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摘要

尿毒症的治疗目前以透析为主，在某些情况下，患者接受透析治疗数十年，但总体结果令人失望。许多研究已经证实了一些与尿毒症发病机制相关的实验见解，但尿毒症的特异性生物标志物尚未完全阐明。本研究共收集尿毒症患者15例，健康对照15例。本研究的目的是解释尿毒症的病因，利用MHC基因捕获技术、hmedip芯片、T-UCR芯片和生物信息学分析对尿毒症和正常对照组进行研究。结果显示MHC片段有8个CpG甲基化富集。我们在lncRNA的CpG启动子中发现1个SNP，在chr6: 28890951-28892013中发现1个SNP，在CpG chr6:29521110-29521833中发现1个SNP，在CpG chr6:30684836-30685503中发现1个SNP。尿毒症患者未发现CpG甲基化对应基因的免疫相关过程GO项和KEGG通路富集。本实验未在MHC片段中发现T-UCR。T-UCR对应基因未发现显著的免疫相关过程GO项和KEGG通路富集。对该基因的SNP (rs2301754、rs11545587、rs17184255、rs4713354)和外周血淋巴细胞的表达分析表明，这些SNP与尿毒症的发生有关。 Future studies should examine the roles of these SNP in the pathogenesis of uremia. Integrative analysis technology provided an expansive view of molecular signaling pathways in uremia.

关键字

主要组织相容性复合体，甲基化，尿毒症，转录超保守区域

介绍

尿毒症是指慢性肾脏病患者肾功能退化时发生的一种疾病。慢性肾脏疾病是指肾功能的进行性丧失，其晚期尿毒症，肾脏功能很少或没有，需要移植或透析[1]。在疾病的所有阶段，特别是尿毒症患者，心血管疾病的死亡率比一般人群高出许多倍。尽管研究深入，但尿毒症表型的病理机制仍不完全清楚，可能是多因素的。遗传和环境因素都与尿毒症表型有关，但这些因素并不能完全解释尿毒症表型的发生。我们仍然鼓励进一步的研究来揭示尿毒症及其易感基因之间的真正联系。在这方面应研究新的方法。

使用预测性生物信息学算法，Mantila Roosa等．建立了基因表达的线性模型，并确定了44个转录因子结合基序和29个miRNA结合位点，这些位点被预测在整个时间过程中调节基因表达。已知的和新的转录因子结合基序在整个时间过程中被确定，以及几个新的miRNA结合位点。这些时间依赖性的调节机制在控制负荷诱导的骨形成过程中可能是重要的[2]。这种综合的生物信息学分析方法在我们的研究中是值得探索的。MHC和尿毒症之间的联系尚不清楚。进一步的调查可能会揭示MHC在尿毒症中的作用。我们有兴趣研究MHC、CpG甲基化和T-UCR，作为更好地理解尿毒症基因表达调控的第一步。我们从MHC、CpG甲基化和T-UCR数据集的综合生物信息学分析中报告了尿毒症的广泛观点。

材料与方法

人类被试

30名受试者参加了这项研究，其中包括15名接受透析治疗的尿毒症患者和15名健康志愿者。所有尿毒症患者均来自181医院肾内科住院病房，无活动性感染、糖尿病和自身免疫性疾病。

获得所有受试者或其监护人的书面知情同意。当地伦理委员会批准了该研究，并在所有参与者知情同意的情况下获得外周血样本。本研究遵守关于涉及人体受试者的医学研究伦理原则的赫尔辛基宣言。

MHC基因捕获

从外周血样本中分离基因组DNA。根据MHC基因组序列，设计完全互补的探针，固定在支架上，与探针接头偶联后应用于基因组DNA。洗去未杂交的探针;然后，洗脱与DNA杂交的探针，直接建立DNA测序文库(Hiseq 2000高通量测序)。基于NimbleGen SeqCap EZ Choice Library的MHC区域捕获技术，可实现人类MHC区域的深度测序覆盖。数据分析采用卡方检验，叶氏连续性校正。

hMeDIP-chip

使用dnasy血液和组织试剂盒(Qiagen, Fremont, CA)提取基因组DNA。用小鼠单克隆抗体免疫沉淀一微克超声基因组DNA。对于DNA标记，按照NimbleGen hmedip芯片协议(NimbleGen Systems, Inc.， Madison, WI, USA)中详细说明的制造商指南使用NimbleGen双色DNA标记试剂盒。微阵列在Nimblegen杂交缓冲液/杂交成分A中杂交(杂交系统- Nimblegen Systems, Inc.， Madison, WI, USA)。阵列杂交采用Roche NimbleGen’s Promoter + CpG Island array。

