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摘要

利用高压电势(HELP)装置产生电场(EF)的医疗是日本常用的替代疗法。然而，人们对其潜在健康益处的潜在机制知之甚少。识别EF暴露相关的生物标志物是理解EF治疗有益效果的关键。我们通过非靶向血浆代谢组学分析，对10名健康受试者在HELP暴露(18 kV, 30 min)之前和之后获得的血浆代谢物进行筛选。在161种代谢产物中，几种含有信号分子油基乙醇酰胺(OEA)和脂肪酸的脂肪酸酰胺显著上调。在此条件下，HELP暴露对柠檬酸和鸟氨酸循环中间产物没有影响。由于OEA作为过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α的内源性配体而被认为可以诱导脂解，我们进一步利用人皮下培养的脂肪细胞证实了OEA对基因表达的影响。OEA处理后，过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶1 (ACOX1) mRNA表达上调。oea诱导的ACOX1 mRNA表达对PPAR-α拮抗剂GW6471敏感。我们的发现将为EF治疗的分子机制提供新的见解。

关键字

生物标志物;oleoylethanolamide;过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1

缩写

ACOX1:过氧化物体酰基辅酶A氧化酶1;ACSL3:酰基辅酶a合成酶长链家族成员3;CE-TOFMS:毛细管电泳-飞行时间质谱-电子电离-质谱;CYP4A11:细胞色素P450，家族4，亚家族A，多肽11;DGAT2:甘油二酯acyltransferase-2;英孚:电场;ELISA:酶联免疫吸附法;FAT/CD36:脂肪酸转位酶/分化簇36;GAPDH:甘油醛3-磷酸脱氢酶;GPR: G蛋白偶联受体; GW6471: N-((2S)-2-(((1Z)-1-methyl-3-oxo-3-(4-(trifluoromethyl) phenyl)prop-1-enyl)amino)-3-(4-(2-(5-methyl-2-phenyl-1,3-oxazol-4-yl)ethoxy)phenyl) proyl) propanamide; GW9662: 2-chloro-5-nitro-N–phenyl-benzamide; HDLBP: high density lipoprotein binding protein; HDL-C: high density lipoprotein-cholesterol; HELP: high-voltage electric potential; LC-TOFMS: liquid chromatography-time -of-flight mass spectrometry electron ionization-mass spectrometry; LDL-C: low density lipoprotein-cholesterol; mRNA: messenger ribonucleic acid; OEA: oleoylethanolamide; PPAR-α: peroxisome proliferator-activated receptor-alpha; qRT-PCR: quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; TRPV1: transient receptor potential vanilloid 1

简介

日本厚生劳动省批准了一种将人体暴露在高压电位(HELP)下的治疗设备。据报道，高压电场(EF)治疗肩僵、便秘、失眠和头痛是一种有效的治疗方法，而EF暴露对多个血液参数和肝脏二酰甘油酰基转移酶-2 (DGAT2) mRNA表达的影响也有报道[1-3]。然而，关于EF效应的许多证据是基于使用实验动物的固定应激操作。因此，目前还不清楚EF暴露后的观察结果是单独来自于EF暴露还是与固定应激相关。一些人体研究报道了全身接触HELP对临床生化参数的影响[4-6]，并描述了一种测量疼痛的视觉模拟量表[7-9]。综上所述，这些研究的结果表明，帮助暴露可能是几种疾病的替代疗法，尽管其机制仍不明确。

内源性代谢物已被认为是可能代表症状和治疗靶标蛋白之间的接口的候选分子。代谢组学是一门相对较新的学科，致力于对组织和生物流体中内源性代谢物的全球研究[10-12]。内源性代谢物与症状之间联系的大量证据已从使用非靶向代谢组学对有神经性疼痛[13]的大鼠背角进行的研究中获得。非靶向代谢组学方法可能有助于识别ef诱导的生物标志物。本研究的目的是阐明EF暴露后内源性小分子的变化。利用毛细管电泳(CE)-飞行时间质谱(TOFMS)和液相色谱(LC)-TOFMS对健康受试者急性EF暴露前后的血浆样本进行代谢差异筛选。本研究结果表明，EF暴露导致内源性信号分子油基乙醇酰胺(OEA)水平升高。由于OEA已被证明与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α[14]结合，我们还通过微阵列分析研究了OEA是否改变了人类皮下脂肪细胞的基因表达谱。

材料和方法

EF暴露

EF暴露所使用的系统已经被描述过[6,8,15]。EF系统配备了一个变压器、一个底座和两个绝缘体覆盖的电极，放置在受试者脚所在的地板上，并位于受试者头部上方。HELP设备(Healthtron PRO-18T或Hb9000T;日本东京白州健康科学研究所有限公司)是通过分别在18千伏和9千伏转换50赫兹的交流电而均匀创建的。高压(9 kV)电势电源产生的表面EF值为颈段9.96 kV/m，腿段11.6 kV/m。该系统的安全性是由日本政府在1963年建立的。

主题

10名健康成人(5名男性和5名女性;平均年龄40.2±10.2岁;平均体重指数(BMI) 22.0±2.4 kg/m²)参与实验1(暴露条件:18 kV 30min)。10名健康成人(6名男性和4名女性;平均年龄44.4±9.7岁;BMI: 22.3±3.2 kg/m²)参与实验二(暴露条件:9kv 30min)。实验在上午进行，所有参与者在收到关于研究的口头和书面信息后签署了一份知情同意书。实验是根据《赫尔辛基宣言》进行的，研究方案得到了白州健康科学研究所有限公司(日本东京)人类伦理委员会的批准。

样品制备

采血采用乙二胺四乙酸(VP-NA070K;Terumo公司，东京，日本)，立即用800 x g离心5分钟，从其他细胞材料分离血浆。随后，血浆被转移到一个新鲜的eppendorf管中并储存在-80℃ 0直到处理C。

