美国亚特兰大埃默里大学医学院血液学和肿瘤内科
生物材料部，丸八村松株式会社，日本Yaizu
DOI: 10.15761 / IMM.1000127
海洋藻类海藻horneri（美国horneri)由于刺激成骨细胞骨形成和抑制破骨细胞基因，生物活性因子已被证明具有合成代谢骨作用。然而，的影响美国horneri关于癌细胞骨转移的研究尚未见报道。进行这项研究是为了确定美国horneri人乳腺癌MDA-MB-231骨转移细胞的生物活性成分在体外．MDA-MB-231细胞的增殖受到抑制美国horneri活性成分(分子量小于3000;10 ~ 200 μg/ml)连续作用5天和10天。美国horneri活性成分通过细胞周期阻滞抑制剂抑制MDA-MB-231细胞的G1期和G2/M期细胞周期阻滞。此外,美国horneri活性成分刺激凋亡细胞死亡。这种效应在caspase-3抑制剂的存在下被阻止。因此,美国horneri在人乳腺癌MDA-MB-231骨转移细胞中发现活性成分抑制细胞增殖并刺激细胞凋亡死亡在体外显示出抗癌效果。
马尾藻，乳腺癌MDA-MB-231细胞，细胞增殖，凋亡
乳腺癌是迄今为止全世界女性中最常见的癌症，它与各种生活方式的选择有关，如肥胖、晚生第一胎和使用激素替代疗法。在发达国家，乳腺癌仍然是癌症死亡的第二大原因。70-80%的晚期乳腺癌患者发生乳腺癌骨转移，导致严重的病理性骨折、疼痛、高钙血症、脊髓和神经压迫综合征，是发病率和死亡率的常见原因。化学预防是指使用药物、维生素、食物补充剂、疫苗或其他制剂来降低风险、延缓癌症的发展或复发[1,2]。
在海藻中裙带菜，马尾藻，双轮爱森菌，隐孢子菌，阿曼葵，而且石莼pertusaKjellman是季节性采集的，马尾藻(马尾藻)已发现对骨代谢有独特的合成代谢作用[3]。美国horneri提取物对破骨细胞骨形成有促进作用，对破骨细胞骨吸收有抑制作用在体外，从而增加骨量[4-7]。的摄入量美国horneri研究发现，提取物可在骨质疏松动物模型和健康人体内预防骨质流失[8-10]。功能性食品因子美国horneri提取物可能是有用的成骨因子在预防骨质疏松的人类受试者。此外,美国horneri活性成分可能对乳腺癌患者中极高发生率的乳腺癌细胞骨转移引起的骨质丢失具有抑制作用[11-15]。然而，这还没有得到调查。
进行这项研究是为了确定是否美国horneri使用人乳腺癌MDA-MB-231骨转移细胞，活性成分具有抗癌作用在体外模型。我们发现美国horneri活性成分抑制人乳腺癌MDA-MB-231骨转移细胞增殖并刺激凋亡细胞死亡。这一发现表明，摄入美国horneri活性成分是预防和治疗乳腺癌骨转移的有效工具。
用4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和抗生素(青霉素、链霉素;P/S)从Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)购买。胎牛血清(FBS)来自HyClone (Logan, UT)。除非另有说明，丁酸钠、罗scovitine、萝卜硫素、caspase-3抑制剂和其他所有试剂均购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)。
海藻类S. horneri [Sargassum horneri (Turner) C. Agardh]是季节性从下田(日本静冈县)和宫古县(日本岩手县)的海岸采集，冷冻干燥并动力[4]。收集的新鲜海藻在蒸馏水中均质，在冷藏离心机中以5500g离心10分钟。将5500g上清馏分汇集用于冷冻干燥。将水溶性提取物的粉末溶解在冰冷的蒸馏水中，用于实验。采用膜分馏的方法对霍氏草水溶性提物进行纯化，得到小于3000MW的有效成分[4]。
人乳腺癌MDA-MB-231骨转移细胞(MDA-MB-231)缺乏雌激素、孕激素和人上皮生长因子2型(HER2)受体[16]，因此被认为是三阴性。它们表达高水平的上皮生长因子受体(EGFR)，该受体的激活及其下游信号事件增强了这些细胞的迁移、增殖、侵袭和恶性表型的进展[16]。我们使用了雌激素非依赖性寻骨三阴性人乳腺癌MDA-MB-231细胞。该细胞系来自美国类型培养收藏(Rockville, MD, USA)。
乳腺癌MDA-MB-231细胞(1x105在含10% FBS和1% P/S的DMEM中培养24孔板，有或没有FBS美国horneri有源组件(小于3000MW;10、25、50、100或200 μg/ml)，在含5% CO的饱和水大气中浸泡5天和10天295%空气在37°C。在单独的实验中，MDA-MB-231细胞在存在或不存在的情况下培养3天美国horneri活性成分(50 μg/ml)与丁酸钠(10和100μM)、罗scovitine(10和100nM)或萝卜硫素(1和10nM)混合或不混合。培养结束后，从每个培养皿中分离细胞，计数[17]。
乳腺癌MDA-MB-231细胞(1x105在含10% FBS和1% P/S的DMEM中(不含FBS)用24孔板培养年代．horneri当成分达到融合时，5天，然后细胞在存在的情况下培养年代．horneri组件(小于3000mw;10、25、50、100或200μg/ml)。在单独的实验中，细胞培养5天美国horneri，然后细胞培养2天美国horneri(50μg/ml)加或不加caspase-3抑制剂(5μM)。培养结束后，将细胞从每个培养皿中分离，计数[18]。