T-UCR芯片分析

根据Agilent单色微阵列基因表达分析方案(Agilent Technology)进行RNA标记和阵列杂交，并进行少量修改。使用Agilent DNA微阵列扫描仪(部件号G2505C)清洗、固定和扫描杂交阵列。使用Agilent Feature Extraction软件(版本11.0.1.1)对采集到的阵列图像进行分析。使用genesspring GX v12.1软件包(Agilent Technologies)进行分位数归一化和后续数据处理。

生物信息学分析

MHC片段CpG甲基化富集及差异富集分析:MHC基因捕获测序片段为chr6:30146860-33375560。为了寻找富集位置，我们分析了MHC片段的CpG峰。

T-UCR在MHC片段中的表达

为了寻找转录本位置，我们分析了T-UCR在MHC片段中的表达。

CpG甲基化水平和T-UCR表达水平在免疫过程中的作用:我们分析了所有甲基化的CpG、T-UCR及其对应的基因。然后对免疫过程中的相关基因进行了分析。在本实验中，为了进一步了解基因的功能，我们使用了在线基因本体工具EASE(http://david.abcc.ncifcrf.gov/ease/ease1.htm)。在生物学过程中对差异表达基因进行分类。通过web-accessible的DAVID注释系统进行基因的GO和KEGG通路定位。

MHC突变与CpG甲基化的相关性

为了寻找相关性，我们计算了差异CpG甲基化、MHC突变的数据，并分析了相关系数。

结果

捕获MHC区域的基因数量和SNP位点

与正常对照相比，我们通过MHC基因捕获和高通量测序获得170个基因和27,454个snp。

hMeDIP-chip:与正常对照相比，患者CpG岛4063个基因的甲基化水平有显著差异。

T-UCR芯片分析:为了识别潜在的差异表达的t - ucr，我们在患者中进行了与正常对照相比的倍增变化过滤。从Refseq、UCSC knowngenes和Ensembl等权威数据库中收集到119个潜在的t - ucr。

MHC段CpG峰值

为了寻找富集位置，我们分析了MHC片段的CpG峰。结果显示16个CpG甲基化富集(表1)，其中尿毒症8个，正常对照8个。

CpG名称(hg19)	长度(bp)	控制	尿毒症	基因名字	类型
chr6:30038881 - 30039477	596		1	NCRNA00171	启动子
chr6:30095173 - 30095610	437		1	TRIM40	启动子
chr6:32046815 - 32047094	279		1	TNXB	基因内
chr6:32163292 - 32164383	1091		1	PBX2	启动子
chr6:32163292 - 32164383	1091		1	GPSM3	启动子
chr6:32847498 - 32847846	348		1	PPP1R2P1	基因内
chr6:33266302 - 33267582	1280		1	RGL2	启动子
chr6:33266302 - 33267582	1280		1	WDR46	启动子
chr6:28890951 - 28892013	1062	1		TRIM27	启动子
chr6:29521110 - 29521833	723	1		克服各种	基因内
chr6:30684836 - 30685503	667	1		MDC1	启动子
chr6:30684836 - 30685503	667	1		TUBB	启动子
chr6:31795467 - 31797384	1917	1		SNORD48	启动子
chr6:31795467 - 31797384	1917	1		HSPA1B	启动子
chr6:31795467 - 31797384	1917	1		C6orf48	启动子
chr6:31795467 - 31797384	1917	1		SNORD52	启动子

表1。MHC段CpG甲基化富集

T-UCR在MHC片段中的表达

在本研究中，我们分析了所有T-UCR的表达，但在MHC片段中未发现UCR重叠基因和UCR近端基因。

CpG甲基化水平在免疫过程中的作用在本实验中，我们使用DAVID基因注释工具对CpG甲基化对应基因进行GO方案的注释。这些基因在尿毒症中共产生55个氧化石墨烯项(表2)，免疫相关过程中的氧化石墨烯项如GO:0006955免疫反应未发现显著富集。

