大阪大学药学院分子与细胞生理学研究室，大阪1-6，日本大阪顺田565-0871
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DOI: 10.15761 / IMM.1000187。
膀胱癌每年在全世界造成大约15万人死亡。然而，在过去的几十年里，在临床结果方面没有取得重大的改进;因此，需要一种有前景的治疗药物。最近的研究表明膀胱癌存在多种亚型，具有不同的分子特征。要为这种异质性癌症创造新的治疗方法，目标分子应该调节各种与癌症相关的信号通路。在这里，我们重点研究了致癌的miR-130家族(miR-130b, miR-301a和miR-301b)作为膀胱癌的新治疗靶点。通过8-mer微小锁定核酸(LNA)种子靶向抑制miR-130家族分子的药理作用，抑制了5637膀胱癌细胞的生长、迁移和侵袭，抑制了应激纤维的形成。此外，mir -130靶向的LNA抑制了FAK和Akt的磷酸化，导致两种蛋白磷酸酶的上调，磷酸酶和紧张素同源物和蛋白质酪氨酸磷酸酶，非受体11型。此外，miR-130家族靶向的LNA能显著抑制肿瘤生长在活的有机体内膀胱癌移植瘤模型。综上所述，miR-130家族靶向LNA有望成为一种有前途的膀胱癌治疗药物。
miR-130家族，锁定核酸，膀胱癌，PTEN, PTPN11
miR:微RNA;LNA:锁定核酸;FAK:局部粘附激酶;PTEN: 10号染色体上删除了磷酸酶和张力蛋白同源物;PTPN11:酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11型;UTR:未翻译区域
膀胱癌是世界范围内最常见的泌尿系恶性肿瘤，每年导致15万人死亡。最近的全基因组研究发现膀胱癌存在多种分子亚型[2-4]。Sjodahl等．通过对各级分期膀胱癌标本的mRNA表达分析确定了5个主要亚型。在这些亚型中，尽管尿基B型和鳞状细胞癌样的临床预后都很差，但它们的基因表达谱却有很大差异。不同的分子亚型表明膀胱癌是高度异质性的。因此，膀胱癌的治疗靶点应该包括调节广泛的癌症相关信号通路的基因。
MicroRNAs (miRNA)是一种小的非编码RNA分子，通过翻译后抑制或mRNA降解调节基因表达。在网上全基因组分析表明，超过60%的哺乳动物蛋白质编码基因是由miRNAs调控的[5,6]。因此，致癌性miRNAs可以调节广泛的肿瘤相关信号通路，并作为癌症治疗的治疗靶点受到重视[7-9]。多项研究表明，miRNA家族含有一个功能重叠的共同种子序列[10,11]，抑制miRNA家族成员显著影响肿瘤进展。miR-130家族(miR-130b, miR-301a和miR-301b)也被证明与癌症进展有关[12-14]。此外，我们最近发现miR-130家族在膀胱癌[15]中具有促瘤作用。因此，我们研究了种子靶向锁定核酸(LNA)对膀胱癌细胞药理抑制miR-130家族的效果。
我们在这里报告，miR-130家族靶向LNA抑制膀胱癌细胞的表型在体外而且在活的有机体内这表明miR-130家族靶向LNA有望成为一种有前景的膀胱癌治疗药物。
为了构建miR-130家族(miR-130b, miR-301a和miR-301b)、PTEN和PTPN11的报告质粒，使用以下寡核苷酸作为引物:
hsa - mir - 130 b;感觉5¢-CTAGCGGCCGCTAGTATGCCCTTTCATCATTGCACTGG-3¢,
反义5①-TCGACCAGTGCAATGATGAAAGGGCATACTAGCGGCCGCTAGAGCT-3①，hsa-miR-301a;义5①-CTAGCGGCCGCTAGTGCTTTGACAATACTATTGCACTGG-3①，反义5①-TCGACCAGTGCAATAGTATTGTCAAAGCACTAGCGGCCGCTAGAGCT-3①，hsa-miR-301b;义5①-CTAGCGGCCGCTAGTGCTTTGACAATATCATTGCACTGG-3①，反义5①-TCGACCAGTGCAATGATATTGTCAAAGCACTAGCGGCCGCTAGAGCT-3①，
囊1 -PTEN3 UTR;感觉5¢-GCGAGCTCGCTAAAGAGCTTTGTGATAT-3¢,
萨尔1 -PTEN3'- utr反义5ⅱ- gcgtcgacatgccatttttccatttcca -3ⅱ，Sac1-PTPN113¢utr;感觉5¢-TTGTGAGCTCTATTTTGCAGATTATGGGGA-3¢,萨尔1 -PTPN113¢utr;反义5¢-TTGTGTCGACCATTTGGCGACCAAAAACAC-3¢。对退火后的片段或PCR产物进行酶切囊我和萨尔I并插入pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体(Promega, Madison, WI, USA)。的3ⅱ- utrPTEN而且PTPN11利用KOD-FX (Toyobo, Osaka, Japan)从5637细胞的cDNA中克隆。
