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摘要

本研究的目的是评估和解释发生在鳞状细胞喉癌中的分子变化之间的关系。此外，我们还揭示了FHIT基因应答在鳞状细胞喉癌发生和发展中的作用，以及基于基因的外显子7、8和9在肿瘤分期和组织病理学分级中的作用。本研究采用50份血液样本作为对照，26例喉部鳞状细胞癌患者作为对照。简而言之，我们主要研究或评价FHIT基因外显子7外显子(C/T)、8外显子(T/C)和9外显子(A/G)纯合子缺失。采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和基于RT-PCR的人力资源管理技术检测突变。在HRM分析结束时，观察到患者组中有显著的突变。根据人力资源管理的结果，L4和L19在数量和结果之前被认定为良性的SSCP个体。在本研究中，我们观察了健康个体和鳞状细胞喉癌个体间的第7、9外显子突变是否存在差异。病例的病理表现为低分化。但除上述发现外，目前的研究结果强调，FHIT基因部分与喉部鳞状细胞癌分析靶点相关。 According to results of analyses, we idendified a link in between the exon 8 and exon 9 of FHIT gene.

关键字

FHIT基因，鳞状细胞癌，PCR-SSCP, HRM

缩写

SCC:鳞状细胞癌;PCR-SSCP:聚合酶链反应-单链构象多态性;人力资源管理:高分辨率融化。

介绍

鳞状细胞癌(SCC)占所有头颈部癌症的60%以上。在土耳其，头颈部鳞状细胞癌约占所有恶性肿瘤的4%[1]。由于多种特定的遗传靶点及其与癌症相关的改变已经被确定，因此有可能使用复杂和敏感的分子检测方法在肿瘤进展的早期发现这些异常。通过检测进展周期的早期变化，临床医生可能能够在当前治疗方案可能更容易治愈的时候治疗患者。绝大多数肿瘤为鳞状细胞癌[2]。由于喉部的重要生理功能，晚期喉部病变与患者显著的发病率和死亡率相关，并增加了社会的经济成本。此外，疾病可及早发现，现有设施的治疗可提供长寿命的机会。在疾病晚期，患者的生存机会降低，需要更激进的治疗方法[4-6]。在我国进行的流行病学研究发现平均年龄为55-59[7]。喉癌的分子基础最近被研究。 Larynx cancers transformation of normal cells into cancer cells requires a multistage process. Tumor suppressor genes are normal genes that slow down cell division, repair DNA mistakes, or tell cells when to die (a process known as apoptosis or programmed cell death). When tumor suppressor genes don't work properly, cells can grow out of control, which can lead to cancer. FHIT (Fragile Histidine Triad Gene) was recently attracted attention in the genetic changes. DNA replication and cell cycle control play a role in protein-encoding gene is a tumor suppressor [7]. Through investigation of homozygous deletions in common human cancers, including lung cancer, The FHIT gene at the common fragile site at chromosome band 3p14.2 [8]. The results of the investigation of human tumors indicate that the FHIT gene is altered by mutations, predominantly deletions, in human cancer and that such alterations are common in epithelial cancers, particularly those resulting from exposure to environmental carcinogens, such as lung, larynx, head and neck, esophageal, stomach, pancreatic, and cervical cancer [9]. The FHIT, that is inactivated in epithelial tumors, particularly in tumors resulting from exposure to environmental carcinogens. In some tumors, particularly those associated with environmental carcinogens, alterations in the FHIT gene occur quite early in the development of cancer [10,11]. The purpose of this study, in the formation and progression of laryngeal squamous cell carcinoma reveal the role of FHIT gene, as well as the relationship between molecular changes occurring to explain. Because FHIT gene encodes carcinogen induced damage can lead to deletions.

