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摘要

神经元电压门控钙(Ca^2＋)频道（VGCC）以其在特定回路中的神经递质系统和信号通路的活动中的重要作用而闻名。神经回路中的紊乱可导致神经精神障碍的表现。例如，在大多数精神分裂症患者中观察到感觉运动门控缺陷。整合感觉运动门控机制的稳定性通常通过预脉冲抑制（PPI）来评估试验，但不同VGCC在PPI期间的各种作用尚不清楚。因此，本研究旨在通过行为和生化试验来检验Cav2.2介导的信号是否与精神分裂症症状相关。接受侧脑室注射ω-芋螺毒素GVIA（5 pg/侧）的小鼠Cav2.2受体阻滞剂，在纹状体和额叶皮质内表现出PPI缺陷和多巴胺和5-羟色胺的基线水平降低。这些发现表明，Cav2.2介导的神经回路异常可能是精神分裂症的基本病理生理机制。

关键词

神经回路，ω-conotoxin GVI，脉冲前抑制，精神分裂症

介绍

钙(Ca^2＋)信号通过电压门控Ca^2＋通道(VGCCs)中介Ca的进入^2＋进入细胞膜后的细胞去极化神经元VGCC，如Cav2.1（P/Q型）、Cav2.2（N型）和Cav2.3（R型）通道，介导许多神经元功能，包括神经元兴奋、神经突起生长、，突触发生，神经递质释放、神经元存活、分化、可塑性和基因表达调控[1-3]。然而，不同VGCC在神经精神疾病表达中的不同作用尚未完全确定。

神经精神疾病，如精神分裂症、亨廷顿氏病、强迫症、注意力缺陷障碍和图雷特氏综合征，与感觉运动门控机制缺陷相关[4]。在人类和动物中，感觉运动门控机制的完整性经常使用脉冲前抑制(PPI)来评估，这是在20-500 ms[4]的引导时间内，当一个令人吃惊的刺激之前有一个弱刺激时，对惊吓反射的抑制。大量的证据表明精神分裂症的病理生理学包括多巴胺功能障碍,血清素激活的,glutamatergic,和g-aminobutyric酸(GABA) -ergic神经递质系统[5],据报道,Cav2.2渠道影响突触前机械参与几个神经递质的释放,包括多巴胺(DA);6 - 8), 5 -羟色胺(5 -;9]、谷氨酸[10]、GABA[11]、乙酰胆碱[12]、去甲肾上腺素[NE;13]，来自中枢神经元。在临床意义上，精神分裂症与重要的突触前信号传导基因密切相关[14-17]。因此，使用Cav2.2阻滞剂应该会导致PPI缺陷，因为通过Cav2.2通道精确调节神经递质释放在神经元回路的功能中起着重要作用。

因此，本研究旨在探讨cav2.2介导的信号转导与感觉运动门控的关系，为进一步了解精神分裂症的表达机制奠定基础。ω-Conotoxin GVIA是Cav2.2通道[1]的拮抗剂。此外，测量小鼠大脑中单胺及其代谢物的数量，以确定单胺代谢改变与行为异常之间的关系。

材料和方法

老鼠

所有动物程序均经过上海焦彤大学动物实验委员会批准，并批准。C57BL / 6J小鼠由Charles River Japan（日本神奈川）提供。小鼠可以免费获得水和食品颗粒（CRF-1;东京，日本东京酵母有限公司），并被安置在12/12-H光/黑暗周期（08:00至20灯：00）在23岁±1°C和55±5%湿度。测试是在周期的轻阶段进行的。

输液

在输注研究中，将Cav2.2阻滞剂、ω-conotoxin GVIA(10、50或100 pg/μL, Peptide Institute, Osaka, Japan)溶解在生理盐水(vehicle)中。麻醉下，采用标准立体定向手术，将22号不锈钢导管植入侧脑室(bregma后，-0.34 mm;中线外侧，±0.9 mm;从硬脑膜腹侧，−2.3 mm)。手术后小鼠至少恢复1周。用异氟醚对小鼠进行短暂麻醉，以便于插入26号注射管。在行为或生化测试前30分钟，以0.05 μL/min的速度向侧脑室(0.1 μL/侧)输注。输液后将注射管放置2分钟。药物剂量根据既往报道确定[18,19]。未接受药物治疗的小鼠接受了等量的载具。

