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摘要

严格控制IgE类开关重组(CSR)，以维持血清IgE的低浓度。IL-4和CD40信号诱导IgE CSR。NF-κB经典通路和STAT6参与其中。在本研究中，我们以诱导方式制备了一株表达TRAF3的M12细胞系。该细胞系显示NF-ΚB替代通路信号转导受损，epsilon生殖系转录(ɛGLT)表达减弱，提示NF-ΚB替代通路参与IgE CSR。在IL-4和抗cd40 Ab刺激后CaMKII被激活，CaMKII抑制剂KN-93同时抑制NF-ΚB替代通路的激活和IgE CSR。NF-ΚB替代途径的特征是TRAF3通过泛素化降解后NIK激活。在HEK293T细胞中，CaMKII和alpha4增强了TRAF3的泛素化。Alpha4被CaMKII磷酸化，而Alpha4与TRAF3相关。CaMKII还调节IL-4和抗cd40 Ab刺激诱导的正常脾B细胞IgE CSR。

关键字

IgE、CSR、CaMKII、NF-kB、TRAF3、泛素化、alpha4

简介

B细胞在骨髓中发育，独立于抗原的刺激，通过Ig基因的V、D、J区组装产生IgM类抗体[1,2]。成熟的B细胞在遇到外周组织中的抗原时，可通过类开关重组(class switch recombination, CSR)产生具有相同抗原特异性的不同类抗体，获得不同类型的效应子功能[3,4]。CSR既需要CD40信号，也需要细胞因子[5]的刺激。CD40结扎在所有CSR事件中都是必需的，并诱导AID的激活。AID作用于开关区转录产生的单链DNA[3,6]。细胞因子诱导开关区生殖系转录(GLT)，从而决定类开关的特异性。IgE类抗体与过敏的发生有关，受严密调控[7]的控制。IL-4/IL-13刺激诱导ɛGLT，进而诱导IgE CSR[8,9]。Iɛ启动子区域有STAT6和NF-kB位点，有报道表明STAT6和NF-kB经典通路在IgE CSR[10]的调控中发挥了重要作用。

NF-kB是一组转录因子，包括NF-kB1 (p105/p50)、NF-kB2 (p100/p52)、RelA (p65)、RelB和c-Rel[11,12]。它们以不活跃的形式存在于细胞质中，当细胞被激活时转移到细胞核中。各种刺激诱导了p105到p50和p100到p52[13]的过程。NF-kB的这种激活是由经典和替代途径介导的。经典通路在许多细胞中被各种刺激激活。另一方面，替代途径主要通过连接少量受体(包括TNF受体家族成员，如CD40和BAFFR)在B细胞中激活[14,15]。参与替代途径的主要转录因子是p100[11]的RelB和p52。p100降解为p52是由NIK[11]介导的。NIK磷酸化并激活IKKα，然后IKKα磷酸化p100诱导泛素化和蛋白酶体对p100的后续处理。在未受刺激的细胞中NIK蛋白含量较低，因为E3连接酶cIAP1/2在TRAF3的帮助下泛素化NIK降解[11,15,16]。 When receptor is ligated by its ligand, cIAP1/2 ubiquitinate and degrade TRAF3 instead, by assembling to the receptor. TRAF3 belongs to TRAF family and regulates the NF-kB alternative pathway negatively [17,18]. TRAF3 associates with CD40, and the mutant form of CD40 that cannot bind to TRAF3 failed to induce IgE CSR [19].