材料和方法

这项研究包括26例(3女性和男性23日)申请Cumhuriyet耳朵鼻子和喉咙大学与喉癌的诊断癌症之间没有明显的颈部节点2009 - 2011年土耳其和健康志愿者和他们签署知情同意和病人的肿瘤组织在外围控制任何家庭历史纳入50例无疾病健康者静脉血。

基因组DNA分离

福尔马林固定和石蜡包埋的组织取自土耳其希瓦斯市Cumhuriyet大学病理学系的档案。所有患者的代表性染色切片由经验丰富的病理学家进行组织病理学检查。所有选择提取的肿瘤样本均含有大部分肿瘤细胞。从连续的无染色切片中提取配对肿瘤及其相应正常组织的基因组DNA。

用于多态分析的DNA采用核酸分离试剂盒(德国Oiagen)厂家说明书购买的DNA分离试剂盒从癌症患者活检标本中分离。分离的DNA -20℃保存至使用。对照组由没有癌症或其他慢性疾病病史的健康的、不相关的志愿者组成。所有患者和对照组均为土耳其人。

聚合酶链反应扩增FHIT基因

用于聚合酶链反应（PCR）应用（土耳其生物技术研究实验室，H.C.V.博士），增加每个样本提取DNA的浓度，以找出产生良好扩增产物的最佳剂量。使用根据Risinger等人设计的引物扩增FHIT基因的外显子7、8和外显子9．［12］.所选外显子的每对引物进行FHIT突变检测，然后进行单链构象多态性PCR (PCR- sscp)。Tm值或退火Tm和引物(表1)

FHIT外显子如下:用5 μl 10XPCR Taq缓冲液(pH 8.8)和2 mM MgCl混合扩增4µl喉组织基因组DNA₂，每个10 mM dNTPs (dGTP, dATP, dTTP, dCTP)，每个引物0.5 mM, 0.3 U DreamTaq聚合酶(Advanced biotechnology Ltd.， Fermantase Life Science)。外显子7,8,9经聚合酶链反应扩增;最初在95°C 4分钟变性,变性在95°C 15秒,退火Tm 57岁,5°C 30秒,扩展在72°C 20秒,35周期和最终在72°C扩展4分钟。PCR是基因组DNA从全血中提取并使用合适的引物扩增parafine-embedded组织样本这些位点。

FHIT基因突变分析

PCR引物:FHIT基因的7,8,9外显子进行突变分析。PCR所用的寡核苷酸引物取自ATQ-GenBank (Giagen Firm, GERMANY)。这些外显子的序列和退火温度列于表1。

表1。这些外显子的序列和退火温度

轨迹	底漆	Tm	PCR产物
FHIT-exon 7	正向5'-TGGTCCATGATACTATAATTAAACA-3' 反向3 ' -TTACGGCTCTAACACTGAGGGTCTCTCTGA-5 '	60°C	304个基点
FHIT-exon 8	提出5“-GAGTAATTGGGCTTCATGAGAGCATCACT-3” 反向3 ' - AGGTTGATGTCATCCCACCGACAGT -5 '	63摄氏度	224个基点
FHIT-exon 9	正向5'-TTCTCCAAGCTCCAGAAACATGACAAGGA-3' 反向3 ' - GTCTTTACCTGTGTCACTGAAAGTAGACCC-5 '	58.5°C	119bp

SSCP分析

如前所述进行8%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Rohr et al.，2005;背后et al ., 1999)。简而言之，3 mL 40%丙烯酰胺溶液，3 mL 5XTBE溶液，3 mL 50%甘油，6 mL ddH₂O、10%预硫酸铵75 μL、TEMED 7 μL充分掺入凝胶中，室温混凝土1h。4 μL PCR产物与6 μL甲酰胺样品混合。离心15 s, 95℃变性^oC 10min，冰浴10min，置于8%中性聚丙烯酰胺凝胶上，用1XTBE缓冲液在300V下电泳8h。将固定液注入扁平器具中，将凝胶浸入其中，振动10min，并用ddH洗涤3次（每次2min）₂O.将凝胶浸入染色液中，振动10分钟，用ddH洗涤3次(每次20 s)₂O.然后将凝胶浸入显示溶液中，振动直到样本信号变成棕色，背景变成透明黄色，然后用自来水冲洗，停止显示。观察染色结果并拍照。根据基因组DNA的PCR-SSCP结果，单链条数和电泳转移位置的差异，即迁移移位，认为PCR-SSCP阳性。