抑制听觉惊吓反射

PPI测试使用SR-LAB系统(San Diego Instruments;美国圣地亚哥)由四个消声室组成，每个室都配有圆柱形有机玻璃动物围栏(长度:6.5厘米;内径:3.8 cm)。通风设备由一个小型电风扇提供，同时产生70分贝的背景噪音。声音脉冲由放置在动物围护结构上方24厘米处的扬声器呈现，由动物响应引起的任何运动都由固定在动物围护结构上的压电加速度计检测。音调脉冲参数由微型计算机控制，使用软件包(SR-LAB)和接口组件，也进行数字化、整流和记录稳定计读数。如Brake所述，声震反应(ASR)和PPI的测量是在单个会议中获得的et al。[20] ，稍作修改。

将小鼠置于有机玻璃外壳中，并在37个离散试验中进行测试之前使环境适应环境5分钟。在前两个试验中，测量ASR的大小为120dB音调持续50ms;这些前两个惊吓音调旨在习惯动物到测试程序，并从平均ASR振幅的统计分析中省略。在随后的35个试验中，在呈现持续30毫秒的预先展示之后，惊吓音调或100毫秒。Prepulse强度范围为3-15 dB，在背景噪音之上，在3 dB的步骤的试验之间随机变化。在五种试验中的五种试验中的每种预脉冲强度中的每一个中获得ASR的大小的测量，并且在其他10个试验期间只用惊吓音调随机呈现小鼠。

同样的刺激条件从未出现在超过两个连续的试验中，试验之间的间隔使用一个平均持续时间为15秒的可变间隔计划(范围:5-30秒)。ASR振幅的测量是由以1 kHz的频率刺激开始时收集的100个数字化数据点的平均值得出的。预脉冲抑制ASR的有效性以百分比表示，该百分比基于仅对惊吓音的平均反应幅度(n= 10)相对于五种预脉冲条件(n= 5/条件)，计算如下:% PPI = 100−[(预脉冲试验平均惊吓幅度+脉冲试验平均惊吓幅度/单独脉冲试验平均惊吓幅度)× 100]%。

生化试验

大脑中单胺及其代谢物的水平如中川所述进行了检测et al。[21]，稍作修改。腹腔注射后30min用聚焦微波照射处死小鼠，快速取脑。纹状体和额叶皮层被分离到一个冰板上，每个大脑样本都被迅速冷冻并储存在-80°C的深冰箱中，直到进行分析。采用高效液相色谱-电化学检测法(Eicom Corp.， Kyoto, Japan)测定DA、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-HT、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)和NE的含量。

数据分析

数据以平均值±平均值标准误差(SEM)表示。使用Excel Statistics 2006 (SSRI，东京，日本)对行为和生化研究进行统计分析。采用Dunnett检验对数据进行分析。

结果

脑室内注射ω-Conotoxin GVIA对ASR和PPI的影响

本研究检测了I.C.V的影响。在ASR和PPI上注射ω-圆锥毒素GVIA。四组男性小鼠（nω-Conotoxin GVIA注射1、5、10 pg/侧。各组间惊吓幅度无显著差异(图1A)。在PPI模型中，虽然载体注射和1 pg/side ω-Conotoxin GVIA注射小鼠之间没有显著差异(图1B)，但接受5 pg/side ω- cono毒素GVIA或10 pg/side ω- cono毒素GVIA的小鼠比接受载体注射的小鼠表现出更大的感觉运动门控缺陷。这两组在三个脉冲前强度(79 dB、82 dB和85dB)均表现出显著的缺陷，这表明阻断cav2.2介导的信号通路损害了感觉运动门控。实验完成后，通过注射墨水来验证导向套管的正确位置(数据未显示)。

图1所示。在载体-和ω-Conotoxin gvia - injection小鼠中，平均惊幅(A)和PPI百分比(B, C, D)。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05， **P<0.01。