CE-TOFMS测量

如前所述[10,16,17]测量代谢物。简单地说，在450 μL含内标物甲醇中加入50 μL血浆(溶液ID: H3304-1002;人类代谢组技术公司(Human Metabolome Technologies, Tsuruoka, Japan)，在0ºC，以失活酶。提取液与500 μL氯仿、200 μL mmilliq水充分混合，2,300 x g、4倍离心⁰然后，将350 μ L的上层水层通过Millipore 5- kda截止过滤器(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)离心过滤以去除蛋白质。滤液离心浓缩后再悬于50 μL微敏q水中，用于CE-MS分析。

LC-TOFMS测量

在1,500 μL含1%甲酸/乙腈的内标溶液(溶液ID: H3304-1002, Human Metabolome Technologies)中加入500-μL血浆，溶液浓度为0 0C以使酶失活。溶液充分混合，2,300 x g和4离心 0C 5 min。上清液用混合SPE磷脂筒(55261-U;suelco, Bellefonte, PA, USA)去除磷脂。滤液干燥后溶于100 μL异丙醇/微敏q水进行LC-MS分析。LC- tofms使用安捷伦LC系统(安捷伦1200系列RRLC系统SL)进行，该系统配备了安捷伦6230 TOF质谱仪(安捷伦科技，Waldbronn，德国)。CE (Agilent Technologies)使用Agilent G2201AA ChemStation软件版本B.03.01对系统进行控制。如前所述[10,16,17]，使用十八烷基硅烷柱(2×50 mm, 2 μM)测量阳离子和阴离子化合物。使用MasterHands自动集成软件(庆应大学，鹤冈，日本)提取峰，获取峰信息，包括m/z比，LC-TOFMS测量的保留时间(RT)和峰面积。排除了同位素、加合离子和其他已知代谢物产生的离子对应的信号峰。根据TOFMS测定的MT/RT和m/z值，用HMT代谢物数据库中的推定代谢物标注剩余的峰。峰值注释的公差范围MT为±0.5 min, m/z为±10 ppm。 In addition, peak areas were normalized against those of the internal standards and then the resultant relative area values were further normalized by sample amount.

分子建模与对接研究

PPAR-α与激动剂AZ242 (1i7g;[18]的分子对接采用Protein Data Bank Japan)。使用Sybyl-X2.0软件包(Tripos International, St. Louis, MO)附带的Surflex-Dock程序对OEA与PPAR-α的结合进行对接研究。对接实验共进行5次，获得5个对接位置。

Affymetrix GeneChip微阵列

将人白色皮下前脂肪细胞(Lonza, Basel, Switzerland)培养在前脂肪细胞基础培养基2 (Lonza)中添加2 mM l -谷氨酰胺和10%胎牛血清(Lonza)。简言之，将1 × 104细胞接种于96孔多壁板孔中。分化诱导的分化培养基中含有胰岛素，地塞米松，吲哚美辛和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(所有供应龙沙)6天。按照基因芯片表达分析技术手册(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)中描述的协议，从每个样本中分离出的RNA进行处理并与Affymetrix genchip人类基因组U133 Plus 2.0阵列杂交。原始数据提交至国家生物技术信息中心(NCBI)基因表达Omunibus (GEO)数据库(http://www.ncbi.nlm.gov/geo/，平台加入号GSE55539)。

实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

按照描述的[19]进行qRT-PCR。总之，使用RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)从菌丝片段中分离总RNA (1 μg)，然后使用定量逆转录试剂盒(Qiagen)用以下引物进行逆转录:ACOX1-F, GTA TGG AAT CAG TCA GAA CGC;Acox1-r, CTT gta aga TTC GTG gac ctc;Fat / cd36-f, TTG atg TGC aaa atc cac agg;脂肪/ CD36-R;TGT GTT GTC CTC agc GTC ct;Acsl3-f, gag agt TTG aac CCG atg ga;Acsl3-r, TTG gca caa caa atc caa tg;Hdlbp-f, CCG TCC gag agg cac aga;Hdlbp-r, CCG cca tac TCT tca gca atc; PPAR-α-CAG AAC AAG GAG GCG GAG GTC ; PPAR-α-R, TTC AGG TCC AAG TTT GCG AAG C; PPAR-γ-F, ACC AAA GTG CAA TCA AAG TGG A; PPAR-α-R, ATG AGG GAG TTG GAA GGC TCT; and GAPDH-F, CAT CCC TGC CTC TAC TGG CGC TGC C; GAPDH-R, CCA GGA TGC CCT TGA GGG GGC CCT C. All qPT-PCR reactions were performed using SYBR Premix EX Tag (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). Amplification and detection were performed under the following conditions: 95 0C(10秒)和60秒 0C(1分钟)50次循环。倍数诱导值按公式2ΔΔCt计算，表示目标基因与甘油醛3-磷酸脱氢酶2 (GAPDH2)的周期阈值差异，ΔΔCt表示对照与处理差异的相对值。

化学物质

油基乙醇酰胺(OEA)、GW6471和GW9662购自Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)。