人尿上皮细胞系SV-HUC-1和人膀胱癌细胞系5637分别培养于F12K培养基(Wako, Osaka, Japan)和RPMI 1640培养基(Wako)中，添加10%热灭活胎牛血清和100 mg/L卡那霉素，37℃，5% CO2的气氛。
miR-130家族靶向LNA (UCACGUUA)和对照LNA (TCATACTA)由GeneDesign (Osaka, Japan)合成。按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)以50 nM的浓度转染这些LNAs。
用WST-1细胞生长试验检测细胞生长。miR-130家族靶向lnna转染的5637细胞被重新播种到96孔板(2 × 103.细胞/孔)转染后24小时，孵育指定时间。用WST-1试剂(日本大阪Dojindo)在37°C孵育1小时后，使用microplate阅读器(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)在450/630 nm波长(测量/参考)下读取光密度。
5637细胞在12孔板上播种24小时后转染miR-130家族靶向LNA4细胞/孔)孵育72小时。使用1毫升无菌移液管尖端在5637个细胞的单层中形成一个伤口，融合率约为90%。使用荧光显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)在创口后0和12小时记录细胞图像。
根据制造商协议，使用cim板和xCELLigence系统(Roche, Basel, Switzerland)测量细胞入侵。
全细胞裂解物用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF;Millipore, Billerica, MA, USA)膜使用半干转移系统(Bio-Rad)。按照指示用特异性抗体检测膜，然后用抗小鼠或兔免疫球蛋白的辣根过氧化物酶偶联抗体孵育(细胞信号技术公司，丹弗斯，MA, USA)，然后用增强化学发光western blotting检测试剂检测(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)。使用ImageQuant LAS4000迷你系统(GE医疗)检测化学发光。
本研究中使用以下抗体进行免疫分析:抗fak多克隆抗体(Sigma, St. Louis, MO, USA)，抗p- fak576(Sigma)抗akt (CST)抗p- akt473(Cell Signaling Technology)、抗pten多克隆(Cell Signaling Technology)、抗ptpn11多克隆(Santa Cruz Biotechnology, Inc.， Santa Cruz, CA, USA)和抗肌动蛋白多克隆抗体(Sigma)。
荧光显微镜观察:将培养的细胞置于微盖玻片上，4%甲醛固定，5%牛血清白蛋白和0.1% Triton X-100的封闭缓冲液在磷酸盐缓冲盐水中渗透。渗透细胞与一抗在4℃孵育过夜，然后在室温下氟铬偶联二抗孵育1 h。为了进行f -肌动蛋白染色，将渗透细胞与40 nM Acti-stain 488荧光Phalloidin (Cytoskeleton, Inc.， Denver, CO, USA)在室温下孵育3小时。接下来，用Dapi Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA)将覆盖层安装在载玻片上。使用DP70荧光显微镜(Olympus)获得荧光图像。
采用pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体进行3ⅰ-UTR荧光素酶报告基因分析(Promega)。5637细胞共转染miR-130家族处理的LNA和含有预测miR-130家族结合位点的靶基因3ⅰ-UTR报告结构。转染24小时后，根据制造商的方案(Promega)进行双荧光素酶报告检测。荧光素酶活性测定使用光度计(Turner Biosystems 20/20光度计;Promega)。
