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DOI: 10.15761 / IMM.1000227。
真皮乳头细胞(DPCs)在毛囊的生理发育中起着重要作用。毛发的动态生长是通过良好的细胞间通讯来实现的。结果表明，在椭球体形成时，DPCs的相互作用特性更加显著。然而，激活的分子基础仍不清楚。在这里，我们展示了DPCs的感觉细胞器，即初级纤毛，在细胞间与其他细胞相互作用中的新功能。
当初代纤毛的形成受到抑制时，dpc条件培养基对其他间充质间质细胞增殖的促进作用减弱。在相同条件下，DPCs中FGF10基因表达下调。这些结果表明，初级纤毛参与了生长因子的产生，而生长因子反过来又能促进细胞的生长。与单层细胞相比，球形DPCs的初级纤毛明显较长。因此，微球比二维培养的细胞更有效地支持受体细胞的生长。但随着球体尺寸的增大，扩散效率逐渐降低。有趣的是，在较大的球体中，初级纤毛的出现频率减少，而残余细胞器的长度保持不变。
总的来说，我们目前的研究结果表明，DPCs调节初级纤毛的长度和出现频率，细胞通过它调节信号分子的产生，从而与其他细胞进行交流。
DPC:真皮乳头细胞;siRNA:小干扰RNA;DCM: dpc条件培养基;siKif3a: Kif3a-siRNA
真皮乳头细胞;初级纤毛;FGF10;球体;细胞间信号;毛囊
真皮乳头细胞(Dermal papilla cells, DPCs)通过分泌各种细胞间信号分子与表皮细胞和间充质细胞进行交流，在毛发生长发育过程中发挥重要作用[1,2]。通过形成类似于真皮乳头[3]生理结构的球状微组织，毛发诱导活性得以恢复。结果表明，三维球形DPCs表达了更高水平的细胞间信号基因，如wnt，骨形态发生蛋白和fgf，与二维单层DPCs相比[4,5]。
初生纤毛作为哺乳动物细胞的信号中枢，受到了广泛的关注。据报道，细胞器通过Wnt-， FGF-或pdgf参与的途径协调分子信号通路[6]。研究表明，真皮细胞的原毛对小鼠毛囊形态发生至关重要:当真皮细胞中的Kif3a或Ift88被敲除时，小鼠表现出严重的毛囊缺失。然而，DPCs的初级纤毛在细胞间信号传导中的直接作用仍有待阐明。此外，细胞器在头发生长周期中的作用尚不清楚。
在这项研究中，我们使用小干扰技术和检测球形DPCs，我们发现DPCs的初级纤毛参与调节与其他细胞的细胞间信号传导。
2名高加索女性的人原代DPCs购自PromoCell(海德堡，德国)。细胞在添加4%胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中常规生长。3T3-L1成纤维细胞(一种间充质来源的细胞系)在添加10% FCS的DMEM中得以维持。分别加入50 U/ml青霉素和50 μg/ml链霉素。细胞保存在5%的CO中2大气压37度°C。
将DPCs置于超低附着板(Corning Inc.， New York, USA)上，细胞密度为0.5-3.0 × 104细胞/。3天后，将所得球体进行免疫荧光染色或测定细胞数量(如下所述)。
为了从经过sirna处理的DPCs中制备DCM，在下面的小节中进行了sirna脂肪转染。孵育24小时后收集DCM。dcm在使用前10000 x g离心澄清3分钟。
收获DCM后，DPCs在37℃下用胰蛋白酶/EDTA处理。收集细胞，2000 x g离心1 min，再悬浮于DMEM中，500 μg/ml MTT处理。孵育4小时后，使用ImageJ软件在显微镜下计数染色细胞的数量。最后，将细胞溶解在二甲亚砜中，以测定MTT活性，如下所述。
为了抑制初级纤毛的形成，按照以下程序进行了sirna介导的Kif3a基因沉默。dpc(3×104细胞/孔)用20 nM的Kif3a-siRNA低聚物(序列5'-AAG ACC UGA UGU GGG AGU U-3')或对照siRNA (Allstars阴性对照siRNA，编号1027280,Qiagen, Chatsworth, CA, USA)使用Oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)进行脂质转染。孵育24小时后，换入新鲜的DMEM，细胞进一步培养24小时后固定。
将DPCs(传代6)接种于胶原包被盖片上，培养2天。用4%多聚甲醛在室温下固定细胞30分钟。磷酸缓冲盐水(pH 7.4)洗涤后，用小鼠抗乙酰化α-微管蛋白抗体(克隆6-11B-1;Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国;1:5,000稀释)。中心体标记物(兔抗γ-微管蛋白，T3559;Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国;1:5 000稀释)用于发现初级纤毛的起源。Alexa Fluor 555偶联山羊抗小鼠IgG抗体(Molecular Probes, Eugene, OR, USA;1:10 00稀释)和Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG抗体(Molecular Probes, Eugene, OR, USA; 1:1,000 dilution) were used as secondary antibodies. Hoechst 33342 (Dojin Kagaku, Kumamoto, Japan) was used to visualize nuclei.