统计分析

数据使用Welch t检验进行分析。概率(p)值< 0.05被认为具有统计学意义。

结果

HELP暴露对健康人血浆代谢物的影响

使用CE-和LC-TOFMS分析来测量健康参与者血浆中总共161种代谢物的丰度。代谢模式的层次聚类分析结果如图1所示。HELP (18 kV, 30 min)处理前后，代谢物有显著差异(表1)。HELP处理后，共有31种代谢物显著上调，包括脂肪酸酰胺(OEA、棕榈酰乙醇酰胺、硬脂酰乙醇酰胺);脂肪酸[油酸、亚油酸、亚麻酸、顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、顺-8,11,14-二十碳三烯酸、顺-11,14-二十碳二烯酸、顺-11-二十碳二烯酸、花生四烯酸、花生四烯酸乙酯、神经酸、FA(22:5)、FA(22:4)、FA(19:1)、FA(17:0)、FA(14:0)、棕榈酸、硬脂酸和十七烷酸];氨基酸(异硫酸、n -乙酰甘氨酸、n -乙酰丙氨酸和磷酸肌酸);甾体(脱氢异雄酮3-硫酸酯和依蒂奥cholan-3 α-ol-17-one硫酸盐);UDP;2-hydroxybutyric酸;和threonic酸。HELP暴露后，26种代谢产物发生下调，包括脂肪酸[月桂酸、癸酸、天葵酸、辛酸、庚酸、己酸、戊酸、AC(18:2)、AC(16:2)、AC(16:1)、AC(14:2)、AC(14:0)、AC(12:1)、AC(12:0)]; amino acids (Ala, Tyr, Phe, Trp, Met, cystine, hydroxyproline, sarcosine, hippuric acid, and γ-butyrobetaine); glycochenodeoxycholic acid; and cholesterol sulfate. Under these conditions, there was no effect of HELP (18 kV, 30 min) exposure against cortisol/cortisone in plasma from healthy participants. In addition, HELP (18 kV, 30 min) exposure had no effect on citric acid and ornithine cycle intermediates.

图1所示。HELP (18 kV)暴露30 min前后的人体健康血浆代谢组学分析(a)每个样本中发现的分子特征分层聚类的热图表示(B:之前，n = 10;A:暴露后立即，n = 10)。红色和绿色分别表示高和低浓度的代谢物。(b)健康人血浆中典型的OEA峰值。LC-TOFMS检测OEA。图中为样品前(蓝色)和样品后(红色)的叠加电泳图。

此外，还研究了影响EF强度的OEA的性质。9kv时，前后相对比的OEA变化为1.17 (p = 0.079)。我们还检测了不同处理时间(60 min)的影响，但没有发现HELP (18 kV)暴露(1.09倍;p = 0.422)。

表1。健康人血浆中的非靶向代谢物分析

代谢物 N = 10		之前 平均数±标准差	后 平均数±标准差	比 前/后p价值
脂肪酸酰胺
Oleoylethanolamide		e-06 e-05 2.2±5.1	e-06 e-05 2.7±8.4	1.24 - 0.009 * *
Palmitoylethanolamide		e-06 e-05 2.1±4.0	e-06 e-05 2.4±5.3	1.12 - 0.017 *
Stearoylethanolamide		e-06 e-06 9.2±2.5	e-06 e-05 1.0±2.6	1.12 - 0.013 *
Linoleylethanolamide		e-06 e-06 8.4±2.2	e-06 e-06 9.2±3.0	1.09 - 0.265
脂肪酸及相关代谢物
油酸	1.2 e 03 e-04±7.9		1.8 e 03±1.1 e 03	1.52 - 0.009 * *
亚油酸	1.2 e 03 e-04±7.9		1.8 e 03±1.1 e 03	1.47 - 0.017 *
亚麻酸	e-05 e-05 4.6±2.6		e-05 e-05 6.2±3.2	1.35 - 0.044 *
9 -十六碳烯酸	e-05 e-05 6.0±5.1		e-05 e-05 8.0±5.6	1.34 - 0.054
独联体4、7、10、13、16日19-Docosahexaenoic酸	e-04 e-04 3.8±2.9		e-04 e-04 5.8±4.1	1.51 - 0.003 * *
独联体5、8、11、14 17-Eicosapentaenoic酸	e-05 e-05 3.2±2.2		e-05 e-05 4.4±3.0	1.35 - 0.004 * *
独联体8日,11日,14-Eicosatrienoic酸	e-06 e-05 1.1±3.8		e-06 e-05 1.5±6.0	1.38 - 0.002 * *
独联体-11年,14-Eicosadienoic酸	e-06 e-06 8.9±5.4		e-06 e-05 1.3±8.1	1.46 - 0.007 * *
独联体11-eicosenoic酸	e-06 e-05 1.5±9.5		e-05 e-05 2.1±1.5	1.44 - 0.014 *
花生四烯酸	e-05 e-04 1.0±4.4		e-05 e-04 1.4±7.1	1.41 - 0.004 * *
花生四烯酸乙酯	e-05 e-05 2.5±2.1		e-05 e-05 3.5±2.8	1.39 - 0.020 *

神经酸	e-07 e-06 2.0±9.5	e-07 e-06 2.6±8.1	1.31 - 0.001 * *
Myristoleic酸	e-04 e-04 2.3±1.4	e-04 e-04 2.1±1.1	0.90 - 0.299
蓖麻油酸	e-06 e-06 7.7±5.5	e-06 e-05 1.0±8.0	1.31 - 0.054
FA (22:5)	e-05 e-05 2.6±1.6	e-05 e-05 3.8±2.6	1.46 - 0.013 *
FA (22:4)	e-05 e-05 1.4±1.3	e-05 e-05 2.1±1.8	1.46 - 0.014 *
FA (20:3)	e-06 e-06 4.1±5.0	e-06 e-06 5.6±7.3	1.38 - 0.084
FA (19:1)	e-06 e-06 3.3±1.6	e-06 e-06 4.4±2.5	1.35 - 0.030 *
FA (1)	e-06 e-06 4.8±3.1	e-06 e-06 6.2±3.7	1.30 - 0.067
FA(十四3)	e-06 e-06 5.3±2.4	e-06 e-06 5.3±2.6	0.99 - 0.967
FA (17:0)	e-06 e-06 3.2±1.4	e-06 e-06 4.4±2.0	1.37 - 0.004 * *
FA (14:0)	e-06 e-05 1.0±7.6	e-06 e-06 1.3±9.1	1.28 - 0.032 * *
棕榈酸	e-04 e-04 2.5±1.3	e-04 e-04 3.4±1.8	1.36 - 0.019 *
硬脂酸	e-05 e-04 1.3±4.9	e-05 e-04 1.8±8.0	1.45 - 0.003 * *
十七酸	e-06 e-06 4.3±1.7	e-06 e-06 6.0±3.0	1.41 - 0.008 * *
月桂酸	1.9 e 03 e-04±5.5	1.6 e 03 e-04±4.0	0.84 - 0.008 * *
癸酸	e-04 e-04 7.2±4.0	e-04 e-04 5.1±2.3	0.71 - 0.005 * *
壬酸	e-04 e-04 9.2±1.3	e-04 e-04 6.4±1.4	0.70 - 0.001 * *
辛酸	e-04 e-04 4.6±1.1	e-05 e-04 3.2±5.9	0.70 - 0.001 * *
庚酸	e-04 e-04 7.2±1.2	e-05 e-04 4.0±7.9	0.57 - 0.001 * *
己酸	e-04 e-04 9.0±1.7	e-04 e-04 5.6±1.2	0.63 - 0.002 * *
戊酸	1.2 e 03 e-04±3.6	e-04 e-04 6.4±2.0	0.54 - 0.008 * *

