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摘要

该研究旨在测试孕激素减弱胎儿对感染的炎症反应的假设。将妊娠期(第17天)的sd大鼠随机分为以下治疗组:1)生长培养基阴性对照，2)大肠杆菌接种(1 × 10⁷积极控制，3)大肠杆菌+头孢曲松(20 mg/kg/天)，4)大肠杆菌+头孢曲松+孕酮(50 mg/kg/天)，5)大肠杆菌+孕激素。记录幼崽的生存数据和出生体重，评估大脑组织中TNF-α和IL-1β的水平。与阳性对照组相比，黄体酮/抗生素或黄体酮单一治疗(4-5组)提高了幼犬的生存率。(p=.001)，活产儿体重(p=.001)，并导致胎儿大脑细胞因子(TNFα， p=.001)水平降低。001， .01 -组4-5)，(IL-1β， p=。001， .01 -组4-5)。当大肠杆菌+抗生素治疗组(第3组)与第4组和第5组相比，幼犬存活率和出生体重均有改善(p=.001)，细胞因子表达也有改善。孕激素治疗可有效提高实验性感染水坝所生幼崽的存活率和出生活重。孕激素可能对炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的感染介导的神经损伤提供保护。

简介

在美国，早产的发生率保持在11%以上，是妊娠最常见的并发症之一[1]。此外，早产仍然是围产期死亡的主要原因，占新生儿发病率的75%。所有来源一致认为，17- α羟基黄体酮(17P)推荐用于单胎妊娠和有过自发性早产史的患者的治疗，从妊娠20-34周开始，对有过自发性早产史的患者每周进行产妇注射，这导致了早期分娩率的显著下降和治疗对象的出生体重的增加[3]。

虽然早产的原因有很多，但据信32周前的许多自然分娩与[4]感染有关。细胞因子作为早产启动因子的作用已被充分描述，在感染妇女中促炎细胞因子升高[5,6]。此外，有关胎儿炎症反应综合征(FIRS)的文章证实了促炎细胞因子升高与脑瘫和新生儿脑损伤之间的关系[7,8]。在大多数情况下，FIRS的发生并没有新生儿感染的证据，但分娩过程往往与促炎细胞因子有关，这表明早产、炎症细胞因子和许多与早产相关的新生儿并发症[9]之间存在联系。孕酮已被证明对炎症反应和细胞因子[10]的产生有抑制作用。

本研究的目的是在大鼠模型中研究孕酮对感染和非感染孕鼠大脑细胞因子产生的影响。

材料与方法

该研究获得了动物法规办公室和密西西比大学医学中心机构审查委员会的批准。该大学的动物保护和使用机构委员会(IACUC)也批准了所有实验程序之前的开始。44只定时怀孕的Sprague Dawley大鼠从Harlan Sprague Dawley(印第安纳波利斯，IN)购买。到达后，动物们有相似的亮/暗时间周期，可以随意获得食物/水。所有大鼠静置4天稳定后再进行实验。动物被随机分配到以下处理组:1)培养基-(阴性对照)，2)大肠杆菌-(阳性对照1 × 10⁷CFU) 3)大肠杆菌+头孢曲松(20 mg/kg/天)大肠杆菌+头孢曲松+孕酮(50µg/kg/day)， 5)大肠杆菌+孕激素。孕激素的剂量被选择为与人类妊娠中使用的剂量接近。

妊娠第17天，所有孕妇均接受中线剖腹手术，使用5%异氟醚全身麻醉。子宫体外取出，计数并记录幼崽总数。0.1mL肉汤(阴性对照- 1组)或0.1mL (1 × 10⁷CFU)大肠杆菌(阳性对照组- 2组)注射于子宫角分叉处。在第三到第五组，大肠杆菌在手术过程中也以类似的方式注射。手术完成后，在子宫回到其解剖位置后，使用延迟可吸收缝线连续运行缝合切口。研究中随机分配到孕激素组的动物(第4组和第5组)被皮下植入一个预启动和负载的微型渗透泵(Alzet微型泵#1007D, DURECT公司，Cupertino CA)。将一根唾液导管连接到泵上并插入腹膜腔，用于总孕酮(50 mg/kg/天)的输送。第3组和第4组动物每天注射抗生素(20 mg/kg)，直到分娩。

治疗后，研究人员每天对水坝进行两次观察。记录每个处理组每窝活幼崽的数量和它们的出生体重。在出生后第2天，每窝随机选取3只幼崽牺牲。取出大脑，放入10毫升冷PBS中进行均质。大脑匀浆保存在-8°C，直到分析。使用细胞因子特异性试剂盒(eBioscience, San Diego, CA)使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-1β和TNF-α的浓度。脑匀浆也进行Lowery蛋白分析，并对细胞因子值进行校正，并表示为细胞因子/mg蛋白质的图示。

数据呈正态分布，以均数±标准差(SD)表示。使用Sigma Plot对Windows版本13.0进行统计分析(Systal Software, Inc。圣何塞，加利福尼亚州)。适当时采用双尾t检验和单因素方差分析。<0.05的概率水平被认为有统计学意义。