5637细胞(1´107细胞/小鼠)皮下移植到8周龄雌性BALB/c nu-nu小鼠。观察肿瘤生长情况后，将荷瘤小鼠分为肿瘤体积相等的2个治疗组(n=5/组)。使用Atelocollagen (Koken, Tokyo, Japan)作为传递载体，这是一种非常有效的药物传递系统，可以将小干扰RNA和LNA分子送入肿瘤在活的有机体内(16、17)。个体小鼠被注射200 μ L的植骨胶原蛋白，其中含有2纳摩尔的miR-130家族靶向LNA或阴性对照LNA (hplc纯化)在活的有机体内级放大器)。在第1、7、14和21天注射LNA/去部位胶原复合物。每周测量两次肿瘤体积，并用以下公式评估:肿瘤体积[mm3.=(长轴[mm]) ×(小轴[mm])2×0.5。数据以五次独立实验的平均值±标准差表示。
结果用平均值±标准差表示，对值之间的差异用Student 's进行统计分析t-test或Bonferroni事后检验的单向方差分析(GraphPad Prism 5.0, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)。一个p-value < 0.05为差异有统计学意义。
为了通过一个核苷酸分子抑制miR-130家族(miR-130b, miR-301a，和miR-301b)的功能，我们设计了一个8-mer miR-130家族靶向LNA (UCACGUUA)，其序列与核苷酸位置2-9互补，包含miR-130家族的共同种子序列(图1A)。通过包含每个miR-130家族结合序列的双荧光素酶报告实验，在膀胱癌细胞系5637中研究miR-130靶向LNA的功能，该细胞系在正常尿路上皮细胞系(SV-HUC-1)和六种膀胱癌细胞系(RT4, UM-UC-2, T24, eje -1, J82和5637)[15]中显示了miR-130家族分子的最高表达。miR-130靶向的LNA通过与miR-130家族靶序列结合成功抑制了荧光素酶活性(图1B)。因此，我们使用这个8-mer种子靶向LNA对5637个膀胱癌细胞进行进一步的功能分析。
图1。5637个膀胱癌细胞中miR-130家族靶向LNA的设计及功能验证。(一);miR-130家族靶向LNA的设计与miR-130家族中共享共同种子序列的2-9个核苷酸位置互补(开框)。(B);包含miR-130b、miR-301a或miR-301b (50 ng)完美匹配靶位点的MiR-130家族报告载体与50 nM的MiR-130家族靶向LNA或阴性对照LNA共转染到5637细胞中。荧光素酶活性测定采用双报告物测定系统。数据以三次以上独立实验的平均值±标准差表示。＊p< 0.05， **p< 0.01。
为了评估其抗癌潜力，我们在5637个细胞中检测了miR-130家族靶向LNA对细胞生长、迁移和侵袭的影响。虽然我们观察到对正常尿路上皮细胞系SV-HUC-1的细胞生长没有影响(图2A)，但mir -130靶向的LNA显著抑制了5637细胞的细胞生长、迁移和侵袭(图2B-D)。因为我们发现miR-130家族分子促进膀胱癌细胞的运动通过应力纤维的形成和聚焦粘附激酶(FAK)在Tyr的磷酸化576Akt在Ser473[15]，我们接下来检查了mir -130靶向LNA对应力纤维形成的影响。与对照的lnna转染细胞相比，mir -130靶向LNA转染的5637细胞中的应力纤维形成明显受到抑制(图3A)。此外，我们评估了mir -130靶向的LNA对FAK和Akt磷酸化的影响。在5637细胞中，mir -130靶向的LNA显著降低了FAK和Akt的磷酸化水平(图3B)。接下来，为了确定mir -130靶向LNA的靶点，我们利用靶点预测程序(miRBase和microRNA.org)，重点关注PTEN和PTPN11作为潜在的靶基因。PTEN是PI3K/Akt信号通路的负调控因子[18,19]，PTEN[20]和PTPN11[21]均可对FAK中的酪氨酸残基进行脱磷。然后，我们使用含有两个基因的3ⅰ-UTR区域的报告载体，在双荧光素酶报告实验中确认PTEN和PTPN11是否为mir -130靶向LNA的靶分子(补充图S1)。与阴性对照LNA共转染的PTPN报告载体PTEN的荧光素酶活性明显低于单独转染的模拟报告载体。通过与mir -130靶向的LNA共转染来挽救活性(图3C)。免疫印迹分析显示，在5637细胞中，PTEN和PTPN11都增加了转染mir -130靶向的LNA(图3D)。 These data suggest that miR-130 family-targeted LNA suppressed the phosphorylation of FAK and Akt and stress-fiber formation by restoring PTEN and PTPN11 expression that had been down-regulated by miR-130 family molecules.
