德岛本里大学香川药学院，日本香川769-2193
东京理科大学药学院，2641山崎，日本千叶野田278-8510
东京理科大学基因组与药物研究中心，日本千叶野田山崎2641,278-8510
德岛本里大学香川药学院，日本香川769-2193
德岛本里大学香川药学院，日本香川769-2193
DOI: 10.15761 / IMM.1000242
核因子-κB (NF-κB)具有多种病理生理功能，因此被认为是寻找治疗多种疾病的药物的合适靶点，包括癌症和炎症性疾病。我们之前报道了一种新的基于三嗪的NF-κ b抑制剂4,6-二氯-N-苯基-1,3,5-三azin-2-胺(NI241)，它直接抑制NF-κB与DNA的结合。我们预测了NI241与p50 (NF-κB家族成员)的结合方式在网上对接模拟。在这里，我们使用基于结构的虚拟筛选(SBVS)寻找新的NF-κB抑制剂，这是一种在药物发现中广泛用于识别候选化合物的计算方法。在目前的研究中，我们使用对接模拟程序Glide进行SBVS，并从我们的虚拟化学库中选择了33种化合物。随后，我们研究了这些化合物的NF-κB抑制作用，使用电泳迁移率漂移试验。我们发现了两种抑制p50 DNA结合的化合物。尽管这些化合物作为NF-κB抑制剂的效果不如NI241，但它们具有新的支架结构，并提供了线索，将有助于未来的努力，以确定新的化合物，特异性地抑制NF-κB与DNA的结合。
核因子-κB (NF-κB)，抑制剂，DNA结合，基于结构的虚拟筛选(SBVS)
核因子-κB (NF-κB)是一种转录因子，通过与DNA中的κB元件结合来调节基因表达，κB元件包含共识序列5'-GGGRNYYYCC-3'[1-5]。NF-κB调控的基因种类繁多，参与多种关键的细胞和系统过程，包括细胞增殖、细胞生存和死亡、先天免疫和炎症[6-8]。NF-κB异常激活是癌症和炎症性疾病的一个特征。NF-κB在多种类型的癌症中都是组成性激活的。慢性炎症是各种类型癌症的危险因素，也可能与NF-κB异常激活有关[9-11]。因此，选择性NF-κB抑制剂将在癌症研究和治疗中发挥重要作用。
两种不同的信号通路，典型和非典型通路，与NF-κB的激活有关[8,12,13]。NF-κB的许多抑制剂已被报道，包括IκB激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和抗氧化剂[14,15]。虽然这些抑制剂可以在NF-κB信号通路的各个上游和中游步骤阻断NF-κB的激活，但它们也可以影响其他靶点和通路。然而，直接抑制NF-κB DNA结合的化合物可能在调控靶基因表达方面非常有效，因为NF-κB信号通路在DNA结合水平上收敛。在之前的工作中，我们从我们的化学文库中确定了直接抑制NF-κ b DNA结合的新化合物，我们确定了独特的化合物4,6-二氯-N-苯基-1,3,5-三嗪-2-胺，我们将其命名为NI241(图1)。我们比较了NI241类似物的抑制作用并进行了预测在网上NI241与p50 (NF-κB家族成员)[16]结合的模式。随后，我们开始寻找新的NF-κB抑制剂在网上基于结构的虚拟筛选(SBVS)方法，参考了我们之前研究中NI241与p50结合的模式。
图1所示。NI241的化学结构;4、6-dichloro-N-phenyl-1 3 5-triazin-2-amine。
SBVS是一种强大的计算技术，广泛应用于药物发现过程中，通过从大型化学库中编译相关的化学结构来识别候选化合物。SBVS允许研究人员通过与目标蛋白的活跃口袋进行对接模拟，筛选大量候选化合物，对化合物-蛋白质相互作用进行评分，以估计化合物的结合能[17-19]。在本研究中，我们首先使用SBVS寻找新的NF-κB抑制剂。为此，我们准备了一个虚拟化学库。然后我们研究了高评分候选化合物的抑制作用在体外．通过这种方法，我们发现了两种抑制p50 DNA结合的化合物。
虚拟化学库中化合物的二维结构数据由纳米比亚正二(东京，日本)提供。SBVS选择的化合物从纳米比亚Shoji购买，并溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。5’- alexa680标记的κB单链寡核苷酸与NF-κB结合位点相对应，购自日本生物服务公司(日本埼玉县)。
利用LigPrep 2.0[20]和QikProp 2.5[21]软件对化合物二维结构数据进行虚拟化学库的构建。LigPrep为每个成功处理的输入结构产生一个单一的、低能量的、具有正确手性的3D结构。从每个输入结构中，该软件还可以产生许多具有各种电离态、异构体、立体化学和环构象的结构，并根据各种标准排除分子，包括分子量，或指定的官能团数量和类型。使用OPLS_2005力场进行最小化，并使用电离器生成pH 7.0±2.0下所有可能的电离态[20,22,23]。QikProp能够对化合物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)进行快速、准确和简单的预测，并预测有机分子的重要物理描述符和药学相关特性，无论是单个的还是批量的[21-24]。
