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摘要

最近有研究表明，在2-8°C下冷藏对角膜的代谢特性不是中性的。本研究的目的是揭示：人类角膜在冷藏过程中的生化变化动力学，以及保存的角膜显示出与之最大生化相似性的贮藏时间体内的人。从10名60 - 71岁的供体中获得20块人类角膜，在+4°C的Eusol-C中保存14天。对照标本为从尸体眼球中采集后立即保存在-80°C下的组织。用HR MAS研究了样品代谢谱的每日变化¹H NMR波谱。在角膜中检测并分配了25种代谢物。发现Eusol-C保存组织和非保存组织之间以及保存14天的角膜与保存7天的样品之间的代谢谱存在显著差异。样品之间的主要差异与ATP、forma的水平有关保存2周的角膜显示其生化成分更类似于正常角膜体内比角膜保存一周的时间短。本研究结果表明，从生物化学的角度来看，角膜移植或任何其他与从储存介质中取出角膜相关的程序应在Eusol-C低温保存两周后进行。

关键词

角膜移植、角膜生化、冷藏、代谢组学、核磁共振波谱学

介绍

最近的一份关于人类角膜在2-8°C的商业培养基中保存的报告显示，低温保存8天降低了在不同死后时间收集的组织的生化含量之间的差异[1]。然而，接下来的研究表明，上述情况只有在捐献者没有任何慢性病的情况下才有可能实现。特发性肝硬化或心血管疾病患者的角膜样本在生物化学上与从健康供者获得的角膜样本不同，无论是在Eusol-C存储[2]前后。令人惊讶的是，这些与眼睛功能没有直接关系的特定疾病显著影响角膜生物化学。此外，在角膜保存前指定的一些生化异常在保存8天后减少或消失。有趣的是，在研究角膜中，供体之间的生化差异并不伴随着内皮细胞密度的差异[1,2]。

眼科医生的主要假设是提供质量最好的角膜移植手术，以确保手术的成功。根据欧洲眼库协会或类似的美国协会[3,4]，供体角膜必须满足一系列标准，其中最重要的是阴性血清学检测结果和具有适当细胞密度的表皮和内皮的细胞形成。在标准移植物评估中，角膜的生化状态从未被认为是重要的[3,4]然而，Kryczka的报告等[1,2,5]损害了关于低温储存系统的保守性或功能的论文。然后，问题出现在角膜的生化成分在冷藏期间如何每天变化？为了回答这个问题，健康供体的人类角膜保存在基于Eusol-C的低温储存系统中，并每天采集的样本用HR MAS（高分辨率魔角旋转）进行调查¹核磁共振氢谱（质子核磁共振）。

材料和方法

这项研究坚持了《赫尔辛基宣言》和地方性法规关于人类研究和人体组织器官的使用原则，并已提交给华沙大学医学生物伦理学委员会，该委员会承认了该研究的协议，并没有提出异议。

角膜

从10名60-71岁的捐赠者尸体解剖后4-12小时获得20个人角膜。捐赠者中未报告有系统性或慢性疾病，或近期药物治疗。没有一名捐赠者酗酒，或感染肝炎病毒，或患有自身免疫疾病或癌症。经裂隙灯生物显微镜评估在角膜质量符合欧洲眼库协会标准[3]的情况下，切除直径为10mm（卡尺测量）的角膜纽扣，去除巩膜和角膜缘^TH.分离角膜（比萨饼片），并立即在-80°C下冷冻，直至分析。这些样本被指定为对照角膜。剩余的组织放置在+4°C的Eusol-C冷藏系统中。从同一供体获得的成对角膜组织在储存介质中保存两个不同的储存时间：7天和14天。在7天存储组中，每天1/8^TH.将角膜与剩余组织分离，用冷冻(+4°C) 0.9%无菌(w/v) NaCl溶液冲洗，并在80°C冷冻。在第二个贮藏组中，在第14天采用相同的冷冻程序，如上所述。用于本研究的角膜由于解剖时造成的轻微上皮损伤而不适合移植。