脑室内注射ω-Conotoxin GVIA对单胺及其代谢物水平的影响

本文研究了注射ω-Conotoxin GVIA对脑内单胺及其代谢物水平的影响。两组雄鼠(n= 10)管理i.c.v.车辆或注射的ω-Conotoxin GVIA (5 pg /侧)和大量的类及其代谢物在大脑中使用高效液相色谱法分析测定(表1和2)。有显著降低小鼠的纹状体和前额皮质DA含量,得到ω-Conotoxin GVIA相比此外，在接受ω-Conotoxin GVIA的小鼠的额叶皮质中，DA的周转率(定义为DOPAC或HVA与DA的比值)显著增加。通过注射ω-Conotoxin gvia的小鼠与注射载体的小鼠NE含量无显著差异(表1)。与注射ω-Conotoxin GVIA的小鼠相比，注射ω-Conotoxin GVIA的小鼠纹状体和额叶皮层的5-HT水平显著降低(表2)。5-HT的周转率(定义为5-HIAA与5-HT的比值)。在接受ω-Conotoxin GVIA的小鼠的额叶皮质也有明显的增加。

表1所示。在vehicle -和ɷ- conotoxin GVIA注射小鼠中单胺及其代谢物的浓度

	达	多奥波克	DOPAC / DA	HVA	HVA / DA
纹状体的车辆	3245±63	2135±26	0.646±0.056	1007±79	0.291±0.033
ɷ-Conotoxin GVIA	2751±35 *	2498±17.	0.892±0.111	1101±53	0.352 ± 0.045
正面皮质车辆	333±18	441±31	1.271±0.142	392 ± 22	1.075±0.057
ɷ-Conotoxin GVIA	221±21 *	531±83	2.419 ± 0.325	363±49.	1.627±0.238

数据显示为脑组织的ng/g。*p<0.05， **p<0.01

表2所示。大脑中5-羟色胺及其代谢物的浓度

	达	多奥波克	DOPAC / DA
纹状体的车辆	2602 ± 39	579±63	0.231±0.021
ɷ-Conotoxin GVIA	2158±72 * *	509±23.	0.214±0.022
正面皮质车辆	729 ± 21	489±319	0.656±0.039
ɷ-Conotoxin GVIA	579±77 *	399±19	0.741±0.009 * *

数据显示为脑组织的ng/g。*p<0.05， **p<0.01

讨论

感觉运动门控的缺陷导致许多神经精神障碍的表现。PPI是指在受到惊吓刺激前立即给予的弱强度预脉冲后，惊吓反射的减少；这是一种成熟的方法，用于评估感觉运动门控[4]。在临床人群中，大多数精神分裂症患者的PPI发生中断[5]。在过去十年中，使用神经解剖学、药理学、行为学、生物化学和遗传操作的实验研究有助于阐明PPI的神经回路[4]。这些发现也为以感觉运动门控中断为特征的几种形式的精神疾病的病理生理学提供了见解。作为理解Cav2.2介导的信号在感觉运动门控中的作用的第一步，本研究使用药理学、行为学和生物化学方法研究了这种关系。

本研究结果表明，注射ω-Conotoxin GVIA的小鼠出现了PPI缺失。已有研究表明，通过抑制多巴胺能[22,23]或5 -羟色胺能[24-26]信号或通过减少DA在前额皮质的传递[27-29]的操作，PPI被破坏。在本研究中，注射ω-Conotoxin GVIA的小鼠表现出明显降低DA水平，并显著增加DA在额叶皮层的转换。在使用Cav2.2阻滞剂的小鼠中，DA周转率(DOPAC/DA和HVA/DA)的增加可能伴随着DA水平的下降。无论如何，这些结果表明，注射ω-Conotoxin gvia的小鼠的额皮质回路中检测到的多巴胺能功能减退可能是观察到的PPI缺陷的原因。注射ω-Conotoxin gvia的小鼠纹状体中5-HT水平也降低。这与之前的一篇报道一致，即腹腔注射5- ht合成抑制剂对氯苯丙氨酸和微注射5- ht神经毒素5,7-二羟色胺到中缝背核和中核，消除了纹状体5- ht水平，破坏了PPI[30]。因此，纹状体中5-HT水平的降低也可能导致PPI缺陷。与对照相比，注射ω-Conotoxin GVIA的小鼠NE含量有降低趋势，但与注射ω-Conotoxin GVIA的小鼠NE含量无显著差异。