图2。MiR-130家族靶向LNA抑制5637细胞的生长、迁移和侵袭。用WST-1法测定miR-130家族靶向LNA对SV-HUC-1 (A)或5637 (B)细胞生长的影响。（C）;用伤口愈合试验测定细胞迁移。转染后60小时刮痧形成创面，12小时后测量细胞相对迁移）;转染后72小时，使用xCELLigence实时细胞监测系统进行侵袭试验。在所有实验中，转染50 nM的miR-130家族靶向LNA。数据为4个(A)， (B) 9个，或(C) 3个(D)独立实验的平均值±标准差。**p< 0.01;＊＊＊p< 0.001。
图3。miR-130家族靶向LNA对5637细胞中应激纤维形成及FAK和Akt磷酸化的影响。(一);用phalloidin染色F-actin观察应力纤维的形成。(B);FAK在Tyr的磷酸化576Akt在Ser473采用western blot检测。(C);在5637个细胞中进行双荧光素酶报告试验。细胞与LNA和报告质粒共转染，报告质粒包含PTEN或PTPN11 3 ' -UTR中预测的miR-130家族结合位点。(D);western blot检测PTEN和PTPN11蛋白表达水平。数据为三次(B)或五次(C)独立实验的平均值±标准差。＊p< 0.05;**p< 0.01;＊＊＊p< 0.001。
最后，在小鼠中检测了miR-130家族靶向LNA的抗肿瘤活性异种移植5637细胞模型。皮下给药mir -130靶向LNA显著抑制了对照组LNA后肿瘤体积的增加(图4)。mir -130靶向LNA的抗肿瘤活性是根据第27天切除肿瘤重量的减少来确定的。这些结果表明miR-130家族靶向LNA可能是一种新的膀胱癌核酸治疗方法。
图4。MiR-130家族靶向LNA抑制肿瘤生长体内。对照LNA和miR-130家族靶向LNA以2 nmol/鼠的剂量给5637只细胞异种移植小鼠。(一);相对肿瘤体积计算公式为:肿瘤体积[mm]3.=(长轴[mm]) ×(小轴[mm])2×0.5。第27天(B)切除的肿瘤被称重(C)。数据为平均值±标准差(n = 5)p< 0.05。
在本研究中，我们基于miR-130家族的种子序列设计了8-mer微型LNA，并证明了miR-130靶向LNA对miR-130家族分子对PTRN和PTPN11的调控具有抑制作用。此外，mir -130靶向的LNA被发现具有显著的抗肿瘤活性。
PTEN在包括膀胱癌在内的多种癌症中，通过脂质磷酸酶活性负调控PI3K/Akt信号通路，发挥抑癌作用[19,20]。在膀胱癌中，PTEN的失活被认为是从非侵入性肿瘤向侵入性肿瘤进展的一个触发因素[23,24]，以及两者的尿路上皮特异性缺失p53而且pten导致小鼠浸润性膀胱癌[25]。PTEN作为一种双特异性蛋白磷酸酶调节细胞运动途径在体外[26]。我们之前在5637个细胞中观察到PTEN过表达对细胞迁移的抑制作用(未发表数据);这些结果表明，PTEN具有抑制膀胱癌细胞运动和肿瘤转移的潜力。虽然在肌肉浸润性膀胱癌[27]中，PTEN基因主要通过杂合性缺失(LOH)缺失而缺失，但在仅有24.5%的膀胱癌标本中检测到PTEN区域的LOH。因此，我们预测在膀胱癌中存在PTEN调控的替代机制，miR-130家族可能作为PTEN表达的替代上游因子。
与PTEN相比，PTPN11在膀胱癌中的生理意义尚不清楚。这是第一个表明PTPN11是细胞迁移的负调控因子，抑制膀胱癌细胞中FAK活性和应激纤维形成的研究。使用显性阴性突变体[28]或药理抑制剂[29]对PTPN11的功能抑制会导致应力纤维的形成和局部粘附。此外，过表达FAK可增加细胞迁移[30-32]，抑制FAK- paxilin信号通路可减少肿瘤转移在活的有机体内[33]。因此，miR-130家族靶向LNA可能通过调节FAK信号通路影响膀胱癌细胞的转移通过靶向PTEN和PTPN11的表达。
与“经典的”细胞毒性药物相比，最近开发的分子靶向药物在减少副作用的同时对癌症患者有很多好处。然而，随着时间的推移，癌症会对分子靶向药物产生耐药性。为了避免这种后果，需要多靶向药物来抑制许多与癌症相关的信号通路。事实上，与伊马替尼相比，达沙替尼(一种多激酶抑制剂)对慢性髓系白血病患者的临床疗效更好。在晚期膀胱癌中，在患者来源的膀胱癌异种移植模型中测试了双PI3K/mTOR抑制剂(PF-04691502)和MEK抑制剂(PD-0325901)的组合，结果是肿瘤生长[34]明显减少。因此，多靶点策略对于治疗高度异质性的癌症是有效的。