高分辨率魔法角旋转质子NMR（HR MAS¹核磁共振波谱

人力资源马斯¹核磁共振波谱在14.1 T Avance DRX600型Bruker光谱仪（德国莱茵塞顿Bruker BioSpin GmbH）上运行，工作频率为600.132 MHz。在分析之前，将冷冻样品切成块，并浸入冷（+4°C）25 mM钠溶液[2,2,3,3-d]₄]D中的3′-三甲基硅基丙酸酯₂O在一个直径4毫米(容量50 μl)的氧化锆转子。光谱记录在+4°C使用4毫米¹H /¹³C MAS探头。样品以5000 Hz的频率旋转，扫描次数为512次。采用预饱和选择脉冲进行水抑制。使用0.3 Hz的指数线展宽。使用MestreNova v。5.1.0软件（Mestrelab Research，西班牙圣地亚哥德孔波斯特拉）。使用绝对积分测量峰面积，并通过测量样品的湿重进行归一化（立即冷冻的角膜样品的重量范围：7.3-12.3 mg；储存时间：1天：7.0-12.2 mg，2天：7.5-12.4 mg，3天：7.2-12.1 mg，4天：7.2-12.4 mg，5天：7.5-12.3 mg，6天：7.1-12.2 mg，7天：7.4-12.3 mg，14天：7.6-12.5 mg）并按照前面所述对光谱中的代谢物进行分配[1,6]。

统计分析

从相同的供体获得并在-80℃下在储存介质中立即冷冻的配对角膜组织被认为是两组的两种对照组。通过独立的学生的T检验测试各种对照组各种手段之间的差异的重要性。由于没有显示统计学差异（数据未显示），从储存7天的玉米羚组中获得的对照样品被认为是进一步分析的对照。

¹H NMR波谱数据首先转入Unscrambler软件(CAMO, Oslo, Norway)进行主成分分析(PCA)。0-7天和14天采集样品的光谱区域0.3-10.0 ppm作为数据输入。交叉验证分析的主成分数量由杠杆校正验证方法评估，作为给出最小总验证x方差的成分数量。然后，采用均值定心交叉验证方法。为了揭示分组和样本之间的关系，第一主成分(PC1)得分图vs。对第二主成分（PC2）进行了解释。

在HR MAS中，所研究的代谢物的检测限相对较高(在mM范围内)¹核磁共振波谱。不太可能没有这些代谢物，对低于相应检测限的代谢物使用“0”的代谢物滴度会扭曲统计分析结果。因此，省略了此类“零”滴度。

通过重复测量培养基中的反射型Anova进行单向ANOVA进行代谢物含量数据作为重复测量因子。然后进行摩苏思试验进行球体评估。如果不符合球形度，则采用温室 - 阁楼校正。然后用Bonferroni校正完成所有代谢物的成对比较。

后果

在所研究的HR MAS 1H NMR光谱中指定了25种低分子量代谢物；代表性光谱见图1。

图1完整人类角膜样品的代表性HR MAS 1H NMR光谱。使用[2,2,3,3-d4]3'-三甲基硅基丙酸钠（TSP）作为参考物质，在0 ppm下分配ppm值。交流，醋酸盐;阿拉丙氨酸;参数，精氨酸；Asc，抗坏血酸；atp.，三磷酸腺苷；但，丁酸盐;胆固醇，胆碱；CR.，肌酸；为了，甲酸酯；b-Glc，b-葡萄糖; A.-GLC.A.葡萄糖；Glu，谷氨酸;Gln谷氨酰胺；GPC.glycerophosphocholine;他的组氨酸;伊利，异亮氨酸;紫胶，乳酸；Leu，亮氨酸;遇见蛋氨酸；m-ino.肌醇；苯丙氨酸苯丙氨酸;苏琥珀酸;头,氨基乙磺酸;TYR.，酪氨酸；瓦尔，缬氨酸。*假定但这在对照组的角膜中没有检测到。

主成分分析结果

主成分1（PC1）和2（PC2）分别占样品核磁共振谱总变化的61%和23%vs．PC2沿PC1轴表现出相当大的色散。PC1评分高与ATP和甲酸含量高、甘氨酸含量低相关;PC1评分低的情况则相反(图2)。

图2.．供体角膜的主要成分分析。小组a：1st的分数图vs。第二主成分¹人体角膜核磁共振谱;数字符号“1-7”表示组织在第一周内的存储天数，()-角膜在存储介质中保存14天，()控制角膜。面板B:主组件的加载剖面¹眼角膜的核磁共振谱。代谢物描述在较低的情况下，在负荷剖面表明这些化合物对分组模式的影响可以忽略不计。作为PC1的生化化合物被标记为方形框。作为PC2的生化化合物被强调。代谢产物标签见图1图示。

对照样品以及保存14天的角膜显示出PC1向高值的转变，而在冷藏介质中保存一周的大多数角膜与低PC1值相关。高PC2分数与相对较高的乳酸和丁酸含量有关。向低PC1值的转变与向低PC1值的转变相结合PC2值对在Eusol-C中保存7天的角膜的区分分组明显较差。在保存在培养基中的角膜NMR光谱评分图中，未观察到进一步的样品分组模式（图2）。