综上所述，本研究表明，特定的Cav2.2阻断剂ω-Conotoxin GVIA抑制Cav2.2介导的信号通路可导致感觉运动门控缺陷。多数精神分裂症患者存在感觉运动门控障碍。目前的研究结果表明，cav2.2介导的信号转导与多巴胺能和5 -羟色胺能系统之间存在显著的关系，这些系统可能是各种神经精神疾病表达的基础。这些结果与之前[21]的一项研究相似，该研究报告Cav2.2敲除小鼠表现出PPI缺陷以及DA和5-HT释放改变。因此，cav2.2介导的神经元回路异常可能参与了精神分裂症的基本病理生理机制。

的利益冲突

两位作者宣称没有相互竞争的利益。

作者的贡献　

WL和ET设计并指导了研究，并撰写了手稿。YZ和KN进行了行为和生化实验。所有作者阅读并批准了手稿的最终版本。

2021年版权燕麦。所有权利reserv

参考

1. 钙通道调节与突触前可塑性的关系。神经元59: 882-901. [Crossref］
2. Evans RM, Zamponi GW(2006)突触前Ca^2＋通道——神经元信号通路的整合中心。神经科学趋势29日:617 - 624。［Crossref］
3. Jarvis SE，Zamponi GW（2007）神经元电压门控钙通道的转运和调节。Curr Opin Cell Biol19日:474 - 482。［Crossref］
4. Braff DL, Geyer MA, Swerdlow NR(2001)休克前抑制的人体研究:正常人、患者组和药理学研究。精神药理学(Berl)156: 234 - 258。［Crossref］
5. Geyer MA, Krebs-Thomson K, Braff DL, Swerdlow NR(2001)精神分裂症感觉运动门控缺陷脉冲前抑制模型的药理学研究:十年综述。精神药理学(Berl）156: 117 - 154。［Crossref］
6. Herdon H, Nahorski SR(1989)二氢吡啶和?-conotoxin-sensitive calcium channels in mediating de极化-evoked endogenous多巴胺release from striatal slicesNaunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol340: 36-40。［Crossref］
7. Turner TJ, Adams ME, Dunlap K(1993)多重Ca^2＋通道类型共存以调节突触到染色体的神经递质释放。美国国立科学院科学研究所90：9518-9522。［Crossref］
8. Woodward JJ，Rezazadeh SM，Leslie SW（1988）突触体钙进入和内源性多巴胺释放对ω-芋螺毒素的差异敏感性。大脑Res475: 141 - 145。［Crossref］
9. Foehring RC（1996）5-羟色胺通过膜分隔的途径调节新皮质锥体神经元的N型和P型钙电流。神经生理学杂志75: 648 - 659。［Crossref］
10. Luebke Ji，Dunlap K，Turner TJ（1993）多钙通道类型控制海马谷氨酸突触突触传递。神经元11: 895-902. [Crossref］
11. Horne Al，Kemp Ja（1991）ω-conotoxin gvia对大鼠核心腺和海马内突触传递的影响。Br J杂志103: 1733 - 1739。［Crossref］
12. Wessler I，Dooley DJ，Werhand J，Schlemmer F（1990）钙通道拮抗剂（Omega-Conotoxin GVIA，NifeDipine，Verapamil）对来自神经丛，膈神经和Neocortex的电诱发释放[3H]乙酰胆碱的电诱发释放的差异效果大鼠。Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol341: 288 - 294。［Crossref］
13. Dooley DJ，Lupp A，Hertting G，Osswald H（1988）ω-芋螺毒素GVIA和海马去甲肾上腺素释放的药理学调节。欧语J药狼148: 261 - 267。［Crossref］