去的术语	基因数	P值	罗斯福
去:0006350 ~转录	378	8.17 e-12	1.52 e-08
GO:0006355~转录调控，DNA- 依赖	316	2.29 e-09	4.25 e-06
GO:0051252~ RNA代谢过程调控	321	3.44 e-09	6.39 e-06
GO:0045449~转录调控	436	4.54 e-09	8.43 e-06
去:0007409 ~ axonogenesis	55	3.41 e-08	6.32 e-05
去:0030182 ~神经元分化	99	5.71 e-08	1.06 e-04
GO:0000904~参与分化的细胞形态发生	64	7.04 e-08	1.31 e-04
[qh]:0048667~参与神经元分化的细胞形态发生	57	9.74 e-08	1.81 e-04
RNA聚合酶II启动子的转录调控	145	1.85 e-07	3.44 e-04
GO:0048812~神经元投射形态发生	56	4.70 e-07	8.72 e-04
去:0048666 ~神经元的发展	77	1.62 e-06	0.003011
GO:0006355~转录调控，dna依赖性	61	4.61 e-06	0.008556
GO:0051252~ RNA代谢过程调控	60	9.58 e-06	0.017786
GO:0045449~转录调控	58	1.00 e-05	0.018585
去:0007409 ~ axonogenesis	61	1.83 e-05	0.034300
去:0030182 ~神经元分化	76	2.01 e-05	0.037274
GO:0000904~参与分化的细胞形态发生	36	2.52 e-05	0.046809
[qh]:0048667~参与神经元分化的细胞形态发生	39	5.75 e-05	0.106653
RNA聚合酶II启动子的转录调控	30.	9.17 e-05	0.170063
GO:0048812~神经元投射形态发生	80	9.86 e-05	0.182883
去:0048666 ~神经元的发展	75	1.12 e-04	0.208311
GO:0031175~神经元投射发育	46	1.31 e-04	0.242746
GO:0032990~细胞部分形态发生	68	1.90 e-04	0.351983
GO:0048858~细胞投射形态发生	114	2.21 e-04	0.409970
GO:0007389~图案规范流程	68	2.49 e-04	0.461054
去:0000902 ~细胞形态发生	106	2.85 e-04	0.528252
GO:0007156~亲同性细胞粘附	71	3.38 e-04	0.625256
去:0030900 ~前脑的发展	116	3.41 e-04	0.630759
GO:0006355~转录调控，dna依赖性	105	3.58 e-04	0.662752
GO:0051252~ RNA代谢过程调控	103	3.80 e-04	0.703840
GO:0045449~转录调控	106	3.93 e-04	0.727092
去:0007409 ~ axonogenesis	87	4.04 e-04	0.746483
去:0030182 ~神经元分化	73	4.18 e-04	0.772374
GO:0000904~参与分化的细胞形态发生	103	4.68 e-04	0.864433
[qh]:0048667~参与神经元分化的细胞形态发生	60	4.69 e-04	0.866098
RNA聚合酶II启动子的转录调控	71	5.54 e-04	1.022866
GO:0048812~神经元投射形态发生	93	6.35 e-04	1.171092
去:0048666 ~神经元的发展	60	6.70 e-04	1.236425
GO:0031175~神经元投射发育	94	7.01 e-04	1.293726
GO:0032990~细胞部分形态发生	95	7.33 e-04	1.351237
GO:0048858~细胞投射形态发生	99	8.20 e-04	1.510345
GO:0007389~图案规范流程	115	9.05 e-04	1.666747
去:0000902 ~细胞形态发生	56	0.001007	1.853066
GO:0007156~亲同性细胞粘附	33	0.001143	2.099637
去:0030900 ~前脑的发展	87	0.001209	2.220594
去:0007411 ~轴突的指导	126	0.001287	2.362594
GO:0032989~细胞组分形态学	87	0.001377	2.525408
GO:0030030~细胞投影组织	118	0.001636	2.992538
去:0003002 ~区域化	60	0.001677	3.066779
[au:]脊索动物胚胎发育	87	0.001789	3.269362
GO:0045935~正调控核碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢过程	30.	0.001931	3.523561
GO:0009792~胚胎发育结束于出生或卵孵化	53	0.002101	3.828081
去:0016192 ~ vesicle-mediated运输	12	0.002437	4.427231
GO:0045892~转录负调控，dna依赖性	12	0.002437	4.427231
GO:0051173~正调控氮化合物代谢过程	118	0.002722	4.933267