综上所述，具有不同靶基因的miRNAs是癌症治疗的有效治疗靶点。尽管单个miRNA通常靶向100-200个基因[35,36]，但对每个靶基因的翻译抑制作用被认为非常弱。因此，针对一个在癌症中具有重叠功能的miRNA家族，可以广泛而强大地抑制癌症相关信号通路[37]。脱壳等．表明使用种子靶向LNA完全抑制miR-15家族成员比单独抑制每个miRNA[38]诱导更有效的靶基因去抑制。在miR-33和miR-34家族中也观察到类似的结果[39,40]。因此，与单独抑制单个miRNA相比，通过一个微小的LNA靶向miRNA家族的一个种子区域有望增强功能输出。
在过去的20年里，膀胱癌治疗领域没有取得重大突破。因此，膀胱癌急需新型药物。这是第一篇证明种子靶向LNA在膀胱癌中对miRNA家族的药理抑制作用的报道。尽管大量的LNA聚集在肾脏和肝脏的[41]中，一些研究已经证明了有效的LNA输送到矫形膀胱癌通过尿路[42,43]。综上所述，miR-130家族靶向LNA可能是一种有前景的膀胱癌核酸治疗剂。
K. Tsujikawa报道了从第一三共、富士和田边三菱获得的商业研究资助。其他作者没有披露潜在的利益冲突。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年11月20日
录用日期:2015年12月4日
出版日期:2015年12月08日
©2016 Egawa H.这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可条款发布，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Egawa H, Jingushi K, Hirono T, Hirose R, Nakatsuji Y，等(2016)miR-130家族种子靶向LNA对膀胱癌的药理调控作用。整合分子医学3:DOI: 10.15761/ im .1000187。
本研究部分得到了文部科学省(MEXT)的药物发现和生命科学研究支持平台项目(药物发现、信息学和结构生命科学平台)和日本科学技术厅(JST)通过目标驱动研发的适应性和无缝技术转移计划的支持。
大阪大学药学院分子与细胞生理学研究室，日本大阪顺田市山冈1-6,565-0871，电话:+81-6-6879-8192;传真:+ 81-66879-8190
图1。5637个膀胱癌细胞中miR-130家族靶向LNA的设计及功能验证。(一);miR-130家族靶向LNA的设计与miR-130家族中共享共同种子序列的2-9个核苷酸位置互补(开框)。(B);包含miR-130b、miR-301a或miR-301b (50 ng)完美匹配靶位点的MiR-130家族报告载体与50 nM的MiR-130家族靶向LNA或阴性对照LNA共转染到5637细胞中。荧光素酶活性测定采用双报告物测定系统。数据以三次以上独立实验的平均值±标准差表示。＊p< 0.05， **p< 0.01。
图2。MiR-130家族靶向LNA抑制5637细胞的生长、迁移和侵袭。用WST-1法测定miR-130家族靶向LNA对SV-HUC-1 (A)或5637 (B)细胞生长的影响。（C）;用伤口愈合试验测定细胞迁移。转染后60小时刮痧形成创面，12小时后测量细胞相对迁移）;转染后72小时，使用xCELLigence实时细胞监测系统进行侵袭试验。在所有实验中，转染50 nM的miR-130家族靶向LNA。数据为4个(A)， (B) 9个，或(C) 3个(D)独立实验的平均值±标准差。**p< 0.01;＊＊＊p< 0.001。
图3。miR-130家族靶向LNA对5637细胞中应激纤维形成及FAK和Akt磷酸化的影响。(一);用phalloidin染色F-actin观察应力纤维的形成。(B);FAK在Tyr的磷酸化576Akt在Ser473采用western blot检测。(C);在5637个细胞中进行双荧光素酶报告试验。细胞与LNA和报告质粒共转染，报告质粒包含PTEN或PTPN11 3 ' -UTR中预测的miR-130家族结合位点。(D);western blot检测PTEN和PTPN11蛋白表达水平。数据为三次(B)或五次(C)独立实验的平均值±标准差。＊p< 0.05;**p< 0.01;＊＊＊p< 0.001。
图4。MiR-130家族靶向LNA抑制肿瘤生长体内。对照LNA和miR-130家族靶向LNA以2 nmol/鼠的剂量给5637只细胞异种移植小鼠。(一);相对肿瘤体积计算公式为:肿瘤体积[mm]3.=(长轴[mm]) ×(小轴[mm])2×0.5。第27天(B)切除的肿瘤被称重(C)。数据为平均值±标准差(n = 5)p< 0.05。
