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摘要

FAM20A是哺乳动物相关蛋白家族中的一员，被命名为FAM20家族(family with sequence similarity 20)，有三个成员(FAM20A, FAM20B, FAM20C)。最近，一些研究报道了患有Amelogesesis Imperfecta.由FAM20A突变引起的牙釉质发育不良、牙齿发育失败、牙龈增生等多种牙体表型。我们报道了一个58-kb片段缺失的转基因小鼠系，包含部分Fam20a基因，其上游区域显示生长紊乱。在本研究中，我们旨在阐明Fam20a蛋白的缺失如何影响Fam20a牙齿组织的发育^-/-鼠标。光学显微镜研究（LM）石蜡嵌入式标本在FAM20A中显示出软质釉质和牙龈增生^-/-老鼠。含有牙齿的颌骨的接地部分的LM显示，没有覆盖冠状牙本质的牙釉质。颌骨（石蜡包埋标本）的免疫组化研究表明，FAM20A蛋白在骨质组织和FAM20A的牙齿胚胎中表达^+/+而在Fam20a中不表达^-/-老鼠。综上所述，本研究揭示了FAM20A蛋白对牙釉质形成是必需的。

关键字

牙齿发育不全，牙龈增生，fam20a

介绍

釉质发生天空”(AI)是一组没有任何正常综合征表型[1]的遗传性釉质缺陷。另一方面，已经描述了牙釉质形成的一些遗传性先天性缺陷，合称为AI，这为描述生物矿化的基本事件和剖析骨骼疾病[2]的分子发病机制提供了机会。牙釉质是人体中矿化程度最高的组织。成熟牙釉质含矿物质95%以上，有机含量不足1%[3]。在健全的牙齿的发育过程中，一系列的外间质相互作用需要很好地协调，成牙本质细胞首先分泌牙本质基质，然后成釉细胞[4]分泌牙釉质基质。分泌的牙釉质基质随后钙化，并通过去除剩余的牙釉质基质蛋白和牙釉质晶体的生长而成熟。任何这些步骤的改变都会导致牙釉质缺陷。釉质基质分泌的减少导致AI发育不良，其中的釉质很薄。先前的研究发现，低钙化的釉质非常柔软，但釉质厚度正常。相比之下，未饱和的釉质柔软且变色，但厚度[5]正常。

序列相似度为20的家族(Family with sequence similarity 20, FAM20)由三个成员组成(FAM20A, FAM20B，和FAM20C)，这些基因可能是由一个共同的祖先基因通过基因复制事件[6]进化而来。Fam20a基因位于11E1染色体上，由11个外显子组成，全长约60kb。翻译开始于第一个外显子，终止于最后一个外显子，编码一个含有541个氨基酸的蛋白，该蛋白被证明是一种分泌的糖蛋白[6]。哺乳动物的FAM20分泌蛋白家族由三个成员组成(FAM20A, FAM20B，和FAM20C)，最初被认为在调节造血和其他组织[6]的分化和功能中发挥作用。在人类中，FAM20A的突变最近与AI的发生和一个血亲家族[7]的牙龈增生有关。

最近，我们报道了在产生表达病毒基因[8]的Tg小鼠的过程中发现了一种表现生长紊乱的转基因(Tg)小鼠系。由于转基因缺失，这些小鼠不表达任何相应的病毒mRNA或蛋白质，11E1染色体上包含Fam20a基因[8]部分的58 kb片段缺失。在本研究中，我们报道了在Fam20a敲除小鼠中观察到的AI。

材料和方法

FAM20A基因敲除小鼠

我们之前报道过Tg小鼠(230行)的生长障碍，在肝脏[8]中未检测到转基因mRNA的表达。然而，转基因插入导致包含部分Fam20a基因(包括外显子1)及其上游区域的58kb基因组片段的缺失。RT-PCR分析表明230 Tg小鼠的纯合后代不表达Fam20a mRNA(图1)。我们认为230 Tg小鼠与Fam20a敲除小鼠相当。