结果

在研究过程中使用了44座孕坝，以达到统计效力。表1列出了五个处理组中经过处理的水坝所生幼崽的存活率。与受感染的对照组(第2组)相比，单用孕激素或联合使用抗生素的母鱼存活率最高(p< 0.001)。001，第4组，第5组)。与阳性对照组相比，单独使用抗生素也提高了幼崽的存活率(52%，p=.007)。正如预期的那样，第2组(阳性对照)感染水坝的幼崽表现很差，存活率为34%，显著低于阴性对照(97%，p<.001)。实验感染的水坝接受单独孕酮或联合抗生素的生存率与1组阴性对照无差异(83%，p=.096)。孕激素治疗(组4、5)的生存率也明显优于单独使用抗生素(组3)的生存率(p<.001)。

表1。实验感染坝的产仔重量和存活数据

	组1 消极的控制 (汤) N = 5	组2 积极的控制 （大肠杆菌） N = 6	组3 大肠杆菌+ AB0 N = 8	组4 大肠杆菌+ ab + px N = 8	组5 大肠杆菌+ PX N = 5
生存	96.7±1.2	33.8±12.3	52.3±8.9	83.2±14.5	82.2±10.3
小狗 出生 重量(克)	5.70±0.11	4.98±0.14	5.03±0.16	5.72±0.14	5.48±0.16

⁰AB =抗生素,^XP =孕酮

表1还显示了每组的出生体重。大肠杆菌单用(组2)可显著降低出生活重(5.70±0.11g)vs。4.98±0.14g, p<.001)。单纯使用抗生素不会显著增加感染坝幼崽的出生体重(5.03±0.16,p=.554)，而与实验感染坝幼崽(组2,p=.001)相比，添加黄体酮，无论是否使用抗生素，均显著提高出生体重(组4,5.72±0.14，组5,5.48±0.14)。

图1描述了每pg/mg蛋白质在大鼠后代大脑匀浆中肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白细胞介素-1 β (IL-lβ)的细胞因子测定结果。接受治疗的幼崽大肠杆菌(阳性对照)脑标本中TNF-α水平明显高于阴性对照(2.6±1.0)vs。33.5±14.3,p<.001)。单用抗生素和黄体酮联合抗生素治疗(组3、4)TNF-α值明显低于阳性对照组大肠杆菌感染(p <措施)。无抗生素孕酮治疗(组5)也显著降低了感染母鼠出生的幼崽的新生儿脑TNF-α水平(13.4±6.9,p< 0.01)。与单独使用抗生素相比，治疗4组TNF-α水平有差异(第3组)p<。然而，与单独使用抗生素相比，单独使用黄体酮(第5组)没有表现出差异。

图1。TNFα和IL-1β结果

* *医生3.4vs。医生2。p =措施^X全科医生5vs。Gp 2, p= 0.01

≠Gp 4vs。Gp 3, p=.001

**Gp 3,4,5vs。医生2。p = . 01^X医生4vs。Gp 3, p=.001

≠Gp 4vs。Gp 3, p=。007

白细胞介素-1β (IL-1β)水平显著升高大肠杆菌仅对照组(143±10.0)，阴性对照组(78±11.0,p<.001)。与阳性对照组相比，所有治疗组的幼犬大脑匀浆中IL-1β水平均显著降低(p< 0.01)。IL-1β水平4组(68.2±17.7,p<.001)和5组(80.4±25,p<.007)与3组(118±18)比较差异有统计学意义。

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讨论

孕激素具有免疫抑制特性，被认为有助于在成功妊娠期间提供异体胚胎移植的免疫特权[11]。在保持体液免疫反应完好的情况下，这导致了细胞介导免疫的适度抑制。孕激素被认为是通过诱导外周血淋巴细胞中的一种蛋白质来诱导抑制，这种蛋白质将t辅助细胞产生的细胞因子的表达从促炎(TH-1)模式转变为抗炎(TH-2)模式的表达[12]。我们假设孕激素治疗可以抑制母体和胎儿对宫内感染的免疫反应，进而通过降低胎儿细胞因子的表达来恢复细胞因子平衡。

本研究的结果证实，抗生素和孕酮或单独孕酮的联合使用可以提高受感染水坝所生幼仔的存活率和出生体重。Elovitzet al。报道了醋酸甲羟孕酮(MPA)在链球菌感染[13]的小鼠中保存胎儿活力并防止炎症诱导的早产。在感染介导的脑损伤和缺氧损伤大鼠模型中，孕酮似乎还能降低多种细胞因子的表达，包括TNF-α和IL-1β[14,15]。孕激素抑制胎儿炎症免疫反应的概念在感染母鼠出生的幼崽中IL-1β水平的降低中得到了证实。促炎细胞因子的诱导被认为是产前母体宫内感染和新生儿脑损伤之间的联系。这一点由蔡国强举例说明et al。他们报告在注射LPS[16]后不久，大脑IL-1β mRNA表达大幅增加。高浓度的TNF-α和IL-1β已被证明可以预测在分娩[17]后不久磁共振成像检测到的脑损伤。

综上所述，黄体酮加或不加抗生素似乎能提高存活和出生体重，并调节感染母鼠所生幼鼠大脑匀浆中的炎症细胞因子表达。未来的研究应集中于将研究扩大到更大的动物受试者群体，并评估不同剂量和类型的孕酮在防止宫内感染幼鼠脑损伤方面的作用。

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