Alpha4最初被鉴定为B细胞受体(BCR)复合物[20]的相关分子。后来的研究表明，alpha4广泛表达，是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶如PP2A和PP6的调节因子[21,22]。Alpha4是细胞存活所必需的分子，即使在ES细胞中，Alpha4基因的缺失也是致命的[23,24]。在B细胞中对alpha4进行条件基因靶向研究发现，alpha4不仅参与BCR信号转导，还参与LPS、CD40和IL-4受体[25]等多种信号通路。B细胞特异性alpha4缺陷小鼠免疫T依赖Ag后，IgG亚类水平下降。在同样的小鼠中，IgM类Ab的反应是完整的，这表明在alpha4缺陷小鼠[25]中CSR受损。alpha4的神经元特异性基因靶向研究发现，alpha4通过与神经元细胞[26]细胞质中的CaMKIIα结合来调节学习和记忆。

CaMKII是一种多亚基丝氨酸/苏氨酸激酶，可被钙激活^{2 +}细胞内流[27,28]。CaMKII由四个成员(α、β、γ和δ)组成，体内每个组织细胞至少表达CaMKII[29]的一种类型。CaMKIIα主要表达于神经系统，但也有报道显示CaMKIIa存在于造血细胞[30]中。CaMKIIα通过磷酸化脑细胞中的AMPA受体和其他底物在学习和记忆中发挥重要作用[27,28]。淋巴细胞中的CaMKII通过磷酸化TCR信号转导[31]中的CBM复合体来调节NF-kB通路。

在本报告中，我们证实IgE CSR受NF-kB替代通路的调控。CaMKII通过增强293T细胞中TRAF3的泛素化正向调控NF-kB替代通路。CaMKII对正常脾B细胞的IgE CSR也有调节作用。

材料和方法

细胞和试剂

鼠B细胞系M12之前已经描述过，HEK293T (293T)细胞系是日本和歌山医科大学Kaisho博士好心的礼物。CaMKII抑制剂KN-93购自Wako纯化学工业公司(日本大阪)。IL-4是日本兵库医学院的中西博士好心送的礼物。购买了抗p52 Ab(细胞信号技术，Danvers, MA)，抗p65 Ab(细胞信号)，抗ha Ab (Roche, Manheim, Germany)，抗flag Ab (Anti-DYKDDDDK Ab, Wako)，抗磷苏抗体(Invitrogen, CA)，抗组蛋白H3 Ab (Sigma化学公司，MO)和抗traf3 Ab (Santa Cruz, Dallas, Texas)用于Western blot研究。Anti-CD40 Ab[48]和anti-alpha4 Ab的制备如前所述[20]。使用B细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech, CA)从BALB/c小鼠中制备脾B细胞，如前所述[48]。动物实验根据熊本大学指导方针进行，并经熊本大学动物实验委员会批准(批准号:A 27-071)。

Ca^{2 +}大量试验

用离心法收集M12细胞，在含有Probenecid (1.25 mM)和Pluronic F-127(0.04%)的无血清培养基中加载Fluo-4 AM染料(5 mM)，在37°C黑暗中60分钟。洗涤后，细胞被重新悬浮在含有丙苯南德酯(1.25 mM)的培养基中，并在荧光板读取器(MTP-800;科罗娜电气，茨城，日本)。在每个样品中，前60秒获取未受刺激的荧光基线，然后对受刺激的样品进行10分钟的分析。

cdna的制备和转染

采用RT-PCR方法克隆TRAF6 cDNA，引物为sense, GAATTCATGAGTCTGCTAAACTGTGA和反义，GTCGACCTATACCCCTGCATCAGTAC。

TRAF2 cDNA和泛素cDNA是日本奈良科学技术研究所Kawai博士好心的礼物。CaMKIIα cDNA先前有[49]的描述。用PrimeSTAR制备了Lys42被Arg取代的CaMKIIα cDNA激酶死亡突变体^Ⓡ诱变试剂盒(TaKaRa Bio, Shiga, Japan)使用以下引物:sense, GCTGCCAGGATTATCAACACCAAGAA和反义，GATAATCCTGGCAGCATACTCCTGAC[34]。所有序列均经ABI Prism DNA序列验证^Ⓡ310仪器(应用生物系统，CA)。质粒用HilyMax转染试剂(Dojindo, Kumamoto, Japan)转染。