图1所示。视觉检查

切牙牙齿;FAM20A^+/+小鼠：野生型小鼠中的门牙的牙釉质通常显示出光滑的乳白色表面，并且由于铁含量（a，c）而具有黄色棕色着色。切牙牙齿;FAM20A^{- / -}老鼠:Fam20a的上下门牙都有^{- / -}小鼠有白垩白色到不透明外观(B, D)。下颌骨有臼齿;FAM20.^+/+鼠标：野生型小鼠中的臼齿具有奶油白色，半透明珐琅和平滑表面（e）。用磨牙牙齿;FAM20.^{- / -}而Fam20a的臼齿^{- / -}老鼠有白色、不透明的釉质，表面粗糙(F);FAM20A^{- / -}小鼠:与野生型小鼠Fam20a比较^{- / -}小鼠的牙龈明显增大(黑色箭头)。

鼠标饲养和测试

小鼠按照机构指南进行饲养，喂食普通饲料(船桥船ashi农场，日本)，并在特定的无病原体条件下饲养。所有的动物实验都是按照神户大学动物实验伦理委员会批准的方案进行的。

季度哨点监测显示，没有证据表明致病性啮齿动物病毒，支原体，或螺杆菌在Lexicon制药源菌落。

在这项研究中，观察通常是在8到60周的小鼠中完成的。在检验组数据的基础上，假设组数据呈正态分布，使用2-tail Student’s t检验进行统计比较。

FAM20A mRNA表达分析

用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)从肝脏中提取总RNA。逆转录100 ng总RNA，使用SuperScript一步RT-PCR (Invitrogen公司)进行扩增。利用H5-5 38-F (5 ' - tactcggttgcatcgtact -3 ')和H5-5 335-R (5 ' -TCAGCATGTCTCGTGACCAA-3 ')对Fam20a的mRNA进行RT-PCR。

组织病理学分析和免疫荧光基染色

组织标本(小鼠头部部分)在4%多聚甲醛中固定，在乙醇溶液中依次脱水，并包埋在石蜡中。取5µm厚切片，苏木精-伊红染色。采用抗Fam20a抗体免疫荧光染色检测Fam20a蛋白的表达和定位。

下颌骨的地面部分

将含切牙和磨牙的下颌骨从头部切开，去除软组织后的地面切片(30 m)，用盐酸(0.3 N, 2秒)处理，碳fuchsin染色(0.1 w/v %)，准备硬组织LM。

结果

视觉检查

虽然纯合[HOM]小鼠的数量明显低于预期，但FAM20A^{- / -}用1/2的Fam20a生产小鼠^+/+小鼠（WT：52;杂合[HET]：96; HOM：27）。FAM20A^+/+或Fam20a^{- / +}小鼠表现出基本正常的生长速度2021版权所有，Fam20a的增长率^{- / -}各类型小鼠(Fam20a^+/+, Fam20a^{- / +}, Fam20a^{- / -})可存活至一岁。雄性和雌性的生育能力FAM20A^+/+和Fam20a^{- / +}小鼠也正常。在Fam20a^{- / -}小鼠，发情期通常比正常小鼠晚两周，产仔率降低50%。最显著的肉眼病变是在Fam20a的牙列^{- / -}老鼠。初始病理评估在6个Fam20a上完成^{- / -}10 ~ 12周龄小鼠(2雄4雌)，第二组6只Fam20a^{- / -}取54 ~ 60周龄的小鼠(雄性2只，雌性4只)进行尸检。

野生型和杂合型小鼠的正常门牙通常呈黄褐色，表面光滑乳白色(图1A和C)。与此相反，Fam20a的上门牙和下门牙都是如此^{- / -}小鼠的外观呈垩白色至不透明(图1B和D)。年轻Fam20a的臼齿^{- / -}小鼠小且PEG样（图1F），具有不透明和粗糙的表面，而野生型和杂合窝小鼠的摩尔齿是光滑的且乳白色（图1E）。在旧的FAM20A中^{- / -}小鼠的门齿大体外观基本没有变化，但臼齿已经磨损。Fam20a牙龈明显增大^{- / -}与野生型小鼠相比。