免疫染色的DPCs在Eclipse E800显微镜(Nikon, Tokyo, Japan)下检测。利用ImageJ软件对平行于聚焦平面的初级纤毛图像进行分析。在两个独立的实验中，对初级纤毛(n = 50到100多个)进行了检查。
DPCs和3T3-L1成纤维细胞分别作为供体细胞和受体细胞。3T3-L1成纤维细胞(1×103.细胞/孔)在DCM和新鲜DMEM的混合物中以4:1的比例培养48小时。细胞用500 μg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT, Dojin Kagaku, Kumamoto, Japan)处理。孵育4小时后，将细胞溶解在二甲亚砜中。使用Multiskan FC微孔板光度计(Thermo scientific, Waltham, MA, USA)在570 nm波长处测量吸光度，参考波长为650 nm。
信号传导效率定义为受体细胞与DPCs的增殖活性之比，计算公式为(A)1——一个0) /DP．缩写:1，在DCM中培养的受体细胞的吸光度;一个0，在无dpc的对照培养基中培养的受体细胞的吸光度;一个DP，供体DPCs吸光度。
根据制造商的说明，分别使用ReliaPrep™RNA Cell Miniprep System (Promega, Madison, WI)、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japan)进行总RNA提取、cDNA合成和实时PCR。以下引物购自Takara (Osaka, Japan): FGF10正向引物，5 ' -GCA TGT GCG GAG CTA CAA TCA-3 ';反向引物，5 ' -ACG GCA ACA ACT CCG ATT TCT AC-3 '。
数据以平均值+/- SD表示。使用Kaleidagraph软件(Synergy software, Reading, PA)进行数据分析。对于初级纤毛长度，由于数据的偏斜性，进行了非参数统计分析(Mann-Whitney U检验)。在另一种分析中，采用双尾方法。
未处理和对照sirna处理的DPCs的初级纤毛平均长度分别为2.2±1.2 μm和1.6±0.9 μm，与其他哺乳动物细胞[8]的观察结果相似。kif3 - sirna处理的DPCs显示出极短的原代纤毛(0.6±0.6 μm，图1C, D)。为了研究原代纤毛在细胞间信号传导中的作用，我们将DCM添加到3T3-L1成纤维细胞中，并测定受体细胞的增殖情况。用sikif3a处理供体细胞后，受体细胞的细胞增殖受到严重抑制(图1E)。结果表明，原纤毛参与产生促进成纤维细胞生长的信号因子。事实上，实时PCR分析显示，在sikif3a处理的DPCs中，FGF10的基因表达明显降低(图1F)。生长因子是增强成纤维细胞和其他细胞增殖的首选候选因子。
数字1.DPCs细胞间信号通过初级纤毛的调控。用抗乙酰化α-微管蛋白抗体(红色)观察初级纤毛。细胞核用Hoechst 33342染色(蓝色)。比例尺= 10 μm。(A)未经处理的DPC;(B)阴性对照siRNA (siCont);(C) Kif3a-siRNA (siKif3a)。(D) kif3a敲低使初级纤毛缩短。(E) DPCs的原毛调节其他成纤维细胞的增殖。将基于sirna的dcm转移到3T3-L1成纤维细胞培养中，2天后定量受体细胞的细胞增殖情况。(F)初级纤毛参与FGF10的基因表达。 Real-time PCR quantitation was performed in the control and the siKif3a-treated DPCs. Data are represented as the mean +/- SD. * and ** indicateP与对照组相比，-值分别<0.05和< 0.001。
有可能sp2021版权归OAT所有。由于DPCs在球体形成时获得毛发诱导活性，因此信号转导。为了进一步了解初级纤毛的生理作用，测定了不同细胞密度的DPC球体中细胞器的长度和出现频率。在这个范围内，DPC球体的初级纤毛明显长于单层DPC(图2A, B)。在细胞密度较低的情况下，dp球体的初级纤毛出现频率高于单层DPC。然而，随着细胞数量的增加，出现频率急剧下降。为了重新探索原纤毛的信号相关功能，我们利用球源性DCM检测受体3T3-L1成纤维细胞的增殖活性。由于内细胞在球形[10]中活性较低，因此计算了球形和单层dpc的信号传导效率。如图2C所示，在很宽的细胞密度范围内，球形DPCs显示出更高的信号效率。在较低的细胞密度(< 1.0 × 10)下，效果明显4细胞/)。然而，在较高的密度下，它变得不那么明显，在球体中，初级纤毛的出现频率变得更小。
数字2.球状体的DPCs显示出延长的初级纤毛和有效的信号传导效率。(A)球形DPCs初级纤毛的免疫细胞化学。采用抗乙酰化α-微管蛋白(红色)、抗γ-微管蛋白(绿色)抗体和Hoechst 33342染料(蓝色)。比例尺=10 μm。DPC球的相衬图像(插图，比例尺=100 μm)。(B)初级纤毛的长度和出现频率。蓝色圆和红色圆分别代表单层和球状DPCs的纤毛长度。开放的蓝色三角形和封闭的红色三角形分别表示单层和球形DPCs中初级纤毛的出现频率。(C) DPC球体比DPC单层具有更高的信号效率。采用球形DPCs和单层DPCs制备dcm。3T3-L1成纤维细胞与这些条件培养基孵育。 Then, the cellular proliferations of the acceptor fibroblasts were estimated 2 days later. The proliferation activity of 3T3-L1 fibroblast per viable DPC are plotted as signaling efficiency. Red circles, DPC spheroid; blue circles, DPC monolayer. (D) A proposed model. DPCs tune the length and the appearance frequency of the primary cilia, by which the cells regulate the production of signaling factors (arrows). The outer DPCs are active, while the inner DPCs are relatively quiescent.