NF-kB荧光素酶检测

报告基因NF-kB荧光素酶(pNFkB-Luc)从Clontech (Palo Alto, CA)购买。按照先前[50]描述的方法进行荧光素酶检测。简单地说，10µg的质粒在950µF, 276 V用基因脉冲器电穿孔转染到M12细胞中^Ⓡ二世(Bio-Rad, CA)。转染40 h后，用10 U/ml的IL-4和10µg/ml的anti-CD40 Ab刺激细胞。刺激4 h后收集细胞，用PicaGene系统(Wako Pure Chemicals)进行荧光素酶反应。

体外磷酸化试验

CaMKII对alpha4的磷酸化如同前面描述的[49]。GST-alpha4融合蛋白的制备已在前面介绍过[22]。His标记的alpha4用pBAD/His载体(Invitrogen)制备，融合蛋白用Talon金属亲和树脂(Clontech)根据制造商的协议进行纯化。

细胞分离

按照前面描述的[49]进行细胞分离。M12细胞在冰冷的10 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 10 mM NaCl, 3 mM MgCl中裂解₂和0.5% NP-40。细胞裂解物在冰冻5分钟内以低速涡流混合。然后在4°C下，以5000转/分离心1分钟。取上清作为细胞质。然后将球团(核组分)重新悬浮在50 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 5 mM MgCl中₂0.1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇，40%甘油。

诱导表达TRAF3通过Tet-Off^Ⓡ系统

pEF-BOS中小鼠TRAF3的cDNA是日本和歌山医科大学的Kaisho博士好心送的礼物。用GGATCCATGGACTACAAAGACGATGACGAC和GATATCTCAGGGGTCAGGCAGATCCGAGGT引物反转录PCR法提取TRAF3片段。将获得的cDNA插入pTRE2pur载体。诱导产生TRAF3的M12细胞的建立^Ⓡ系统，Clontech)准备如下。M12细胞先用pTet-Off转染^Ⓡ然后用pTRE2pur-TRAF3向量。经2轮极限稀释后，筛选出在强力霉素(MP Biomedicals, CA)退药后诱导表达TRAF3蛋白的M12-TRAF3。

泛素化分析

按照先前报道的[51]进行体内泛素化试验。293T细胞在100 mm培养皿中分别转染10µg的his标记泛素和ha标记TRAF3 cDNA，并加入或不加入不同的cDNA和试剂，如图图例所示。转染细胞在1 ml缓冲液A (6 M胍-盐酸，0.1 M Na)中裂解₂HPO₄,不₂阿宝₄， pH 8.0, 10 mM咪唑)和裂解物在冰上超声30 s。超声裂解物在旋转器中与30 μ l(填充体积)的His60 Ni超流树脂(Clontech)在室温下混合3小时。将微珠离心，去除微珠中的任何非结合物质，先用缓冲液A洗涤三次，然后用25 mM Tris-HCl (pH 6.8)、20 mM咪唑按1:4稀释的缓冲液A洗涤两次，最后用25 mM Tris-HCl (pH 6.8)、20 mM咪唑洗涤两次。在添加200 mM咪唑的sds样品缓冲液中煮沸，从小球中提取his标记蛋白，并进行Western blot分析。

实时聚合酶链反应

根据制造商的建议，使用RNA分离试剂盒(RNAiso plus, TaKaRa, Japan)提取总RNA。用Prime Script从20µl的2µg总RNA中合成cDNA^TMII第一链cDNA合成试剂盒(TaKaRa)按照制造商的说明。利用THUNDERBIRD软件对ɛGLT进行实时荧光定量PCR (RT - time PCR)^TM赛博绿色^ⓇqPCR MIX (toyoobo，日本)，包含以下引物:sense, CACAGGGGGCAGAAGATG和反义，AGGGGTAGAGCTGAGGGTTC[52]。管家基因GAPDH被评价为内阳性对照[53]。GAPDH引物为:TGAAGCAGGCATCTGAGGG和CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG。RT PCR采用AB 7300实时PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)进行。聚合酶链反应在以下条件下进行:50°C 2分钟，95°C 10分钟，95°C和60°C 40个周期15秒(应用生物系统)。通过熔融曲线分析验证了扩增子的特异性。阈值的比较周期(ΔΔC_T)方法显示ɛGLT的相对mRNA水平。