2-Hydroxyvaleric酸	1.8 e 03±1.9 e 03	1.9 e 03±2.2 e 03	1.05 - 0.361
11-Aminoundecanoic酸	e-05 e-04 1.7±5.1	e-05 e-04 1.7±5.4	1.00 - 0.997
Acylcarnitines
交流(20:1)	e-06 e-06 9.4±4.3	e-06 e-06 9.1±5.1	0.97 - 0.767
交流(20:0)	e-06 e-06 5.4±2.1	e-06 e-06 4.8±1.2	0.89 - 0.366
交流(十八2)	e-05 e-05 8.0±3.0	e-06 e-05 5.9±9.2	0.74 - 0.039 *
交流(第18章)	e-05 e-04 1.7±6.9	e-05 e-04 1.5±5.6	0.85 - 0.178
交流(18:0)	e-05 e-05 4.9±1.9	e-05 e-05 4.3±1.3	0.87 - 0.270
交流(十六)	e-06 e-06 7.5±3.6	e-06 e-06 4.3±2.0	0.60 - 0.003 * *
AC比率(16:1)	e-05 e-05 2.8±1.3	e-05 e-05 1.9±1.1	0.69 - 0.008 * *
Palmitoylcarnitine	e-05 e-04 1.1±4.5	e-05 e-05 8.5±1.5	0.76 - 0.112
交流(十四2)	e-05 e-05 3.0±1.9	e-06 e-05 1.3±5.3	0.44 - 0.008 * *
交流(14:0)	e-06 e-05 1.8±8.6	e-06 e-05 1.1±4.9	0.63 - 0.019 *
交流(13:1)	e-05 e-05 4.5±4.6	e-05 e-05 3.1±2.9	0.69 - 0.054
交流(12:1)	e-05 e-05 2.5±2.1	e-06 e-06 9.1±4.8	0.36 - 0.015 *
交流(12:0)	e-05 e-05 3.2±2.3	e-06 e-05 1.1±5.7	0.35 - 0.007 * *
肉碱	2.7 e-02±5.5 e 03	2.7 e-02±5.5 e 03	1.01 - 0.614
O-Acetylcarnitine	8.4 e 03±1.5 e 03	8.2 e 03±1.8 e 03	0.98 - 0.744
磷脂和相关代谢物
鞘氨醇	e-06 e-05 2.9±8.5	e-05 e-05 3.7±2.0	1.26 - 0.168
乙醇胺磷酸	e-04 e-04 4.9±1.8	e-04 e-04 4.8±2.3	0.98 - 0.848

乙醇胺	e-04 e-04 8.5±1.7			e-04 e-04 8.3±1.7	0.98 - 0.586
甘油	e-02 e-02 9.6±3.7			e-02 e-02 9.6±2.3	1.01 - 0.962
核酸及相关代谢物
三磷酸腺苷	e-04 e-04 6.7±3.0		e-04 e-04 7.2±3.0		1.07 - 0.716
ADP	e-04 e-04 8.8±3.5		1.0 e 03 e-04±4.2		1.17 - 0.316
AMP	e-04 e-04 2.2±1.9		e-04 e-04 2.6±1.4		1.15 - 0.618
国内生产总值	e-05 e-04 1.0±3.9		e-05 e-04 1.2±5.4		1.14 - 0.341
UDP	e-05 e-05 5.2±2.0		e-05 e-05 6.7±2.8		1.30 - 0.040 *
国内流离失所者	6.1 e 03 e-04±4.6		6.2 e 03 e-04±6.2		1.01 - 0.788
尿酸	2.8 e-02±5.9 e 03		2.9 e-02±7.2 e 03		1.02 - 0.185
尿苷	e-04 e-04 8.6±1.7		e-04 e-04 8.0±1.7		0.93 - 0.310
8-Hydroxy-2”-deoxyguanine	e-04 e-04 5.7±3.6		e-04 e-04 6.6±4.1		1.15 - 0.541
焦磷酸	e-04 e-04 9.8±1.7		1.1 e 03 e-04±1.1		1.10 - 0.096
1-Methylnicotinamide	e-05 e-04 1.2±5.9		e-05 e-04 1.2±7.0		1.02 - 0.793
三羧酸循环中间体及相关代谢物
柠檬酸		1.9 e-02±2.9 e 03		2.0 e-02±2.9 e 03	1.07 - 0.066
异柠檬酸		1.0 e 03 e-04±2.9		1.0 e 03 e-04±2.8	1.03 - 0.414
乳酸		9.9 e-02±5.4 e 03		e-02 e-01 1.0±3.8	1.05 - 0.716
琥珀酸		e-04 e-04 5.4±1.4		e-05 e-04 5.3±8.1	0.98 - 0.731