表2。CpG甲基化相应的基因在尿毒症中注释GO术语。

注:如果p值<0.005，则认为显著。一组预测的错误发现率(FDR)是该预测集中错误预测的预期百分比。与此同时，FDR<5%可能相当有意义。

此外，我们获得了尿毒症基因的4条KEGG通路(表3)，免疫相关过程KEGG通路未显著富集。

通路	基因数	P值	罗斯福
hsa04012:ErbB信号通路	24	3.41 e-04	0.418186
hsa05220:慢性髓性白血病	20.	0.001899	2.308109
hsa04144:内吞作用	38	0.002299	2.787276
hsa05214:神经胶质瘤	17	0.004113	4.936479

表3。尿毒症中CpG甲基化对应基因注释KEGG通路。

注:如果p值<0.005，则认为显著。一组预测的错误发现率(FDR)是该预测集中错误预测的预期百分比。与此同时，FDR<5%可能相当有意义。

T-UCR表达水平在免疫过程中的作用:在本实验中，我们使用DAVID基因注释工具用GO方案对T-UCR对应的基因进行注释。这些基因在尿毒症中共产生52个氧化石墨烯项(表4)，免疫相关过程氧化石墨烯项未发现显著富集。此外，我们未获得SLE中相关基因的免疫相关过程KEGG通路。它们并没有明显富集。

去的术语	基因数	P值	罗斯福
GO:0045449~转录调控	240	8.45 e-14	1.52平台以及
GO:0051252~ RNA代谢过程调控	176	1.11 e-11	1.99 e-08
去:0006350 ~转录	191	3.49平台以及	6.27 e-07
RNA聚合酶II启动子的转录调控	87	4.20平台以及	7.54 e-07
GO:0006355~转录调控，DNA- 依赖	167	5.03平台以及	9.05 e-07
去:0003002 ~区域化	35	1.59 e-08	2.85 e-05
GO:0045941~转录正调控	66	1.74 e-07	3.13 e-04
GO:0045935~正调控核碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢过程	70	3.44 e-07	6.17 e-04
GO:0010628~基因表达的正向调控	66	5.15 e-07	9.25 e-04
GO:0051173~正调控氮化合物代谢过程	71	5.44 e-07	9.78 e-04
GO:0016071~mRNA代谢过程	48	6.14 e-07	0.001104
去:0048598 ~胚胎形态发生	42	8.78 e-07	0.001579
GO:0051254~正调控RNA代谢过程	57	9.23 e-07	0.001659
去:0006397 ~ mRNA加工	43	1.12 e-06	0.002013
GO:0007389~图案规范流程	38	1.22 e-06	0.002200
去:0006396 ~ RNA加工	62	1.30 e-06	0.002335
RNA聚合酶II启动子转录的正调控	47	1.60 e-06	0.002875
GO:0045893~转录阳性调控，dna依赖性	56	1.60 e-06	0.002876
胚胎骨骼系统发育	18	2.01 e-06	0.003616
去:0008380 ~ RNA拼接	39	2.10 e-06	0.003773
GO:0009952~前/后模式形成	25	2.31 e-06	0.004161
细胞生物合成过程的正调控	72	2.61 e-06	0.004690
胚胎器官形态发生	24	3.21 e-06	0.005772
高分子生物合成过程的正调控	69	3.84 e-06	0.006907
GO:0009891~生物合成过程正调控	72	4.37 e-06	0.007853
细胞生物合成过程的负调控	61	6.09 e-06	0.010950
大分子代谢过程的正调控	83	9.65 e-06	0.017339
胚胎器官发育	27	9.77 e-06	0.017567
去:0030900 ~前脑的发展	25	1.01 e-05	0.018085
高分子生物合成过程的负调控	59	1.13 e-05	0.020368
GO:0009890~生物合成过程负调控	61	1.17 e-05	0.021059
大分子代谢过程的负调控	72	2.79 e-05	0.050223
GO:0001501~骨骼系统开发	39	3.18 e-05	0.057209
GO:0010629~基因表达负调控	53	6.67 e-05	0.119750
去:0021537 ~端脑的发展	14	9.53 e-05	0.171182
氮化合物代谢过程的负调控	52	2.63 e-04	0.470982
去:0021543 ~大脑皮层发育	11	2.97 e-04	0.531764
GO:0016481~转录负调控	47	3.37 e-04	0.603146
负调控核碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢过程	51	3.48 e-04	0.623182
GO:0051253~ RNA代谢过程的负调控	39	4.47 e-04	0.800670
胚胎骨骼系统形态发生	12	4.50 e-04	1.142592
GO:0045892~转录负调控，dna依赖性	38	6.39 e-04	1.268796
去:0030902 ~后脑的发展	12	7.10 e-04	1.636420
GO:0048705~骨骼系统形态发生	17	9.18 e-04	2.027251
RNA聚合酶II启动子转录负调控	30.	0.001139	2.820892
去:0007411 ~轴突的指导	16	0.001591	3.154926
胚胎肢体形态发生	14	0.001782	3.154926
GO:0035113~胚胎附属物形态发生	14	0.001782	3.206449
GO:0009954~近端/远端模式形成	7	0.001812	4.553220
GO:0009953~背部/腹部图案形成	11	0.002589	4.620857
GO:0051051~负调节运输	18	0.002629	4.877394
GO:0045665~神经元分化负调控	8	0.002778	4.825061