统计分析

图中数据以平均值+ SDs表示。学生t-test用于计算p值。差异被认为是显著的p值小于0.05。

结果

IgE类开关重组(CSR)受到NF-kB替代通路的正向调控

为了研究NF-kB替代通路在IgE CSR调控中的可能作用，如方法部分所述，建立了诱导表达TRAF3的小鼠B细胞系(M12-TRAF3)。如图1A所示，在停用强力霉素后，转染物表达了过量的TRAF3。用IL-4和抗cd40 Ab刺激亲代M12细胞和M12- traf3细胞诱导IgE CSR。通过在IgE CSR之前诱导ɛGLT来评估IgE CSR[5,6,10]。采用Real-Time PCR检测方法部分所示的ɛGLT。IL-4和抗cd40 Ab刺激5 h后亲代M12细胞诱导ɛGLT (30.1+7.9折)(图1B)。在多西环素停用前，同样的刺激诱导M12-TRAF3细胞中ɛGLT的小幅增加(8.1+2.6折)(图1B)。停用强力霉素后，M12-TRAF3细胞对IL-4 +抗cd40抗体的反应进一步降低+1.1折)(图1B)。据报道，TRAF3过表达可抑制NF-kB替代通路[32]。在图1C中，抗cd40 Ab刺激诱导p52的产生和核易位，显示NF-kB替代通路在M12细胞中被激活，正如之前报道的[19]。在M12- traf3细胞中，与亲代M12细胞相比，NF-kB替代通路的激活减弱。因此，这些结果表明IgE CSR受到NF-kB替代通路的正向调控。

图1所示。NF-kB替代通路参与IgE CSR的调控。(A)用Western blot和anti-FLAG抗体对停用多西环素24 h前后M12-TRAF3细胞的裂解物进行分析。数据具有三个独立实验的代表性。(B)对M12或M12- traf3细胞进行Real-Time PCR检测ɛGLT。在存在或不存在10 μ M的CaMKII抑制剂KN-93的情况下，用IL-4和抗cd40 Ab处理细胞5 h。在M12-TRAF3细胞中提取多西环素24小时，诱导过量TRAF3表达。四个独立实验的均值+标准差。（t以及;＊p< 0.05和**p< 0.01) (C)用抗cd40抗体刺激M12或M12- traf3细胞5 h，然后收集裂解物并制备核片段。用抗p52抗体对样品进行Western blot分析。用抗组蛋白H3抗体对膜进行重印迹以显示负载相等。数据代表三个独立的实验。

CaMKII增强了NF-kB替代通路对IgE CSR的调控作用

为了阐明NF-kB替代通路在IgE CSR中的调节机制，我们通过IL-4 +抗cd40 Ab刺激测试了多种激酶和磷酸酶抑制剂是否对IgE CSR有影响(数据未显示)。我们发现，CaMKII的特异性抑制剂KN-93抑制了M12- traf3细胞以及亲代M12细胞中ɛGLT的诱导，如图1B所示。为了进一步证实NF-kB替代通路和CaMKII参与IgE CSR的调控，我们进行了以下实验。首先，将报告基因NF-kB荧光素酶暂时导入M12细胞，用抗cd40 Ab刺激转染细胞。如图2A所示，该刺激诱导了NF-kB荧光素酶活性，如之前报道的[33]。KN-93的加入抑制了CD40刺激诱导的荧光素酶活性(图2A)。KN-93的抑制作用不大，可能是由于只有替代通路被阻断，而经典通路不受KN-93的影响。IL-4和CD40刺激后检测p65和p52的核易位，分别检测经典和替代NF-kB通路的激活。如图2B所示，在M12细胞中，IL-4和CD40刺激均可诱导p52和p65的易位，但KN-93处理仅抑制p52的易位(图2B)。接下来，我们研究了M12细胞中IL-4和抗cd40 Ab刺激是否激活CaMKII。此前，一种信号转导分子alpha4被证明与中枢神经系统[26]中的CaMKII有关。 Therefore, we investigated whether alpha4 was a substrate of CaMKII in an在体外磷酸化化验。CaMKII磷酸化了大肠杆菌中产生的gst标记和his标记的融合蛋白alpha4(图2C)。用这种alpha4作为底物，在M12细胞中监测CaMKII的激活。IL-4 +抗cd40 Ab刺激30分钟可诱导α 4的苏氨酸磷酸化(图2D)。KN-93处理抑制了alpha4的苏氨酸磷酸化(图2D)。此外,钙^{2 +}IL-4和抗cd40 Ab刺激在M12细胞中诱导了内流(图2E)，证实了这些细胞中CaMKII的激活。