丙酮酸	2.8 e 03±1.1 e 03		2.7 e 03 e-04±9.8	0.97 - 0.738
苹果酸	e-04 e-04 7.8±2.0		e-04 e-02 7.4±2.1	0.95 - 0.482
独联体乌头酸	1.1 e 03 e-04±2.9		1.1 e 03 e-04±2.9	0.99 - 0.811
尿素循环
鸟氨酸	1.1 e-02±4.2 e 03		9.9 e 03±3.5 e 03	0.93 - 0.234
瓜氨酸	5.7 e 03±1.2 e 03		5.8 e 03±1.3 e 03	1.01 - 0.450
尿素	e-02 e-01 4.3±6.9		e-02 e-01 4.2±8.2	0.99 - 0.717
参数	2.9 e-02±8.7 e 03		2.8 e-02±8.1 e 03	0.97 - 0.605
Guanidoacetic酸	e-04 e-04 8.4±3.6		e-04 e-04 7.8±2.9	0.93 - 0.089
甘油酸	1.2 e 03 e-04±2.5		1.1 e 03 e-04±2.7	0.89 - 0.056
氨基酸及相关代谢物
阿拉巴马州		e-02 e-02 8.6±3.1	e-02 e-02 7.7±2.5	0.90 - 0.016 *
b-Ala		e-04 e-04 5.8±2.2	e-04 e-04 5.5±1.6	0.94 - 0.331
Asn		7.4 e 03±1.4 e 03	7.2 e 03±1.3 e 03	0.97 - 0.307
Asp		1.6 e 03 e-04±4.5	1.5 e 03 e-04±4.7	0.99 - 0.866
酪氨酸		1.9 e-02±3.8 e 03	1.8 e-02±4.2 e 03	0.92 - 0.033 *
板式换热器		3.1 e-02±4.1 e 03	2.9 e-02±3.4 e 03	0.91 - 0.013 * *
Trp		2.1 e-02±2.9 e 03	1.9 e-02±2.6 e 03	0.90 - 0.002 * *
利斯河		e-02 e-02 5.6±1.1	e-02 e-02 5.5±1.1	0.98 - 0.531
Ile		e-02 e-02 4.4±1.4	4.0 e-02±9.9 e 03	0.90 - 0.090
见过		6.2 e 03±1.6 e 03	5.1 e 03±1.4 e 03	0.82 - 0.023 *

胱氨酸	2.3 e 03 e-04±7.2	1.7 e 03 e-04±6.5	0.77 - 0.038 *
低浓缩铀	e-02 e-02 8.3±2.1	e-02 e-02 7.6±1.4	0.92 - 0.131
他的	2.2 e-02±2.8 e 03	2.2 e-02±2.6 e 03	0.99 - 0.799
用力推	2.8 e-02±9.8 e 03	2.8 e-02±9.9 e 03	0.98 - 0.529
瓦尔	e-02 e-01 1.1±2.1	e-02 e-01 1.1±1.8	0.96 - 0.282
爵士	1.6 e-02±5.4 e 03	1.6 e-02±5.2 e 03	1.02 - 0.571
Glu	e-02 e-02 3.4±2.1	e-02 e-02 3.6±2.0	1.05 - 0.343
Gln	e-02 e-01 1.1±3.2	e-02 e-01 1.1±3.0	1.02 - 0.602
通用电气	3.1 e-02±8.5 e 03	3.1 e-02±9.1 e 03	1.00 - 0.952
箴	e-02 e-02 6.8±2.4	e-02 e-02 6.5±2.2	0.95 - 0.115
羟脯氨酸	2.9 e 03±1.7 e 03	2.7 e 03±1.7 e 03	0.95 - 0.042 *
5-Oxoproline	1.8 e 03 e-04±4.1	2.9 e 03±3.9 e 03	1.62 - 0.390
氨基乙磺酸	5.6 e 03±1.7 e 03	5.3 e 03±1.5 e 03	0.95 - 0.524
Hypotaurine	e-04 e-04 4.2±1.3	e-05 e-04 4.0±9.6	0.94 - 0.527
Isethionic酸	e-05 e-04 1.8±2.2	e-05 e-04 1.9±2.8	1.08 - 0.040 *
犬尿氨酸	e-04 e-04 4.3±1.2	e-05 e-04 3.9±8.9	0.92 - 0.109
肌氨酸(N-methylglycine)	e-04 e-04 4.4±1.2	e-04 e-04 4.0±1.3	0.90 - 0.036 *
N, N-Dimethylglycine	1.0 e 03 e-04±1.7	e-04 e-04 9.8±2.3	0.97 - 0.289
N乙酰甘氨酸	e-05 e-04 1.6±3.4	e-05 e-04 1.8±4.6	1.14 - 0.026 *
N-Acetylalanine	e-05 e-04 1.7±1.6	e-05 e-04 1.9±2.7	1.14 - 0.027 *

N6-Metyllysine	e-04 e-04 8.3±4.7	e-04 e-04 8.3±5.3	1.00 - 0.901
年代-Metylcysteine	e-04 e-04 9.2±3.1	e-04 e-04 8.7±2.9	0.94 - 0.117
3-Metylhistidine	2.9 e 03±2.2 e 03	2.6 e 03±2.0 e 03	0.93 - 0.091
2-Aminobutyric酸	5.9 e 03±2.0 e 03	6.0 e 03±2.1 e 03	1.02 - 0.518
3-Aminobutyric酸	e-05 e-04 1.2±3.4	e-05 e-04 1.2±2.7	0.99 - 0.928
3-Aminoisobutyric酸	e-04 e-04 5.7±3.6	e-04 e-04 5.9±3.7	1.03 - 0.242
4-Methyl-2-oxovaleric酸	1.1 e-02±3.8 e 03	1.1 e-02±3.1 e 03	0.96 - 0.424
5-Methoxyindoleacetic酸	e-05 e-04 1.3±4.2	e-05 e-04 1.2±5.2	0.94 - 0.204
Indole-3-acetic酸	e-05 e-04 1.6±6.5	e-05 e-04 1.5±5.0	0.91 - 0.104
2-Oxoisovaleric酸	1.6 e 03 e-04±3.8	1.6 e 03 e-04±3.2	1.00 - 0.999
2-Aminoadipic酸	e-05 e-04 1.8±4.1	e-05 e-04 1.7±3.3	0.96 - 0.304
高香草酸	e-05 e-04 1.7±7.0	e-05 e-04 1.8±8.0	1.06 - 0.251
Pipecolic酸	e-04 e-04 8.1±4.0	e-04 e-04 7.7±3.8	0.96 - 0.276
马尿酸	e-04 e-04 5.4±3.7	e-04 e-04 4.6±3.3	0.85 - 0.022 *
蛋氨酸亚砜	e-04 e-04 5.4±1.8	e-04 e-04 5.4±1.6	0.99 - 0.893
Sufotyrosine	e-05 e-05 7.4±2.3	e-05 e-05 6.8±1.8	0.92 - 0.565
肌酸	1.3 e-02±7.0 e 03	1.2 e-02±5.6 e 03	0.93 - 0.218
肌酸酐	2.1 e-02±4.5 e 03	2.1 e-02±4.3 e 03	0.99 - 0.671
磷酸肌酸	e-05 e-05 8.7±2.6	e-05 e-04 1.0±2.3	1.16 - 0.047 *
Phosporylcholine	e-05 e-04 23.0±7.7	e-05 e-04 3.0±8.1	1.00 - 0.999
Glycerophosphocholine	e-04 e-04 3.3±1.2	e-05 e-04 3.0±8.9	0.89 - 0.362