我们的虚拟化学库中化合物与p50之间结合的特异性通过对接仿真程序与对接仿真程序Grid-based Ligand对接Energetics (Glide) 4.0[23,25 - 29]进行了评估，如之前报道的[16]。p50的3D结构来自蛋白质数据库(PDB代码:1NFK)。去除所有的水分子，只使用一个p50亚基进行建模。我们的虚拟化学库中的化合物被停靠在p50的晶体结构中在网上使用Glide 4.0。该程序搜索一个或多个典型的小配体分子与一个典型的大受体分子(通常是蛋白质)之间的良好相互作用，并提供三种对接模式:高通量虚拟筛选(HTVS)、标准精度(SP)和额外精度(XP)。HTVS模式用于快速筛选大量的配体，而SP模式适用于筛选大量质量未知的配体。XP模式是一种更强大的识别程序，它结合了强大的采样协议和自定义评分函数，旨在根据物理化学的共同原理识别预期具有不利能量的配体位姿[23,25,29]。对接结果的解释是基于这个适应度函数的“Glidescore”形式。“首先，我们使用Glide的HTVS模式对虚拟化学库中的化合物进行筛选。在HTVS模式下选择具有高Glidescore的化合物，并使用SP模式在p50中停靠。使用XP模式过滤并重新停靠排名靠前的化合物。最后，我们选择并购买了33个候选化合物进行进一步分析。
将5'- alexa680标记的单链寡核苷酸与未标记的互补单链寡核苷酸(5' -Alexa680-AGTTGAG)退火，制备了alexa680标记的NF-κB探针GGGACTTTCCCAGGC-3 '(义)和5 ' -GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3 '(反义)，其中κB结合位点的序列被强调。他标记的p50重组蛋白在大肠杆菌通过HisTrap HP (GE Healthcare，白金汉郡，英国)使用Profinia蛋白纯化系统(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)进行纯化。将含有结合缓冲液(15 mM Tris-HCl [pH 7.5]， 180 mM NaCl, 1.5 mM乙二胺四乙酸，1.5 mM二硫苏糖醇，4%甘油，1 mg/mL牛血清白蛋白，0.3%非idet P-40)， 0.5µg聚(dI-dC)·(dI-dC)和62.5 ng his标记的p50重组蛋白的反应混合物放在冰上放置10分钟。然后加入候选化合物，室温孵育。30分钟后，加入20 nM alexa680标记的NF-κB探针，并在室温下继续孵育30分钟。样品(20µL)装入0.5× TBE制备的5%原生聚丙烯酰胺凝胶上，在170 CV下电泳150分钟。然后使用奥德赛红外成像系统(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)扫描和分析凝胶。
我们使用纳米比亚Shoji提供的6,149,846个化合物的二维结构数据，通过SBVS来寻找NF-κB DNA结合的候选抑制剂。使用LigPrep和QikProp软件对数据进行优化分析。LigPrep为每一个成功处理的输入结构产生一个单一的、低能量的、具有正确手性的3D结构[20,22,23]，而QikProp预测有机分子的重要物理描述符和药学相关性质[21-24]。经过优化，我们得到了一个含有5,469,185个化合物的虚拟化学库。
在此之前，我们确定NI241是NF-κB[16]的抑制剂，并使用停靠模拟程序Glide 4.0预测了NI241和p50结合的模式。Glide搜索给定配体和受体之间有利的互补相互作用[23,25,29]。与我们之前的研究一样，我们通过使用Glide 4.0的对接模拟来评估我们的虚拟化学库。首先，我们使用HTVS模式选择了4,007种Glidescore低于−6.0的化合物。然后利用SP模式将这些化合物停靠在p50的晶体结构中。然后使用XP模式对前30%(1202)的化合物进行对接模拟。最终我们从虚拟化学库中选出了33种化合物。这33种化合物与NI241比较的结构和glidescore如表1所示。
表1。NI241和33个从我们的虚拟化学库中选择的化合物的结构和滑动分数。