图2。CaMKII正向调控NF-kB替代通路。(A)转染pNF-kB-Luc质粒后，在存在或不存在KN-93的情况下，用抗cd40 Ab刺激M12细胞。测量光强，定义未处理细胞的光强为1。三个独立实验的均值+标准差。（t以及;＊p< 0.05和**p< 0.01) (B)在存在或不存在KN-93的情况下，IL-4和抗cd40 Ab刺激M12细胞。核部分分别用抗p52和抗p65抗体进行Western blot分析，检测NF-kB替代通路和经典通路的激活情况。采用抗组蛋白H3 Ab来显示负载相等。数据代表三个独立的实验。(C) Ca存在下CaMKII对GST-alpha4和His-alpha4融合蛋白的体外磷酸化^{2 +}/ CaM。数据代表两个独立的实验。(D)在存在或不存在KN-93的情况下，用IL-4和抗cd40 Ab刺激M12细胞。裂解物用抗α 4抗体进行免疫沉淀，并用抗磷苏氨酸抗体进行印迹。数据代表三个独立实验。(E)使用IL-4和抗cd40 Ab刺激M12细胞，同时使用或不使用EGTA。Ca^{2 +}用Fluo-4 AM染料监测血流量。数据代表三个独立的实验。销售税;谷胱甘肽S-transferase。凸轮;钙调蛋白。EGTA;乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N'，N'-四乙酸。

CaMKII增强了TRAF3的泛素化

2021年版权燕麦。所有权利reserv

NF-kB替代途径的特征是NIK的积累和激活，这是由TRAF3[11]的降解引起的。为了研究CaMKII是否通过调节TRAF3的降解来增强NF-kB替代途径，如方法部分所述，在293T细胞瞬时转染系统中分析TRAF3的泛素化。his标记泛素和ha标记TRAF3的cdna共转染导致TRAF3泛素化，如图3A所示(lane 2vs。共转染CaMKII的cDNA增强了TRAF3的泛素化(图3A, lane 4)vs。10微克CaMKII的cDNA最大限度地增强了泛素化，甚至1.25微克的cDNA也明显有效(图3B)。为了进一步证实CaMKII对TRAF3降解具有积极的调节作用，我们在该体系中测试了CaMKII抑制剂KN-93的作用。用n -93处理转染物确实抑制了293T细胞诱导的TRAF3泛素化(图3C)。根据之前的报道[34]制备CaMKII cDNA激酶死型，与泛素和TRAF3的cDNA一起转染到293T细胞中。CaMKII的激酶死型对TRAF3的泛素化没有影响，这表明CaMKII的酶活性是调控TRAF3泛素化所必需的(图3D)。