在Ca2+/Mg2+- free PBS中，用0.2% trpysin + 0.02% EDTA在37℃下从每个培养皿中分离细胞，离心后收集细胞[17-19]。细胞重悬于PBS溶液中，用伊红染色。在显微镜下使用血细胞计板计数细胞数量。对于每一道菜，我们取两次计数的平均值。细胞数以每孔板数表示。
数据以均数±标准差(SD)表示。使用GraphPad InStat version 3 for Windows XP (GraphPad Software Inc.。拉霍亚，加利福尼亚州)。参数数据经Tukey-Kramer多重比较后验，采用单向方差分析(ANOVA)进行多重比较。资料以P<0.05为有统计学意义。
人乳腺癌MDA-MB-231骨转移细胞的数量随着FBS存在培养时间的增加而增加。的存在美国horneri有源组件(小于MW 3000;10-200μg/ml)可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞培养5天(图1A)和10天(图1B)的增殖在体外．因此,美国horneri活性成分对细胞增殖有抑制作用。
图1所示。美国horneri活性成分抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖在体外．细胞在DMEM中培养，存在或不存在美国horneri有源组件(小于3000mw;10-200μg/ml)连续5 (A)或10 (B)天。培养结束后，计数培养皿上附细胞数。数据以每个数据集2个重复井的平均值±标准差表示。培养结束后，计数培养皿上附细胞数。数据以每个数据集2个重复孔的平均值±标准差表示，使用不同的培养皿和细胞制备。＊p与对照组相比<0.001(灰色条)。单因素方差分析，Tukey-Kramer后验。
抑制作用美国horneri在诱导细胞周期阻滞的各种抑制剂的存在下，测定了MDA-MB-231细胞增殖的活性成分在体外(图2)。细胞在不存在(图2A)或存在(图2B)的情况下培养3天美国horneri活性成分(50μg/ml)含或不含丁酸(10和100μM)、罗scovitine(10和100nM)或萝卜硫素(1和10nM)[17]。在这些抑制剂的存在下，MDA-MB-231细胞的增殖被抑制(图2A)。抑制作用美国horneri在这些抑制剂的存在下，对细胞增殖的活性成分没有增强(图2B)。
图2。的影响美国horneri在诱导细胞周期停止的各种抑制剂存在时，对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的活性成分在体外．细胞在不存在(A)或存在(B)的条件下培养3天美国horneri有源组件(小于3000MW;50μg/ml)含有或不含丁酸盐(10和100μM)、罗scovitine(10和100nM)或萝卜硫素(1和10nM)。培养结束后，计数培养皿上附细胞数。数据以每个数据集2个重复孔的平均值±标准差表示，使用不同的培养皿和细胞制备。＊p与对照组相比<0.001(白色柱状图)。单因素方差分析，Tukey-Kramer后验。
将人乳腺癌MDA-MB-231细胞培养5天，使其融合，然后在存在的情况下再培养2天美国horneri有源组件(小于3000MW;10 - 250μg / ml)。的加入使细胞数量减少美国horneri有源组件(图3A)。刺激作用美国hornericaspase-3抑制剂(5μM)抑制MDA-MB-231细胞死亡的活性成分(25或50μg/ml)在体外(图3 b)。因此，文化与美国horneri活性成分刺激乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡细胞死亡在体外．
图3。美国horneri活性成分刺激人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡细胞死亡在体外．A:当细胞达到融合时，培养5天，然后在存在的条件下再培养2天美国horneri有源组件(小于3000MW;10 - 250μg / ml)。B:当细胞融合时，培养5天，然后在存在的条件下再培养2天美国horneri有源组件(小于3000MW;25或50μg/ml)加或不加caspase-3抑制剂(5μM)。培养结束后，计数培养皿上附细胞数。数据以每个数据集2个重复孔的平均值±标准差表示，使用不同的培养皿和细胞制备。＊p与对照组相比<0.001(灰色条)。单因素方差分析，Tukey-Kramer后验。
海洋藻类美国horneri在人乳腺癌MDA-MB-231骨转移细胞中发现活性成分抑制增殖并刺激凋亡细胞死亡在体外．这一发现表明美国horneri在MDA-MB-231细胞中具有抗癌作用在体外．这是第一次发现。
抑制作用美国horneriMDA-MB-231细胞增殖的活性成分可能与调节细胞内信号通路有关在体外，虽然抗癌作用美国horneri活动组件未知。美国horneri研究表明，活性成分可通过拮抗核因子(NF)-κB信号通路刺激成骨细胞形成，抑制成骨细胞形成我n体外[4]．NF-κB信号通路在乳腺癌细胞中增强，经研究表明，NF-κB信号通路通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)[20]诱导破骨细胞形成，促进骨溶解性骨转移。