我们购买了基于SBVS从虚拟化学库中选择的33种化合物。这些化合物在DMSO中溶解，并使用alexa680标记的NF-κB探针和重组his标记的p50进行EMSA验证它们对NF-κB DNA结合的抑制作用。EMSA是一种传统的测定序列特异性DNA结合的方法在体外．首先在1 mM的浓度下测试这些化合物。只观察到N-018和N-019对NF-κB DNA结合的抑制作用(图2)。然后在0到1 mM的浓度范围内进行含有N-018和N-019的EMSAs，以研究抑制效果的剂量依赖性(图3;NI241的抑制作用供参考)。N-018和N-019在1 mM范围内均能抑制NF-κB的DNA结合，但在小于500 μM范围内对NF-κB的结合几乎无影响或无影响。此外，这些化合物的抑制作用均弱于NI241。虽然N-018和N-019作为NF-κB抑制剂的效果不如NI241，但我们确实从虚拟化学库中发现了两种新的NF-κB抑制剂支架。
图2。EMSA分析了从我们的虚拟化学库中选取的33种化合物在浓度为1 mM时的抑制效果。
图3。EMSA分析N-018、N-019和NI241抑制作用的剂量依赖性。
NF-κB在细胞和系统水平上影响多种生物过程，被认为是寻找治疗多种疾病药物的潜在靶点[14,30,31]。涉及SBVS的计算方法在药物发现过程中被广泛使用，因为它们能够对大量数据进行快速分析。虚拟数据和实验数据的集成在有前景的新化合物的识别和开发中变得越来越重要[19,32 - 34]。在我们之前的研究中，我们搜索了我们的化学文库，以确定直接抑制NF-κB DNA结合的化合物，并确定了一个单一的抑制分子NI241(图1)。此外，使用在网上对接模拟[16]。在本研究中，我们准备了一个虚拟化学文库，并使用SBVS方法寻找抑制NF-κB p50 DNA结合的其他新化合物。基于Glidescore，在我们最初的筛选中，我们从包含5,469,185个化合物的虚拟化学库中选择了33个化合物(表1)，然后研究了EMSA对这些化合物的抑制作用(图2)。两种化合物N-018和N-019在1 mM浓度下抑制了EMSA中p50的DNA结合(图2和3)。
按照我们之前研究的方法进行对接模拟时，所选33个化合物的Glidescores都低于NI241(表1)。虽然N-018和N-019两个化合物实际上抑制了p50的DNA结合在体外(图2)，这两种化合物的抑制作用都弱于NI241(图3)。这些结果表明SBVS模拟是不完整的。在之前的另一项研究中，我们对NF-κB dna结合抑制剂NI241[35]进行了结构-活性关系(SAR)分析。SAR分析提供了可以用来预测虚拟筛选模型的线索在网上．NI241中的2,4-二氯-1,3,5-三嗪亚结构被认为是抑制NF-κB结合[35]的重要药效团。这与基于计算分析的预测一致，计算分析表明，NI241和p50中2,4-二氯-1,3,5-三嗪亚结构之间的氢键对抑制NF-κB结合[14]很重要。然而，这些信息并不足以使我们识别出比NI241更有效的NF-κB结合抑制剂。为了识别这样的抑制剂通过在网上对于SBVS，有必要使用p50预测潜在抑制剂更合理的结合模式。还需要更多关于抑制NF-κB DNA结合的化合物的数据，如药效团。
在本研究中，两种化合物N-018和N-019被鉴定为NF-κB DNA结合的抑制剂。预计这些化合物及其类似物的合成孔径雷达分析结果将提供更多有用的数据。对这些含有NI241及其类似物的化合物的详细分析将有望提供线索，使我们能够利用p50预测NF-κB结合抑制剂最合理的模式在网上．进一步的工作正在进行中，以确定其他新的化合物，有效抑制NF-κB的DNA结合。
这项工作得到了东京生化研究基金会的部分资助。
伊凡痛风
伦敦大学学院
研究文章
收稿日期:2016年8月10日
录用日期:2016年9月15日
出版日期:2016年9月19日
©2016 Kobayashi T.这是一篇开放获取的文章，根据创作共享署名许可条款发布，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Kobayashi T, Tanuma S, Kino K, Miyazawa H(2016)靶向NF-κB DNA结合抑制剂的新支架。整合分子医学3:DOI: 10.15761/ im .1000242。
德岛本里大学香川药学院，日本香川Sanuki市Shido 1314-1，电话:+81-87-899-7100;传真:+ 81-87-894-0181
表1。NI241和33个从我们的虚拟化学库中选择的化合物的结构和滑动分数。
图1所示。NI241的化学结构;4、6-dichloro-N-phenyl-1 3 5-triazin-2-amine。
图2。EMSA分析了从我们的虚拟化学库中选取的33种化合物在浓度为1 mM时的抑制效果。
图3。EMSA分析N-018、N-019和NI241抑制作用的剂量依赖性。