高分辨率熔化(HRM)和数据分析

在这种情况下，我们建议扩展人力资源管理分析，使用序列匹配和基因型自动调用功能，以识别DNA的相似性和差异性，这些功能利用扩增子熔化曲线的变化，可以有两种形式:熔体温度的变化和熔体曲线形状的明显差异。人力资源管理分析允许序列匹配和基因型自动调用的未知样本与适当的参考。结果可以被视为标准化熔体图、差异图和带有置信值(%)的自动调用基因型。归一化是根据曲线移动(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)来选择合适的样本和分析范围，并以不同基因型的基本表征为基础。不同的图有助于视觉解释。

人力资源管理的结果和回顾

HRM分析结果，对突变患者组进行DNA序列分析，进行突变鉴定。对从患者喉癌组织中获得的基因型分布情况进行统计评价，以判断该基因是否发生了改变。人力资源管理实验生成的DNA熔体曲线具有足够的特异性和敏感性，可以根据微小的序列差异来区分核酸种类，使之发生突变。熔化温度变化和曲线形状都可以用来识别序列差异。纯合子等位基因/序列变异的典型特征是在HRM熔体曲线中观察到的温度(x轴)偏移，而杂合子通常的特征是由碱基对不匹配产生的熔化曲线形状的变化，这是一些野生型和变异链之间不稳定的异质双工退火的结果。人力资源管理数据通常被绘制成差异曲线，以在视觉上放大同一基因型内不同集群熔体剖面之间的差异。HRM分析结果，对突变患者组进行DNA序列分析，进行突变鉴定。对从患者喉癌组织中获得的基因型分布情况进行统计评价，以判断该基因是否发生了改变。每次检测后对76份样品进行实时荧光定量PCR和HRM分析。 The results of the HRM analysis of the Sybr GreenER assay are shown in (Figures 1-8). The Sybr GreenER assay exhibits a melting pattern that begins its separation at approximately 77°C and ends at approximately 80.5°C. In this HRM study, 50 blood samples were used as controls. Larynx cancer, treated samples from 26 individuals were used. These examples has been studied in 7,8 and 9 exons of FHIT in the sense of mutation.

图1所示。所有样本中FHIT基因外显子7的直接可视化HRM分析（对照和癌症病例）

图2。FHIT基因外显子7融合曲线分析的一般筛选

图3。所有样本中FHIT基因外显子9的直接可视化HRM分析

图4。FHIT基因第9外显子熔化曲线分析的一般筛选

图5。FHIT基因外显子8在突变个体和健康个体中的直接可视化HRM分析(L:突变个体K:健康个体)

图6。FHIT基因序列8外显子熔化曲线分析的一般筛选(L:突变个体，K:健康个体)

图7。FHIT基因外显子8在正常个体和健康个体中的直接可视化HRM分析(L:正常个体K:健康个体)

图8。贝宁与健康人FHIT基因序列第8外显子熔化曲线分析的一般筛选(L:贝宁人，K:健康人)

在外显子8中:在8号外显子中，26个样本(L8 ve L11)中有2个样本(L8 ve L11)突变，3个样本(L4、L19、L20)良性，其他样本中未观察到差异。表现出温和的人:L19, L20和L4