14. Chen Y，Lai M，Maeno-Hikichi Y，Zhang JF（2006）LIM结构域在形成PKCESILON-ANH-N型CA的基本作用^2＋海峡复合体。手机信号18: 215 - 224。［Crossref］
15. MIRNICS K，Middleton Fa，Marquez A，Lewis da，Levitt P（2000）分子表征精神分裂症的分子表征在前额叶皮质中基因表达的微阵列分析。神经元28：53-67。［Crossref］
16. Numakawa T，Yagasaki Y，Ishimoto T，Okada T，Suzuki T，et al.（2004）精神分裂症易感基因dysbindin新神经元功能的证据。哼摩尔麝猫13：2699-2708。［Crossref］
17. Talbot K, edem WL, Tinsley CL, Benson MA, Thompson EW, et al.(2004)精神分裂症患者海马结构中固有的谷氨酸末端dysbatin -1减少。中国投资113: 1353 - 1363。［Crossref］
18. 小仓H，古屋Y, Teramoto T, Niidome T, Nishizawa Y，等^2＋阻滞剂抑制刺激诱导的小鼠多动症。肽19: 1017-1022. [Crossref］
19. 周永强，韩玉英，戴飞，等。(2014)阻断cav2.1介导的NMDA受体信号通路对条状恐惧消退的影响。Behav大脑Res259: 45-49。［Crossref］
20. (2000)成年大鼠伏隔核多巴胺和血浆皮质酮应激反应增强，新生儿内侧前额叶皮质兴奋性损伤。神经科学96: 687 - 695。［Crossref］
21. Nakagawasai O, Onogi H, Mitazaki S, Sato A, Watanabe K, et al. (2010) n型Ca缺陷小鼠的行为和神经化学特征^2＋通道alpha1B亚基。Behav大脑Res208: 224 - 230。［Crossref］
22. Swerdlow NR, Braff DL, Geyer MA, Koob GF(1986)大鼠中枢多巴胺多动模拟精神分裂症患者的异常声惊吓反应。生物精神病学杂志21: 23-33. [Crossref］
23. Swerdlow NR、Shoemaker JM、Kuczenski R、Bongiovani MJ、Neary AC等（2006）大鼠前脑D1功能和感觉运动门控：D1阻断、额叶损伤和多巴胺去神经支配的影响。>列托人402:降价。［Crossref］
24. Kehne JH，Padich RA，McCloskey TC，Taylor VL，Schmidt CJ（1996）听觉和视觉感觉运动门控的5-HT调制：I.5-HT释放剂对Wistar大鼠声和光预脉冲抑制的影响。精神药理学(Berl)124: 95 - 106。［Crossref］
25. Padich RA, McCloskey TC, Kehne JH(1996)听觉和视觉感觉运动门控的5-HT调节:II。5-HT2A拮抗剂MDL 100,907对Wistar大鼠5-HT2A激动剂声光前脉冲抑制作用的影响精神药理学(Berl)124: 107 - 116。［Crossref］
26. Sipes TA, Geyer MA(1994)多种血清素受体亚型调节大鼠脉冲前抑制的惊吓反应。神经药理学33: 441 - 448。［Crossref］
27. Bubser M, Koch M(1994) 6-羟多巴胺损伤内侧前额叶皮质可减轻大鼠声惊吓反应的脉冲前抑制。精神药理学113：487-492。［Crossref］
28. (1)多巴胺在脑内前额叶皮层中的作用。神经科学75: 535-542. [Crossref］
29. KOCH M，Bubser M（1994）在大鼠内侧前额叶皮质的6-羟基二胺损伤后缺乏感觉传感器，由Haloperidol反转。EUR J Neurosci.6: 1837-1845. [Crossref］
30. Fletcher PJ, Selhi ZF, Azampanah A, Sills TL(2001)脑5 -羟色胺活性的降低破坏了声惊吓反射的脉冲前抑制:5,7-二羟色胺和对氯苯丙氨酸的影响。神经精神药理学24: 399 - 409。［Crossref］