抑制作用美国horneri丁酸盐、罗scovitine或萝卜硫素对MDA-MB-231细胞增殖的活性成分没有诱导细胞周期阻滞。Roscovitine是周期蛋白依赖性激酶cdc2, cdk2m和cdk5[21]的有效选择性抑制剂。萝卜硫素诱导G2/M期细胞周期阻滞。丁酸盐可抑制G1进程[17]。HCA可抑制MDA-MB-231细胞的G1期和G2/M期细胞周期阻滞。
美国horneri在MDA-MB-231细胞中发现活性成分刺激凋亡细胞死亡在体外．在caspase-3抑制剂的存在下，没有观察到这种影响。美国horneri活性成分可能通过增加caspase-3活性的机制刺激凋亡细胞死亡。有可能美国horneri活性成分直接激活乳腺癌mda - mb -231细胞中的caspase-3。
有效化合物美国horneri在MDA-MB-231细胞中抑制增殖和刺激凋亡细胞死亡的活性成分尚未确定。但是，我们发现其中存在4种化学物质美国horneri活性成分(小于wm3000)采用液相色谱质谱测定系统(LCMS-IT-TOF;岛津，京都，日本)。这些化学物质被鉴定为1,3,5-三(氧基-2-基甲基)-1,3,5-三嗪烷(MW 339)， 5-苯基-2-[2-(5-苯基四氮唑-2-基)乙基]四氮唑(MW 318)， 3-(十六烷基氨基)丙烷-1,2-二醇(MW 316)和2-(2-羟乙基-三烷基氨基)乙醇(MW 288)[23]。这些化学物质可能具有抗癌作用，无论是单独使用还是组合使用。
美国horneri活性成分已被证明对成骨细胞骨形成具有刺激作用，对破骨细胞骨吸收具有抑制作用在体外，从而增加骨量[4-7]。的摄入量美国horneri提取物对骨质疏松动物模型和健康人的骨质流失有预防作用[8-10]。功能性食品因子美国horneri提取物可能是有用的成骨因子在预防骨质疏松的人类受试者。此外,美国horneri推测活性成分对乳腺癌细胞骨转移引起的骨质丢失具有抑制作用。的摄入量美国horneri活性成分可能是预防和治疗乳腺癌骨转移的有效工具。这一点有待阐明。
总之，海藻美国horneri在人乳腺癌MDA-MB-231骨转移细胞中发现活性成分抑制增殖并刺激凋亡细胞死亡在体外．因此,美国horneri活性成分被证明在人乳腺癌细胞中具有抗癌作用在体外．
作者(M.Y.)对研究的设计和实施、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写做出了贡献。其他作者(T.M.)对研究的进行做出了部分贡献。所有作者都没有利益冲突。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年3月1日
录用日期:2015年3月14日
发布日期:2015年3月17日
©2015 Yamaguchi M.这是一篇根据创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Yamaguchi M, Matsumoto T(2015)海藻马尾藻生物活性因子在体外抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖并刺激细胞凋亡死亡。Integr Mol Med 2: DOI: 10.15761/ im .1000127
图1所示。美国horneri活性成分抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖在体外．细胞在DMEM中培养，存在或不存在美国horneri有源组件(小于3000mw;10-200μg/ml)连续5 (A)或10 (B)天。培养结束后，计数培养皿上附细胞数。数据以每个数据集2个重复井的平均值±标准差表示。培养结束后，计数培养皿上附细胞数。数据以每个数据集2个重复孔的平均值±标准差表示，使用不同的培养皿和细胞制备。＊p与对照组相比<0.001(灰色条)。单因素方差分析，Tukey-Kramer后验。
图2。的影响美国horneri在诱导细胞周期停止的各种抑制剂存在时，对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的活性成分在体外．细胞在不存在(A)或存在(B)的条件下培养3天美国horneri有源组件(小于3000MW;50μg/ml)含有或不含丁酸盐(10和100 μM)、罗scovitine(10和100nM)或萝卜硫素(1和10nM)。培养结束后，计数培养皿上附细胞数。数据以每个数据集2个重复孔的平均值±标准差表示，使用不同的培养皿和细胞制备。＊p与对照组相比<0.001(白色柱状图)。单因素方差分析，Tukey-Kramer后验。
图3。美国horneri活性成分刺激人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡细胞死亡在体外．A:当细胞达到融合时，培养5天，然后在存在的条件下再培养2天美国horneri有源组件(小于3000MW;10 - 250μg / ml)。B:当细胞融合时，培养5天，然后在存在的条件下再培养2天美国horneri有源组件(小于3000MW;25或50μg/ml)加或不加caspase-3抑制剂(5μM)。培养结束后，计数培养皿上附细胞数。数据以每个数据集2个重复孔的平均值±标准差表示，使用不同的培养皿和细胞制备。＊p与对照组相比<0.001(灰色条)。单因素方差分析，Tukey-Kramer后验。