氨基酸

统计分析显示，与对照组相比，丙氨酸(储存第1天)和谷氨酰胺(储存1-2天的样品)水平显著升高，而蛋氨酸(储存2-7天的样品)则相反。贮藏14 d后，丙氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸含量均低于对照样品。另外，贮藏14天的样品中丙氨酸和谷氨酰胺水平也低于贮藏7天的样品中各自的代谢物水平。在Eusol-C保存2-7天和1-7天的样品中，谷氨酸和苯丙氨酸均低于检出限(图3)。

图3.．贮藏时间对角膜指定游离氨基酸含量的影响。数据为平均值±SEM (NMR峰积分/mg组织)。* - p < 0.05vs。控制;# - p < 0.05，组织保存14天vs。保存7天的;X -在各自的NMR谱图中没有可检测到的代谢物峰。有关氨基酸标签，请参见图1中的图例。

非氨基酸低分子量代谢物

统计分析表明，在Eusol-C中保存2-7天的样品中ATP、甲酸盐和甘油磷酸胆碱（保存2天和6-7天）的水平与对照组相比，冷藏14天的样品显示，与对照组相比，肌酸、甲酸盐、肌醇和琥珀酸的水平显著升高，后三种代谢物以及丁酸盐的水平也显著升高保存7天的组织样品和2-5天的样品中的肌酸水平均低于检测阈值。14天和对照样品中分别未检测到抗坏血酸和丁酸盐（图4）。

图4。贮藏时间对角膜指定低分子量非氨基酸代谢物含量的影响。数据为平均值±SEM (NMR峰积分/mg组织)。* - p < 0.05vs。控制;# - p < 0.05，组织保存14天vs。保存7天的样品；X-在相应的NMR光谱中未检测到代谢物峰。代谢物标签见图1的图例。

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研究中所有角膜的ECD测量值显示在2350-2950细胞/mm之间².两组样本之间未发现显著的ECD差异。

讨论

最近的报道表明，对角膜组织的高需求仅被眼部网络部分地覆盖。当地法律和习俗，政治态度和公众意识使捐赠者角膜或多或少地在不同的州[7-10]。大多数眼部银行能够在局部地获得足够数量的供体角膜以覆盖这种需求。为了确保用于嫁接一些眼部的足够数量的角膜组织设定比75年的更高年龄限制[11]或2,000个细胞/ mm的最小ECD值²[12]，或者在其他国家购买移植组织。后一步骤有时需要延长存储时间，以完成角膜细胞对新的眼库相关环境的调度和适应。因此，研究将供体组织从冷藏转移到器官培养以提高角膜寿命的可行性已成为眼科的前沿课题之一[13,14]。

人们普遍认为，角膜组织从角膜移植而来体内(或离体捐赠者）环境对人工储存介质的环境对细胞来说不是过于危害;过程中最幸存的过程[11,15]。存储系统的目标是提供模仿自然的人工环境，并确保细胞活力和低水平的细胞或分子损伤。然而，储存介质总是表示供体组织的压力环境，因为培养基的组合物可以代替天然龙轭流体的含量，该含量是来自位于围绕眼睛的组织中的几个化合物或分泌物的多种化合物或分泌物的混合物[16,17]]。在这方面，基于非常基本的市售介质如Eusol-C [18]，甚至没有近似的低温存储系统体内状况。

事实上，低温储存被认为是保存心脏的一种方法体内基于低温（2-8°C）对组织细胞代谢活动影响的机制中的人类角膜特性：人们认为它可以减少细胞对代谢能量的需求[11,15,19]。根据这一假设，组织中的ATP水平应保持不变，或者考虑到较低的能量需求，甚至随着储存时间的增加而增加。令我们惊讶的是，这项研究的结果并未证实这一观点，因为保存2-7天的角膜中的ATP水平明显低于对照样品（图4）。对于这些观察，我们没有明确的基于证据的解释。也许，目前的推测是，ATP作为一种能源被取代并用于维持细胞中的主要酶系统，至少是酶系统。酶系统旨在保护细胞/组织免受因暴露于人工和潜在压力环境而造成的损害。ATP的这种消耗并没有被其生产所抵消，可能是由于储存介质的低温。有趣的是，Redbrake早先也观察到了类似的能量变化模式等[20]在该报告中，储存时间也与组织中受损内皮细胞数量的增加有关，这在我们的研究中未观察到。

