨基酸、1% Hepes、1%丙酮酸钠和1%谷氨酰胺的RPMI 1640中保存。

聚蔗糖梯度

我们使用的Ficoll:血的比例是1/3 Ficoll和2/3血液。PBS稀释血液(1:1)。小心地将稀释的血液铺在Ficoll培养基管上。将稀释的血液以一定的角度轻轻移到分离培养基上，加入到梯度中。在离心前，必须在密集的Ficoll培养基和血液层之间保持清晰的分离。在没有刹车的情况下，以2200转/分离心20分钟。小心地将PBMC层从管子上取下，转移到新的管子上。加入足够的PBS冲洗PBMC。以1500转/分的速度离心5分钟。重复洗涤步骤，倒入上清液，用适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬细胞。

Annexin-V-FITC染色检测原代细胞凋亡

从HD或CLL患者分离的人淋巴细胞用抗hcd19抗体(来自BD biosciences的APC氟色素)染色，并使用制造商描述的Annexin-V FITC (eBiosciences)测定早期凋亡事件。简单地说，细胞在1x结合缓冲液中洗涤，离心，重悬在100 μ l含Annexin-V FITC(0.1µg/ml)和碘化丙啶(0.5µg/ml)的1x结合缓冲液中。孵育15 min后，用流式细胞仪对细胞进行分析。检测细胞系细胞凋亡的方法相同，省去了用抗cd19抗体染色的步骤。由FACS Canto (BD生物科学)获得的数据用Diva 60软件进行分析。

细胞活力测定

采用基于3-(4,5-二甲基噻唑-2 -基)-2,5二苯基溴化四唑(MTT)的比色法测定细胞活力。第0天将细胞按适当浓度接种于96孔板中，第1天添加不同浓度的肽。按照制造商的方案处理72h后，用MTT法检测细胞活力。简单地说，每个孔中加入15µl的MTT (5 mg/ml溶解在PBS中)。37℃孵育4h后，用100 μ l 10% SDS溶于10 mM HCl裂解细胞。用无限200分光光度计(Tecan)测量540和620 nn的吸光度。我们在三次重复中进行所有实验，结果显示为细胞增殖的百分比归一化到控制条件。

免疫沉淀和免疫印迹法

细胞(1 × 10⁷)在裂解缓冲液(50 mM Tris (pH 8)， 1% Nonidet P-40, 137 mM NaCl, 1 mM MgCl)中4℃裂解20 min₂， 1mm CaCl₂10%甘油和蛋白酶抑制剂混合物)。裂解物(800 μg蛋白质)与适当的Ab在4℃下免疫沉淀过夜，然后在4℃下加入蛋白A-Sepharose 1 h。1× TBST (20 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 150 mM NaCl, 0.05%吐温20)洗涤后，SDS-PAGE分离免疫沉淀，转移到硝化纤维素中，阻塞(TBST中5%脱脂干牛奶)，与TBS-0.5%脱脂干牛奶中的原Ab孵育。用po -共轭Ab二级试剂冲洗和孵育膜。用ECL系统检测蛋白。使用Image Quant LAS 4000软件获取图像。

小鼠血清中肽的稳定性分析

Mut3DPT-Ras (10 μ M)在37℃下孵育于250 μ l小鼠血清中，孵育不同时间。样品被收集，并通过冷冻停止肽降解。使用ProteoMiner蛋白质富集系统(Bio- Rad)从收集的样品中提取多肽。按照他们的标准协议，使用MALDI-TOF (Brücker Autoflex II)进行质谱分析肽完整性(完整肽的百分比)。每次测量均重复三次。使用适当的软件(Clinprot工具，Flex分析，Brücker)分析MS数据。

蛋白质-蛋白质相互作用竞争

Ras/Raf相互作用使用肽Mut3DPT-Ras (VKKKKIKAEIKI KMSKDGKKKKKKSKTKCVIM)进行竞争）．用抗ras或抗raf抗体免疫沉淀mda - mb231细胞的裂解物，在4℃下加入蛋白A/G-Sepharose 1h。Ras/Raf相互作用与1.5 mM的肽Mut3DPT-Ras在室温下竞争30分钟。经过几个洗涤步骤后，将免疫沉淀转移到硝化纤维素中，并用相应的Ab进行印迹。

动物

购买6-8周龄SCID CB-17小鼠(雌性20-23g)和BALB/c裸鼠(雄性26-30g)(法国Elevage Janvier, Le Genest Saint-Ile, France)。所有小鼠均按照欧洲委员会动物福利指令2010/63/UE的条件和方案进行饲养。研究(编号1290和5089)由法国伦理委员会批准的动物实验编号74，所有实验都遵循上述委员会的指导方针进行。

在活的有机体内活动

建立移植瘤淋巴瘤模型，10 × 10⁶将100 μ L PBS的Daudi细胞皮下注射到雄性BALB/c裸鼠的胁部。CLL异种移植模型2.5 × 10⁶将Jok1或Jok5.3细胞以100 μ L PBS注入SCID小鼠尾静脉。小鼠(每组6 ~ 16只)在细胞移植后第3天或肿瘤明显可触及(平均150 ~ 200 mm)时腹腔注射生理盐水或Mut3DPT-Ras (5 mg/kg或20 mg/kg)^3.)，为期四周，连续五天。对于静脉注射模型，小鼠每天监测后肢麻痹的存在，在这种情况下牺牲。皮下模型每2 ~ 3天记录一次肿瘤生长速率，用数字卡尺测量肿瘤形成的主、小轴。用公式将测量值转换为肿瘤体积:肿瘤体积(mm^3.) =长轴×小轴²×0.5。

统计分析:为在活的有机体内数据、组间统计学比较采用方差方差分析析因分析。用Shapiro-Wilk检验评价资料的正态性和同质性，认为资料有效。

结论

综上所述，针对Ras/Raf相互作用的穿透细胞和干扰肽的方法是开发抗癌治疗药物的一种有前途的策略。在这篇文章中，我们演示了肽Mut3DPT-Ras用于治疗淋巴瘤和CLL的原理证明，为抗癌药物开发提供了新的前景。

Acknowledgemet

这项工作得到了法国巴黎SATT- Lutech和Inserm的支持。我们感谢Valery Frise帮助我们收集CLL的一些样品。还要感谢Gerard Zalcman博士的肺癌细胞株礼物和Jacky Lautridou的统计在活的有机体内分析。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

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