表4。T-UCR对应的基因注释了尿毒症中的GO术语。

注:如果p值<0.005，则认为显著。一组预测的错误发现率(FDR)是该预测集中错误预测的预期百分比。与此同时，FDR<5%可能相当有意义。

MHC突变与CpG甲基化的相关性:在本实验中，我们在lncRNA的CpG启动子中发现1个SNP，在chr6: 28890951-28892013中发现1个SNP，在CpG chr6:29521110-29521833中发现1个SNP，在CpG chr6:30684836-30685503中发现1个SNP(表5)。

染色体片段	单核苷酸多态性	基因	函数
chr6: 30039098	rs2301754	RNF3	其实
chr6: 28891522	rs11545587	TRIM27	版权所有OAT。版权所有 UTR5
chr6: 29521289	rs17184255	LOC100507362	基因间的
chr6: 30685420	Rs4713354	MDC1	UTR5

表5所示。尿毒症MHC片段的4个CpG甲基化snp

讨论

第一个在尿毒症发病机制中被确定为重要的遗传因素是6号染色体上的MHC。现在人们普遍认为MHC基因构成了尿毒症遗传易感性的一部分。先前对尿毒症的研究缺乏统计能力和遗传分辨率，无法完全确定MHC的影响。在本研究中，我们试图通过MHC基因捕获技术、hmedip芯片、T-UCR芯片和生物信息学分析相结合的新方法，鉴定MHC、CpG甲基化和T-UCR，并揭示其在尿毒症中的潜在机制。检测到可能与尿毒症相关的显著差异snp 27454个。此外，在本研究中，我们整合了数据集并确定了尿毒症中4个最重要的snp。我们计划对这些snp的功能进行研究。

据报道，H3K4me3在尿毒症患者中发生改变，而在健康人群中没有改变[3]。他们的研究结果表明，H3K9三甲基化参与非生生性尿毒症环境，这些新的候选基因可能成为潜在的生物标志物或未来的治疗靶点[4]。表观遗传事件在T淋巴细胞的启动、分化和亚群确定中起着核心作用。CpG-DNA甲基化和组蛋白尾部的翻译后修饰是两种最被广泛接受的表观遗传机制。更好地了解导致表观遗传改变和随后的免疫失衡的分子事件对于建立疾病生物标志物和确定潜在的治疗靶点至关重要。这些发现可能有助于选择更好的靶分子进行进一步的研究。我们的研究也可能有助于提出新的途径，以更集中的方法在蛋白质水平上进行研究，并调查临床意义。