我们证实球形DPCs表达更高水平的信号分子mRNA，如FGF10、Wnt5a、BMP2和FGF7(未发表的数据)。这些分子可能参与球形DPCs的有效细胞间信号传导。基于目前的研究结果，我们认为球形DPCs的信号效率是通过调节初级纤毛的长度和出现频率来调节的。详细的机理有待于进一步研究，通过解剖不同大小的球体的内、外dpc。
据报道，在光感受器膜[11]的更新过程中，光感受器细胞从纤毛远端释放老化的盘状膜。在衣藻,鞭毛释放含有酶的纤毛囊，以便从母细胞壁上孵化。然而，据我们所知，初级纤毛是否能介导哺乳动物细胞中信号分子的产生和/或分泌尚不清楚。在这项工作中，我们发现FGF10的基因表达在sikif3a处理的DPCs中降低，并且来自相同细胞的DCM表现出受体细胞的增殖活性降低。因此，我们认为DPCs的初级纤毛参与了信号因子的产生和/或分泌。在我们目前的模型中，DPCs通过初级纤毛调节周围细胞的增殖活性，如真皮鞘细胞、真皮成纤维细胞、脂肪细胞和毛基质细胞(图2D)。我们希望我们的发现将有助于开发头发生长和毛囊再生的新策略。
我们要感谢Hiroyuki Watanabe先生和Pravini Wickramanayake女士在英文编辑方面的协助。
作者声明本文不存在任何利益冲突。
KK设计并监督了这项研究。KM, MS和CM进行实验。KM和KK写了手稿。所有作者都已阅读并认可了手稿的最终版本。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2016年6月5日
接受日期:2016年6月21日
出版日期:2016年6月24日
©2016 Matsushima K.这是一篇根据知识共享署名许可条款发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
张春华，李春华，李春华，等(2016)毛囊细胞间信号转导的研究进展。integrated Mol Med 3: DOI: 10.15761/IMM.1000227。
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数字1.DPCs细胞间信号通过初级纤毛的调控。用抗乙酰化α-微管蛋白抗体(红色)观察初级纤毛。细胞核用Hoechst 33342染色(蓝色)。比例尺= 10 μm。(A)未经处理的DPC;(B)阴性对照siRNA (siCont);(C) Kif3a-siRNA (siKif3a)。(D) kif3a敲低使初级纤毛缩短。(E) DPCs的原毛调节其他成纤维细胞的增殖。将基于sirna的dcm转移到3T3-L1成纤维细胞培养中，2天后定量受体细胞的细胞增殖情况。(F)初级纤毛参与FGF10的基因表达。 Real-time PCR quantitation was performed in the control and the siKif3a-treated DPCs. Data are represented as the mean +/- SD. * and ** indicateP与对照组相比，-值分别<0.05和< 0.001。
数字2.球状体的DPCs显示出延长的初级纤毛和有效的信号传导效率。(A)球形DPCs初级纤毛的免疫细胞化学。采用抗乙酰化α-微管蛋白(红色)、抗γ-微管蛋白(绿色)抗体和Hoechst 33342染料(蓝色)。比例尺=10 μm。DPC球的相衬图像(插图，比例尺=100 μm)。(B)初级纤毛的长度和出现频率。蓝色圆和红色圆分别代表单层和球状DPCs的纤毛长度。开放的蓝色三角形和封闭的红色三角形分别表示单层和球形DPCs中初级纤毛的出现频率。(C) DPC球体比DPC单层具有更高的信号效率。采用球形DPCs和单层DPCs制备dcm。3T3-L1成纤维细胞与这些条件培养基孵育。 Then, the cellular proliferations of the acceptor fibroblasts were estimated 2 days later. The proliferation activity of 3T3-L1 fibroblast per viable DPC are plotted as signaling efficiency. Red circles, DPC spheroid; blue circles, DPC monolayer. (D) A proposed model. DPCs tune the length and the appearance frequency of the primary cilia, by which the cells regulate the production of signaling factors (arrows). The outer DPCs are active, while the inner DPCs are relatively quiescent.