胆碱	6.5 e 03±1.3 e 03		6.4 e 03±1.3 e 03	0.99 - 0.776
甜菜碱	2.3 e-02±4.6 e 03		2.3 e-02±4.8 e 03	0.99 - 0.642
g-Butyrobetaine	e-04 e-04 8.2±1.4		e-04 e-04 7.8±1.5	0.95 - 0.046 *
2-Hydroxyglutaric酸	e-05 e-04 1.5±5.3		e-05 e-04 1.7±4.2	1.10 - 0.365
胆汁酸
脱氧胆酸	e-05 e-05 5.9±4.4		e-05 e-05 5.5±4.1	0.93 - 0.413
鹅去氧胆酸	e-05 e-05 4.1±4.9		e-05 e-05 3.6±4.7	0.87 - 0.101
Taurodeoxycholic酸	e-06 e-06 8.7±9.4		e-06 e-06 5.5±6.2	0.63 - 0.110
Taurochenodeoxycholic酸	e-05 e-05 1.4±1.1		e-06 e-06 8.3±6.5	0.60 - 0.066
Glycochenodeoxycholic酸	e-05 e-05 8.8±6.0		e-05 e-05 5.7±3.8	0.65 - 0.046 *
Glycodeoxycholic酸	e-05 e-05 2.9±2.2		e-05 e-05 2.1±1.6	0.73 - 0.120
Glycoursodeoxycholic酸	e-05 e-05 1.2±1.1		e-06 e-06 9.3±7.4	0.78 - 0.313
类固醇及相关代谢物
皮质醇		e-05 e-05 8.0±3.3	e-05 e-05 7.3±2.3	0.91 - 0.371
可的松		e-06 e-05 1.9±6.8	e-06 e-05 1.9±5.7	1.00 - 0.963
孕烯醇酮硫酸盐		e-05 e-05 3.1±1.1	e-06 e-05 2.9±8.8	0.94 - 0.386
胆固醇硫酸		e-05 e-05 5.9±1.5	e-05 e-05 5.4±1.5	0.93 - 0.023 *
胆固醇		1.2 e 03 e-04±2.8	1.1 e 03 e-04±3.3	0.87 - 0.290
7-Dehydrocholesterol		e-06 e-06 9.5±2.9	e-06 e-06 8.8±2.2	0.93 - 0.578
Dehydroisoandrosterone 3-sulfate		1.0 e 03 e-04±3.0	1.1 e 03 e-04±2.8	1.08 - 0.004 * *
Etiocholan-3a-ol-17-one		e-06 e-06 7.1±3.7	e-06 e-06 7.9±3.8	1.12 - 0.058

Etiocholan-3a-ol-17-one硫酸	e-04 e-04 5.0±2.4	e-04 e-06 5.3±2.5	1.07 - 0.034 *
其他代谢物
葡糖酸	e-05 e-04 3.4±7.1	e-05 e-04 3.6±6.6	1.05 - 0.348
粘液酸	e-05 e-04 1.2±3.8	e-05 e-04 1.2±3.2	1.02 - 0.635
Threonic酸	1.9 e 03±1.2 e 03	2.2 e 03±1.3 e 03	1.15 - 0.014 *
三甲胺N-oxide	1.3 e 03 e-04±5.8	1.2 e 03 e-04±5.5	0.91 - 0.097
Indole-3-carboxaldehyde	e-06 e-05 1.9±6.1	e-06 e-05 2.0±5.1	1.06 - 0.295
3-Indoxysulfuric酸	e-04 e-04 5.7±2.9	e-04 e-04 5.8±3.3	1.03 - 0.631
a-Tocopherol	e-04 e-04 2.6±1.0	e-05 e-04 2.4±8.2	0.94 - 0.405
2-Hydroxybutyric酸	3.2 e 03±1.4 e 03	4.4 e 03±2.1 e 03	1.40 - 0.002 * *
3-Hydroxybutyric酸	4.8 e 03±7.2 e 03	6.4 e 03±8.3 e 03	1.32 - 0.099
*显著性差异p< 0.05,* *p< 0.01,t以及)。

OEA对接核受体PPAR-

OEA是一种脂肪酸酰胺，被认为是PPAR的内源性配体，可诱导脂解-14,20 -21];因此，我们推测EF暴露后血浆OEA水平的升高可能与血浆脂肪酸含量的变化有关。接下来，我们利用Sybyl-X2.0软件研究了OEA在PPAR-活性位点的结合模式。如图2所示，OEA与Ser280、Tyr314和Phe273形成氢键。结果表明，OEA将与PPAR-结合。