图3。CaMKII和alpha4增强了TRAF3的泛素化。(A) CaMKII和alpha4过表达对TRAF3泛素化的影响。293T细胞转染指示表达质粒。培养的最后6 h加入MG132。细胞在变性条件下裂解，裂解液用Ni超流树脂拉下。用抗traf3抗体进行Western blot分析，检测各转染蛋白的表达水平。数据代表了四个独立的实验。(B) CaMKII对TRAF3泛素化的剂量依赖性增强。293T细胞转染固定数量的泛素和TRAF3质粒和增加数量的CaMKII质粒。泛素化分析如(A)所示。数据代表三个独立实验。 (C) Effect of KN-93 on the ubiquitination of TRAF3. Cells were transfected with indicated plasmids in the presence or absence of KN-93. Ubiquitination was analyzed as in (A). Data are representative of three independent experiments. (D) Cells were transfected with wild type or mutant CaMKII with indicated plasmids and ubiquitination was analyzed as in (A). Data are representative of three independent experiments.

Alpha4与TRAF3结合并调节其泛素化

B细胞特异性alpha4缺陷小鼠显示CSR对IgG1受损，提示alpha4可能参与CSR[25]。我们还证实了CaMKII与中枢神经系统(CNS)[26]中的alpha4相关。因此，我们测试过表达alpha4对TRAF3泛素化的影响。加入alpha4的cDNA进一步增强了CaMKII过表达诱导的泛素化(图3A, lane 5)vs。然而，单独转染alpha4的cDNA的效果远小于CaMKII(图3A, lane 3)vs．2号车道和图4A)。由于alpha4是一种普遍表达的分子，内源性的alpha4表达可能降低了外源性alpha4[25]过表达的影响。我们先前描述了alpha4的显性阴性(DN)形式，它可以有效抑制内源性alpha4[35]的功能。因此，我们将这种显性阴性形式的alpha4 cDNA与CaMKII一起转染。如图4B所示，alpha4的DN形式降低了CaMKII增强的TRAF3的泛素化。我们用免疫共沉淀法研究alpha4是否与TRAF3相关。当Alpha4在293T细胞中共同表达时，它们与TRAF3特异性结合(图4C)。Alpha4不与TRAF2和traf6等其他TRAF成员分子结合(图4C)。

图4。Alpha4与TRAF3结合以增强其泛素化。(A) 293T细胞转染固定数量的泛素和TRAF3质粒和增加数量的alpha4质粒。泛素化分析如图3所示。数据代表三个独立的实验。(B) alpha4显性阴性(DN)形式对TRAF3泛素化的影响。293T细胞在存在或不存在DN-alpha4的情况下转染泛素和TRAF3。数据代表三个独立的实验。(C) alpha4与TRAF3的关联。将Alpha4 cDNA与标记的TRAF2、TRAF3或TRAF6一起转染293T细胞。细胞裂解物用抗alpha4免疫沉淀，并用抗flag抗体进行Western blot分析。数据具有两个独立实验的代表性。

IgE CSR在B细胞中受CaMKII的调控

由于NF-B通路通常以组织和/或刺激依赖的方式调节[36]，因此研究CaMKII是否调节B细胞系M12中的NF-kB替代通路是很重要的。IL-4和抗cd40 Ab刺激诱导M12细胞中TRAF3降解，如前所述(图5A)[18]。在M12细胞中进行Real-Time PCR，研究CaMKII瞬时表达对ɛGLT的影响(图5B)。CaMKII cDNA的过表达增强了ɛGLT。这表明CaMKII增强了M12细胞中IgE CSR的表达。

接下来我们研究M12细胞中观察到的现象是否适用于正常的成熟B细胞。从BALB/c小鼠脾脏中制备成熟B细胞。IL-4、抗cd40 Ab与BCR交联诱导成熟B细胞ɛGLT，如图5C所示。加入KN-93抑制了这些刺激诱导的ɛGLT(图5C)。