长链非编码rna (Long non-coding rna, lncRNAs)是长度超过200个核苷酸的转录本，很少或没有蛋白质编码能力[5]。越来越多的证据表明，lncrna在发育过程中发挥重要作用，并与许多人类疾病(如癌症、阿尔茨海默病和心脏病)有关。T-UCR转录本是一类从超保守区(ucr)转录的新型lncrna。ucr是一类位于基因组内和基因间区域的481个非编码序列。ucr在人类、大鼠和小鼠基因组的同源区域之间是绝对保守的(100%)，并且是积极转录的。最近在癌症系统中已经证明，差异表达的t - ucr可以改变恶性细胞的功能特征。最近的数据表明，在人类肿瘤发生过程中，t - ucr在转录水平上发生改变，异常的t - ucr表达谱可用于区分人类癌症类型[6,7]。研究人员观察到，DNA低甲基化诱导癌细胞释放T-UCR沉默。对大量原发人类肿瘤的分析表明，所描述的T-UCR CpG岛的高甲基化是各种肿瘤类型中常见的事件[8]。然而，在我们的研究中，我们整合了MHC和T-UCR数据集。 We examined the expression levels of T-UCR in MHC segment by T-UCR microarray. We annotated T-UCR corresponding gene by DAVID gene annotation tool. The immune correlated process GO term and KEGG pathway wasn’t found significant enrichment. T-UCR expression levels were not correlated with commonly used clinicopathological features of uremia.

结论

综上所述，我们在尿毒症中发现了4个最重要的snp (rs2301754, rs11545587, rs17184255, rs4713354)。我们的工作表明MHC片段的snp是潜在的生物标志物和可能参与尿毒症发病的因素。然而，需要进一步研究该基因的多态性导致尿毒症的机制。结合多个测量平面的一个主要优点是能够在单一维度中剖析不明显的机制。整合MHC、CpG甲基化和T-UCR数据集是了解尿毒症生物学的有力策略。我们的研究结果证明了异常调节snp对尿毒症异常的潜在贡献，可以帮助我们构建尿毒症的产前诊断生物标志物，以及在治疗尿毒症个体时获得新的治疗靶点。此外，我们对snp的研究可能会发现治疗和预防其他疾病的新方法。

致谢

作者感谢参与这项研究的尿毒症患者和健康志愿者。本工作由深圳市屏山市卫生系统研究项目(no. 5502)资助。201417)和平山医药健康发展孵化基金(no.201317)，生物信息学分析由上海百树生物科技有限公司，中国上海进行。

信息披露

本文作者没有任何利益冲突需要披露。

• Ingrosso D, Perna AF(2009)高同型半胱氨酸血症状态的表观遗传学。特别关注尿毒症。生物化学与生物物理学报1790: 892 - 899。(Crossref］
• Mantila Roosa SM, Turner CH, Liu Y(2012)骨力学载荷后的调节机制。基因调控系统生物学6:利润率达到。(Crossref］
• 张丽，戴艳，王丽，彭伟，张艳，等。(2011)尿毒症患者外周血单核细胞组蛋白H3赖氨酸4三甲基化的CpG阵列分析。DNA与细胞生物学30: 179 - 186。(Crossref］
• 隋伟，何红，闫强，陈健，张锐，等。(2013)尿毒症患者外周血单核细胞组蛋白H3赖氨酸9三甲基化的ChIP-seq全基因组分析。Hemodial Int17: 493 - 501。(Crossref］
• 闫波，陶志峰，李晓明，张宏，姚健，等。(2014)长链非编码rna在早期糖尿病视网膜病变中的异常表达。投资眼科视觉科学55岁:941 - 51。(Crossref］
• 彭锦江，沈杰，冉志华(2013)人类癌症转录超保守区。RNA生物10(12): 1771 - 7。(Crossref］
• Sana J, Hankeova S, Svoboda M, Kiss I, Vyzula R，等。(2012)转录的超保守区表达水平[J]。73和uc。388are altered in colorectal cancer.肿瘤学82: 114 - 8。(Crossref］
• Lujambio A, Portela A, Liz J, Melo SA, Rossi S等。(2010)人类癌症中超保守区域转录的非编码rna的CpG岛高甲基化相关沉默。致癌基因29日:6390 - 401。(Crossref］