图2。位于PPAR-α活性位点的OEA的构象。(a) AZ242在PPAR-α中的结合方式。(b) OEA在PPAR-α中的结合方式。

人源性脂肪细胞基因表达分析

为了确定OEA与核受体PPAR-的对接是否反映了人类细胞功能的变化，我们使用Affymetrix genchip人类基因组U133 Plus 2.0阵列测试了OEA对基因表达的影响。在人皮下脂肪细胞中加入10M OEA显著影响了1013个基因的表达(556个上调，457个下调)。特别是，与脂质代谢过程相关的基因在OEA处理后发生了显著变化(表2)。

由于FAT/CD36、酰基辅酶a合成酶长链家族成员3 (ACSL3)和ACOX1是PPAR-响应基因，我们接下来通过qRT-PCR在mRNA水平证实了OEA(10M)对目的蛋白的影响。qRT-PCR显示FAT/CD36、ACSL3、HDLBP和ACOX1的表达分别增加约1.65倍、1.51倍、1.54倍和1.88倍(图3a-d)。我们进一步评估了PPAR-拮抗剂GW6471或PPAR-/拮抗剂GW9662是否能减弱oea刺激的ACOX1表达。OEA(10M)刺激的ACOX1反应被10M GW9662或10M GW6471几乎完全消除(图3e)。为了确定OEA对PPAR特异性的影响，我们下一步研究了OEA对PPAR-或PPAR-基因表达的影响。qRT-PCR检测结果显示，OEA(10M)处理后的患者增加了约1.6倍(图3f)。相比之下，PPAR-没有影响(图3g)。

图3。OEA对人类白色脂肪细胞基因表达的影响。qRT-PCR分析10 μ M OEA处理24 h人脂肪细胞的FAT/CD36 (a)、ACSL3 (b)、HDLBP (c)、ACOX1 (d)、PPARα (f)和PPAR-γ (g) mRNA。*表明OEA (10 μ M)处理细胞与载体(0.1% DMSO)处理细胞之间存在显著差异(*p < 0.05， **p < 0.01, t检验)。(e) GW6471对oea诱导的人脂肪细胞ACOX1表达激活的影响。在OEA (10 μ M)孵育前30min和孵育24 h时分别加入GW9662 (10 μ M)或GW6471 (10 μ M)，以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内对照。结果为平均值±sem (n = 3)。

表2。10 μ M OEA处理24 h后，人皮下脂肪细胞>基因表达变化为1.5倍或< 0.67倍

加入不。	基因符号		基因的描述	褶皱变化
脂质代谢过程
差异基因
NM_002732	PRKACG	蛋白激酶，camp依赖，催化，γ		8.04
NM_001243900	HDLBP	高密度脂蛋白结合蛋白		6.00
NM_000949	PRLR	催乳素受体		5.43
NM_001204051	SLC25A27	溶质载体族25个，成员27个		5.21
NM_022898	BCL11B	b细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤11 b		5.09
NM_000198	HSD3B2	羟丁二醇-5-甾体脱氢酶，3 -和甾体丁二醇异构酶		4.88
NM_002649	PIK3CG	磷酸肌苷-3激酶，催化，多肽		4.60
NM_004457	ACSL3	酰基辅酶a合成酶长链家族成员3		4.29
NM_018327	SPTLC3	丝氨酸棕榈酰转移酶，长链基亚基3		3.89
NM_002011	FGFR4	成纤维细胞生长因子受体4		3.84
NM_001098537	PNPLA7	Patatin-like磷脂酶结构域含有7		3.82
NM_001127178	贪婪的人	磷脂酰肌醇聚糖锚定生物合成，G类		3.73
NM_030791	SGPP1	sphingosine-1-phosphate磷酸酶1		3．55
NM_007253	CYP4F8	细胞色素p450，家族4，亚家族F，多肽8		3.45
NM_024419	PGS1	phosphatidylglycerophosphate合酶1		3.10
NM_203347	LCN15	lipocalin 15		3.04
NM_001040442	FABP6	脂肪酸结合蛋白6，回肠		2.79
NM_000778	CYP4A11	细胞色素p450，家族4，亚家族A，多肽11		2.75
NM_001185039	ACOX1	酰基辅酶a氧化酶1，棕榈酰		2.70
NM_018667	SMPD3	鞘磷脂磷酸二酯酶3，中性膜		2.64
NM_014602	PIK3R4	磷酸肌苷3激酶调节亚基4		2．51
NM_015879	ST8SIA3	ST8 -n -乙酰神经氨酸-2,8-唾液酸转移酶3		2.40
NM_024870	PREX2 因子2	phosphatidylinositol-3 4 5-triphosphate-dependent Raexchange		2.16
NM_012400	PLA2G2D	磷脂酶A2, IID组		2.16
NM_005050	ABCD4	atp结合盒亚家族D成员4		2.08
NM_001127458	CRLS1	心磷脂合成酶1		1.74
NM_198531	ATP9B	atp酶，II类，9B型		1.70
NM_001144772	NSMAF	中性鞘磷脂酶激活相关因子		1.69
NM_001144382	PLCL2	磷脂酶c 2		1.61
NM_000072	CD36	脂肪酸移位酶/ CD36		1.58
抑制基因
NM_001756	SERPINA6	丝氨酸肽酶抑制剂，进化支A，成员6		0.14
NM_000545	HNF1A	HNF1同源框一个		0.15
NM_024586	OSBPL9	羟甾醇结合蛋白样		0.16
NM_001831	俱乐部	clusterin		0.16
NM_022060	ABHD4	Abhydrolase结构域含有4		0.19
NM_032047	B3GNT5	UDP-GlcNAc: betaGal beta 1, 3-N-acetylglucosaminyltransferase 5		0.19
NM_153343	ENPP6	ectonucleotide焦磷酸酶/磷酸二酯酶6		０．２５
NM_015974	CRYL1	晶状体蛋白,λ1		０．２５
NM_006330	LYPLA1	溶血磷脂酶我		0.28
NM_001160147	DDHD1	dhd域，包含1		0.39
NM_153240	NPHP3	nephronophthisis 3(青少年)		0.44
NM_003080	SMPD2	鞘磷脂磷酸二酯酶2，中性膜		0.45
NM_016466	ANKRD23	锚定重复域23		0.54
NM_001039667	ANGPTL4	angiopoietin-like 4		0.55
NM_016174	CERCAM	脑内皮细胞粘附分子		0.56
NM_001101667	ACOX3	酰基辅酶a氧化酶3，羟苯甲酰		0.58
NM_003702	PPAP2A	2A型磷脂酸磷酸酶		0.59
NM_001143835	NFRKB	与kappa B结合蛋白相关的核因子		0.62
NM_003105	SORL1	sortilin相关受体，L (DLR类)A重复序列包含		0.64