图5。CaMKII在正常脾B细胞中调节NF-kB替代通路。(A)用IL-4和抗cd40 Ab刺激M12细胞4小时，并用抗traf3 Ab或抗alpha4 Ab印迹裂解物。数据代表三个独立实验。(B)转染CaMKII cDNA的M12细胞。用IL-4和anti-CD40 ab刺激转染细胞40 h后，从每个样本中提取mRNA, Real-Time PCR检测ɛGLT。ɛGLT的相对mRNA水平表达为未处理细胞的1倍。三个独立实验的均值+标准差。（t以及;＊p< 0.05) (C)从BALB/ C小鼠的脾脏中制备正常B细胞，这些B细胞在存在或不存在KN-93的情况下被IL-4和抗cd40 Ab刺激。Real-Time PCR检测ɛGLT的表达水平。三个独立实验的均值+标准差。（t以及;**p< 0.01) GLT;种系成绩单。kn - 93;CaMKII抑制剂。

讨论

我们在这篇报道中首次发现NF-kB替代通路参与了IgE CSR的调控。CaMKII通过增强TRAF3的泛素化正向调控IgE CSR。由于TRAF3是NF-kB替代通路的负调控因子，过表达TRAF3会导致p52的生成减少(图1C)。在该转染物中，ɛGLT诱导降低，表明NF-kB替代通路在IgE CSR中发挥作用。NF-kB通路在许多细胞中被各种刺激激活。经典通路在大多数细胞中被激活，而备选通路在B细胞中通过TNF受体家族成员的结扎被激活。基因靶向实验表明经典通路参与了CSR的调控，但也有文献表明NF-kB替代通路也参与了[37]。Aly (alymphoplasia)突变小鼠体内没有淋巴结显示有点突变尼克NIK是NF-kB替代通路[38]的关键分子。这些小鼠没有检测到IgA水平。另一种突变小鼠(Lym1)在Nfkb2也显示IgA CSR[39]受损。该突变导致非加工p100的产生，因此NF-kB替代通路被破坏。此外，TBK1缺陷B细胞显示IL-4和抗cd40 Ab[40]诱导的IgA CSR增强。TBK磷酸化NIK，诱导NIK降解，抑制NF-kB替代途径。

Ca^{2 +}是淋巴细胞中公认的第二信使，除了钙调神经磷酸酶和PKC外，CaMKII也参与了淋巴细胞[29]的信号转导途径。CaMKII有四个成员(α、β、γ和γ)，据报道，α和β形式几乎只在大脑中表达。然而，每个组织至少表达一种CaMKII，淋巴细胞也表达CaMKII[41,42]。据报道，在中枢神经系统中，CaMKII作为NF-kB经典通路的上游信号转导器，在淋巴细胞中，CaMKII通过TCR刺激激活，磷酸化NF-kB经典通路的组成部分CARMA1[31,43]。在本文中，我们发现CaMKII被IL-4和anti-CD40 Ab激活，从而激活NF-kB替代通路。

为了清楚地证明CaMKII的酶活性是诱导TRAF3泛素化的必要条件，我们根据之前的报道[34]制备了CaMKIIα的激酶死亡(KD)突变形式。该激酶死突变体可与Ca相互作用^{2 +}/calmodulin和细胞内内源性CaMKII分子。CaMKIIα的激酶死亡突变体转染293T细胞时，对TRAF3的泛素化没有积极影响(图3D)。转染KD突变体后泛素化程度略有降低，提示该突变体可能通过形成由野生型和突变型组成的复合体而发挥显性阴性型的作用。

Alpha4最初被确定为BCR信号转导分子[20]。后来的实验证实alpha4是一种磷酸酶调控分子[21,22]。此外，有报道称alpha4与E3连接酶结合并调节其酶活性[44-46]。Alpha4可能与底物或E3连接酶或两者结合[44-46]。在本研究中，我们发现alpha4与泛素化的底物TRAF3相关。Brautigan博士的[21]小组只报道了α 4的丝氨酸磷酸化。在我们的例子中，苏氨酸也被磷酸化了。这种差异可能是由于我们所采用的刺激方法不同所致。

确认

我们感谢田中隆博士(日本理研综合医学中心)对泛素化试验的建议。

Kano Tanabe获得熊本健康科学大学特别奖学金资助号为2015-C-12。

的利益冲突

作者声明没有商业或经济利益冲突。

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