L4 ve L19个体数量、SSCP结果和之前由HRM进行的结果均被确定为良性。在这项研究中，我们发现有这么多个体的HRM是良性的。

结果和讨论ı

引起喉癌发生的分子事件，特别是喉癌发生，还没有很好的特征。原癌基因似乎是危险因素(吸烟、酗酒、电离辐射和人类乳头瘤病毒感染)的目标，这些因素通常被认为与喉部鳞状细胞癌有关。一些肿瘤抑制基因已被证明在人类肿瘤中发挥重要作用，包括头颈部肿瘤。头颈部癌症包括源自上空气-消化道不同解剖部位的恶性肿瘤。头颈部肿瘤以组织学的异质性为特征。大多数由鳞状细胞上皮引起的癌是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)，而其他可能发生在头颈部的癌症类型包括甲状腺癌、恶性涎腺肿瘤、淋巴瘤和肉瘤。HNSCC包括口腔癌、喉癌、咽癌(口咽癌、下咽癌、鼻咽癌)和食道癌[13-19]。关于FHIT在头颈部肿瘤中的作用的报道并不统一[8,20,21,22]。染色体3p区缺失是早期常见的遗传事件HNSCC23日,24日,25日。常见的3p基因改变HNSCC和OSCC含有肿瘤抑制基因脆弱组氨酸三联体(FHIT基因)基因定位于3好，Ras协会家庭(RASSF1A基因)基因，定位于3p21和维甲酸受体B2基因(RARB2)，映射到染色体区域3p24[22,23,25-31]11q13的扩增导致细胞周期蛋白D1的过度表达[32]，在30-60%的患者中检测到HNSCC40%的口腔鳞状上皮异常增生[33]。免疫化学方法检测舌鳞状细胞癌中FHIT的表达。他们报告说，68%的患者出现FHIT表达缺失。他们还强调FHIT缺失是临床结果的阴性预后指标[33- 3822]。FHIT位点参与许多类型癌症的某些部分的易位和缺失，可能是由于FHIT中脆弱区域的重组原性，以及FHIT蛋白表达减少的细胞随后的选择性生长或生存优势。3号染色体短臂缺失也见于多种常见肿瘤，如乳腺癌、头颈癌、胃肠道癌、食管癌、宫颈癌[11]。确定3 p组染色体的基因或基因可能参与这些肿瘤的发展,最初的步骤是首先需要定义这些基因的染色体位置[10,39]人类肿瘤的调查结果表明,突变的基因FHIT基因发生改变,主要是删除,在人类癌症中，这种改变在上皮癌中很常见，特别是那些由于暴露于环境致癌物而导致的癌症，如肺癌、头颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和宫颈癌[14-16]。FHIT肿瘤抑制基因，其作用机制及细胞凋亡和细胞周期调控尚不清楚[17-19]。在他们的研究中，FHIT基因与其他类型的肾细胞肿瘤是受保护的，但比较癌中FHIT的表达，他们显示了很高比例的损失。 Laryngeal cancer represents one of the most common head and neck malignancies, accounting approximately for 20% of all cases. Many genetic and environmental factors in the development of tumors are known to play a role [40-42] In some tumors, particularly those associated with exposure to environmental carcinogens, alterations in FHIT occur quite early in the development of human cancer. Thus, frequent molecular abnormalities in head and neck squamous cell carcinoma include alterations in tumor suppressor genesp16INK4A,p53，好东盟地区论坛,FHIT基因，RASSF1A基因，Rb细胞周期蛋白D1和癌基因的激活，如拉基因家族,原癌基因,表皮生长因子受体(10, 40岁,29)。FHIT基因脆性组氨酸三联体基因在细胞中高度甲基化HNSCC[33]与早期食管鳞状细胞癌预后不良相关[41-42]。一些研究表明，FHIT表达与头颈部鳞状细胞癌的局部复发相关(HNSCC)(10, 36)。Mineta等发现低FHIT表达与Ki-67高表达相关，提示低FHIT表达的肿瘤细胞可能具有高增殖潜能[40]。Tai等人发现高危患者中，FHIT阴性肿瘤局部复发较少(%18)，高危患者中FHIT阳性肿瘤(%33)[36]。Otero等人认为53p过表达预示预后改善的趋势，而FHIT表达未降低预示晚期口咽癌[20]患者预后明显较差。我们认为，对FHIT基因表达的进一步研究将有助于阐明喉癌发生的生物学机制，有助于喉癌的早期发现和预防。但除上述发现外，目前的研究结果强调，FHIT基因部分与喉部鳞状细胞癌分析靶点相关。根据分析结果，我们在FHIT基因的第8外显子和第9外显子之间发现了一个链接。然而，要证实这一发现，还需要对大量患者进行研究。这些实验将表明，FHIT蛋白的完全缺失是否会导致小鼠肿瘤谱系的发展，这可能与人类肿瘤中FHIT位点基因改变的研究结果一致。如果能够实现这一目标，不仅可以更好地治疗FHIT阴性肿瘤，还可以消除或减少癌前病变，有助于预防一些最常见的人类癌症。

承认

我们感谢阿汉德·埃拉格茨博士协助获得本研究中使用的临床材料，并感谢Hasibe Cingilli VURAL博士对本研究项目的支持。

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