浓度变化与ATP动力学非常相似，显示出甲酸盐（图4）。这种生化化合物是一种自由基清除剂，保护细胞免受氧化损伤[21]。在储存的第一周内，其在组织中的消失可能表明，角膜细胞暴露于自由基物质时，该化合物的使用会加快。然而，牛磺酸和抗坏血酸这两种强大的抗氧化剂在储存期间保持不变（图4）。然后，自由基的影响是中等的，其他因素可能会导致细胞内失衡，从而导致在储存的第一周内ATP被剥夺（图4）。其中之一可能是规避储存介质的生化成分缺乏一些可获得的生化物质/代谢物体内[18].

主成分分析表明，ATP和甲酸盐（甘氨酸的影响较小）均被确定为PC1的主要生化物质/成分，负责对对照样品和2周样品保存1周的角膜进行远距离分组（图2）。此外，虽然确定了PC2的主要成分，即丁酸和乳酸，但在评分图中未观察到样品的进一步分离（图2）。然后，PCA显示在Eusol-C中保存一周的角膜之间的生化相似性，而保存2周的角膜显示出与对照角膜初始值相似的生化模式（图2）。相似，但不完全相同：详细的统计分析显示，保存一周的角膜组内，以及保存两周的角膜与对照样品之间的生化差异（图3和图4）。通常，大多数生化化合物的水平在储存的第一周内保持稳定或下降（见：ATP、甲酸盐、甘油磷酸胆碱、蛋氨酸；图4），甚至下降到无法检测的值（见：肌酸、谷氨酸、苯丙氨酸；图3和图4）。与这些变化相关的分子机制以及这些差异对基于Eusol-C的冷藏系统中细胞功能的影响尚不清楚。其中一些生化化合物在保存两周后显示出恢复到对照角膜初始浓度值的趋势（参见：ATP、蛋氨酸、苯丙氨酸；图3和图4）。此外，其中一些在储存两周后显示出显著更高的浓度值，即使与对照组相比（参见：肌酸和甲酸盐；图4），或者即使在储存的第一周内没有显示出浓度变化，生化化合物的水平也会升高（见：肌醇和琥珀酸盐；图4）。另一方面，即使在储存的第一周内未观察到明显变化，但在储存2周后，一些化合物的水平降低（见：丙氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、甘油磷酸胆碱和胆碱；图3和图4）上述观察结果引出了一个基本问题：从生物化学的角度来看，什么对角膜移植物更有利？保存一周或两周？随着最近的报告强调了将供体组织从冷藏转移到温暖器官培养的可行性，这个问题变得更为关键增加供体角膜的寿命[13,14]，但问题是从代谢的角度来看，使其处于最佳时间点。

答案不是很清楚，因为涉及到代谢产物的广泛光谱的变化通常在代谢途径中彼此之间没有共同点。此外，部分成分为丁香酚c，本研究使用[18]。在这方面，有一个很重要的观察结果:与对照组相比，储存两周后的氨基酸水平相同或显著下降。降低游离氨基酸水平可能表明它们在组织中的降解没有被培养基中的流入平衡。另一方面，这也可能是角膜细胞中蛋白质合成的影响，其速率超过了Eusol-C对氨基酸的摄取。这个过程将表明角膜的细胞和分子特性的恢复。这篇论文的另一个论点似乎是两周角膜中甘油磷酸胆碱和胆碱的水平(图4)。这两种化合物都是细胞膜的组成成分[22,23];它们的减少表明它们与细胞膜的紧密结合，然后是组织的细胞室的巩固。葡萄糖作为细胞中的主要代谢物之一，在储存过程中保持不变(图4)。后者可能部分是由于从接近其组织消耗速率的保存培养基中补充了葡萄糖。

结论

本研究证实了先前的报告[1,2,5]，将温度降低到储存介质中低至+ 4℃的温度不受代谢变化的保护。还表明，经过两周的低温Eusol-C储存后，玉米米似乎处于比保存不到7天的更好的代谢条件。目前尚不清楚是否使用另一种培养基或储存类型可能影响这些生化差异以及它们在移植后的渐进性或渐变程度。进一步的研究应该探讨这个问题。最后但并非最不重要的是，目前的结果应该打开关于最佳时间窗口的讨论：（i）进行角膜移植程序或（ii）将供体组织从冷储存转移到器官培养物中以增加角膜的寿命。

利益申报

作者声明这篇文章没有利益冲突

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