LM研究

组织学上，正常发育的门牙在基底部清晰地显示出牙釉质、牙本质和牙骨质(图2A)，牙釉质由高度排列的交叉牙釉质棒组成(图2C)。我们发现Fam20a的牙齿有病变^{- / -}小鼠基本上只局限于釉质层，所有的门牙和磨牙都缺乏真正的釉质(图2B和D)。在牙本质和牙骨质中没有发现异常。

图2。LM的研究。

切牙;FAM20A^+/+鼠标：在野生型小鼠的牙釉质中观察到定期排列的棱柱结构。地面部分。（a，c）。门牙;FAM20A^{- / -}小鼠:Fam20a唇牙本质表层未见棱柱状结构^{- / -}老鼠(B, D)。

x光检查

野生型和FAM20A的X射线射线照相^-/-显示Fam20a尺寸的老鼠^{- / -}小鼠颅骨比野生型小鼠小(即宽度:102 ~ 100，长度:93 ~ 100)(图3A和D)^{- / -}小鼠臼齿区域约为野生型小鼠的85%(黑色箭头;图3B和E). Fam20a的齿厚(唇-舌尺寸)^{- / -}小鼠下门牙约为野生型小鼠的72%(黑色箭头;图3C和F)，而肺泡内径无显著差异(白色箭头;图3C和F)。

图3。x射线检查。

头骨大小;FAM20A^+/+和Fam20a^{- / -}Fam20a的尺寸^{- / -}小鼠的头骨比野生型小鼠的要小。X射线射线照相。(即，宽度:102至100，长度:93至100)。(A, D)摩尔区;FAM20A^+/+和Fam20a^{- / -}Fam20a的长度^{- / -}小鼠臼齿区约为野生型小鼠的85%。x射线摄影。(B, e黑色箭头)。切牙;FAM20A^+/+和Fam20a^{- / -}鼠标：FAM20A的厚度^{- / -}小鼠较低的切口约为野生型小鼠（C，F.黑色箭头）的72％，而肺泡的内径没有显着差异（C，F.白色箭头）。x射线摄影。

免疫组织化学

免疫组织化学表明，FAM20A蛋白在骨质型组织中表达，野生型小鼠的牙胚（图4A和C），但在FAM20A中没有表达^{- / -}P.0.d)(图4B和D)。

图4。免疫组织化学。

免疫组织化学表明，FAM20A蛋白在骨质型组织中表达，野生型小鼠的牙胚，但在FAM20A中没有表达^{- / -}老鼠(P.0.d)。

讨论

细胞外基质的生理钙化或生物蛋白化是正常发育过程，对于各种组织的适当形成和功能至关重要，这是必不可少的（例如，骨骼和牙齿）。如果钙化或生物矿化过程受到干扰，则骨骼和牙齿的形成也会受到干扰并导致几种疾病如AI。迄今为止，AI已与六个牙釉质蛋白和蛋白酶（enam，Ambn，Amelx，MMP20，Klk4和Amelotin）相关联，但许多已知的Ai indrys在这些基因中的任何一种中没有突变[9,10]。在这项研究中，我们发现FAM20A中发生了典型的AI和牙龈肥大^{- / -}老鼠。最近也有研究报道，在AI患者中检测到FAM20A基因突变[7,11]。因此，我们认为FAM20A在生物矿化过程中发挥了重要的调控作用。

从历史上看，AI术语的使用仅限于遗传症，其特征在于牙釉质的数量和质量异常，其在其他体系中的代谢或形态缺陷未被代谢或形态缺陷[12]。然而，AI的定义已经扩展以包括可以与影响其他器官系统的病变相关联的可遗传搪瓷缺陷[12]。此外，一些研究报道，FAM20A突变会导致牙釉质肾综合征[13,14]。因此，我们将继续在未来观察FAM20A KO小鼠的全身疾病。此外，我们还将观察到牙齿胚芽发展不同阶段的FAM20A KO小鼠的组织学变化，以进一步阐明生物矿化过程中FAM20A的功能。

综上所述，本研究表明FAM20A在小鼠体内的缺失导致AI和牙龈增生。这一结果与前人关于人类FAM20A基因组突变导致AI和牙龈增生的报道相一致。在小鼠中进一步研究FAM20A与AI和牙龈增生的关系是我们下一步应该面对的尝试。

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