讨论

本研究的结果清楚地表明，健康人体的血浆脂肪酸对急性EF暴露是敏感的。有趣的是，EF暴露后60%或更多的显著增加是血浆中的脂肪酸家族。相反，EF暴露后血浆中约30%的显著下降是酰基肉碱家族。值得注意的是，EF暴露似乎没有对健康志愿者的生理参数产生负面影响，至少在柠檬酸或鸟氨酸周期方面是这样。此外，应激反应激素皮质醇不受EF暴露的影响。我们的发现还澄清了EF暴露引起血浆OEA(一种脂肪酸乙醇酰胺)的增加。相比之下,LoVermeet al。低温暴露增加白色脂肪组织OEA含量，但不增加血浆[22]含量。因此，低温暴露和EF暴露的生理差异可能是不同的。另一方面，傅等．研究发现，24小时不进食导致[23]大鼠血浆(1.34倍)、肝脏(1.69倍)和白色脂肪组织(1.24倍)的OEA水平增加。本研究结果显示，EF暴露导致人体血浆OEA水平增加1.24倍。据报道，OEA是核受体PPAR-α的内源性配体，可诱导脂解[14,20,21]。因此，本研究观察到健康人血浆中脂肪酸水平的升高是合理的。目前还不清楚血浆OEA的增加是由肝脏、肠道和脂肪组织单独控制还是共同控制。

暴露于EF后观察到的OEA水平的变化是复杂的，可以用几种方法解释。据报道，电压感应与蛋白磷酸酶耦合，该酶负责从其磷酸化前体生成花生四烯醇乙醇酰胺(anandamide)[22-25]。因此，暴露于EF后OEA增加是可以想象的。然而，目前还不清楚类似的电压敏感磷酸酶是否可能参与OEA的生产。在未来的研究中，在调节脂肪酸酰胺OEA合成过程中，将肌醇磷酸磷酸酶与人体组织内的本征电压传感器耦合，评估其活性将是有意义的。

在本研究中，通过与Ser280、Tyr314和Phe273形成氢键来稳定OEA与PPAR-α的结合，而之前的研究报道了与Ser280和His440[26]的氢键结合。这种明显的差异可能是由于模型系统的差异;例如，1i7g(来自人PPAR-α与激动剂AZ242复合物的配体结合域晶体结构)和1k7l(来自人PPAR-α配体结合域与GW409544和一个辅激活肽结合的晶体结构)[26]。

本研究的另一个目标是通过大规模的基因表达分析来深入了解OEA影响的遗传成分。在人白色皮下脂肪细胞中，FAT/CD36、ACSL3、HDLBP、ACOX1和PPAR-α在OEA反应中上调。与PPAR-α相比，PPAR-γ没有影响。据报道，ACOX1、CYP4A11、ACSL3和FAT/CD36参与了PPAR-α激动剂[27]诱导的脂代谢基因。古斯曼et al。OEA给药[22]后大鼠脂肪组织中FAT/CD36、脂肪酸结合蛋白、解偶联蛋白-2和PPAR-α基因表达增加。在我们的研究中，PPAR-α拮抗剂GW6471可以抑制OEA对ACOX1 mRNA表达的响应。因此，OEA对人类脂肪细胞的刺激可能至少部分涉及PPAR-α信号级联。

Sirikulchayanonta的实验前测后测设计研究et al。EF暴露(30 min/d，持续30天)可降低41例中年[6]患者血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，增加高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。我们有理由推测OEA重复刺激可能通过PPAR-α核受体介导的通路缓解人类LDL-C和HDL-C的异常水平。Yanamotoet al。最近有报道称，EF治疗12个月后，人类志愿者的体重降低了[28]。虽然在本研究中没有进行重复的EF治疗，但EF治疗可能通过OEA激活PPAR-α信号通路，至少部分地诱导人类体重减轻。因此，有必要进一步研究ef诱导的oea依赖信号通路是否会影响潜在的治疗干预。

OEA可能作为一种激动剂或激活剂对瞬时受体电位-1型(TRPV1)、GPR119或GPR55具有额外的作用[29-34]。然而，EF暴露诱导的oea依赖的信号通路是否会影响昼夜节律性睡眠障碍和炎症性疼痛的缓解，还需要进一步的研究来阐明[35,36]。

结论:急性EF暴露对健康受试者血浆OEA水平有显著影响。在人皮下脂肪细胞中，OEA诱导的ACOX1基因表达对PPAR-α拮抗剂GW6471敏感。我们的发现不仅为理解EF疗法诱导健康价值的分子机制提供了一个清晰的例子，而且可能对替代药物疗法和电药物的发展具有重要意义。

相互竞争的利益

YN-Y、HH、AH受雇于白州健康科学研究所有限公司，TF受雇于Human Metabolome Technologies有限公司，TY受雇于Acel有限公司，AM受雇于World Fusion有限公司。所有其他作者都没有竞争的利益。

作者的贡献　

YN-Y设计并监督了这项研究，并撰写了手稿。YN-Y、HH、AH分别进行EF暴露和生化实验。TF进行代谢组分析。TY进行了基因芯片实验。AM进行了分子建模。所有作者阅读并批准了最终版本的手稿。

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