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摘要

人们普遍认为，进化先进的细胞需要富含DNA的细胞核才能增殖，而从细胞核分离出来的线粒体则不能增殖。我们已经开发了一种新的稳定细胞系，命名为“线粒体细胞（mitocytominal cells）”，维持活性线粒体，其中大多数线粒体缺乏细胞核。有丝分裂细胞可以在培养中持续产生。在此，我们报告有丝分裂细胞的增殖研究。我们发现，流式细胞仪分选后，用1.2μm和3μm等孔滤膜过滤的无核DNA（nDNA）有丝分裂细胞可以存在和增殖。我们还通过T9176C突变分析证实，分选的无nDNA有丝分裂细胞具有线粒体DNA（mtDNA），而未分选的有丝分裂细胞具有nDNA的SURF-1基因。这些结果表明有丝分裂细胞可能同时具有mtDNA和nDNA的原核性质。

关键字

线粒体，原核生物，真核生物，利氏综合征，线粒体细胞，细胞核，无线粒体细胞，线粒体DNA，核DNA

介绍

根据定义，真核生物与原核生物不同，它有一个包含大部分细胞DNA的细胞核，细胞核被双层膜[1]包围。原核生物没有细胞核，细胞器很少或没有。真核生物必须有细胞核和线粒体才能生存和增殖，但也有例外[2-4]。从细胞核中分离出来的线粒体被认为不能存在或增殖[5,6]。假设大部分祖先线粒体基因组是随着真核生物与祖先线粒体共生关系的发展而转移到细胞核的[7-9]。呼吸链和氧化磷酸化系统(OPHOS)有五个复合物,由线粒体DNA编码的多肽(mtDNA)和/或核DNA (nDNA):只有13多肽是由mtDNA编码:复杂的Ⅰ7 mtDNA编码的多肽,复杂的二世没有,第三复杂,复杂IV 3和复杂的V 2。所有其他线粒体多肽都是由nDNA编码的。我们报道了一系列新颖的稳定细胞系，命名为“线粒体细胞(mitcell)”，它们来源于无线粒体的HeLa细胞与血小板融合获得的杂交体[10,11]。所有的线粒体细胞都有活性。这些线粒体细胞大部分缺乏细胞核，但有少量的DNA，而少数(不到3%)的DNA含量与有细胞核的细胞(富含ndna)相同。 We have recently reported that the MitoCells can survive under anaerobic condition and they could produce energy employing an anaerobic metabolic pathway, maintaining the electron transport enzyme activities, but losing the activity of tricarboxylic acid (TCA) cycle by means of mitochondrial enzyme assay and Western blot analyses [12]. This report suggests that energy production of MitoCells is far from the original cybrid cells which are eukaryote, although the MitoCells have enough polypeptides encoded by mtDNA and nDNA for maintaining their lives. Although most MitoCells have no nuclei, they can be continuously generated in culture. Therefore, it is important to know the feature of the nuclear DNA-less (nDNA-less) MitoCells, which do not possess nucleus. Herein, we assessed the proliferation study and mtDNA analysis of the nDNA-less MitoCells,

材料

线粒体细胞系是通过将无线粒体的HeLa细胞与Leigh综合征患者和对照组的血小板融合而获得的杂种细胞转化而获得的。Leigh综合征是线粒体脑肌病的一种亚型，其线粒体dna中含有致病点突变T9176C[13-15]。我们的1号和2号细胞系来源于T9176C突变杂种，而3号细胞系是来自对照杂种的野生型同源。细胞系的建立和培养方法在前面的下标中有详细的描述[10,11]。

方法

流式细胞仪分析线粒体增殖

分类流式细胞术检测mitcell:每个线粒体细胞系取两个样本。添加1 μM SYTO Green (SYTO 16) (Molecular Probes, Inc.， Inc.)(Eugene OR)，样本放置15分钟。SYTO Green是一种荧光染料，即使在活细胞[15]中也能染色核酸。采用流式细胞术(Epics ALTRA)对样品进行门控和分类^TMHyperSort^TM， Beckman Coulter Inc.，佛罗里达州迈阿密)。根据对照杂交数据定义了核的SYTO绿强度范围。

分选细胞培养及细胞计数:将分选的有丝分裂细胞（无nDNA的有丝分裂细胞）培养在新鲜RPMI 1640培养基中，在37°C下，在含有8%CO的增湿气体混合物中添加10%FBS₂．对照杂交体在相同条件下培养，但在SYTO Green暴露后用DMEM培养基而不是RPMI培养基培养。每2周采用台盼蓝排除试验，40倍放大计数各类型细胞数。

用等孔膜过滤器进行mitcell增殖分析:为了去除细胞核中含有丰富nDNA的mitcells(#2)，用1.2 μm和3 μm等孔径迹刻蚀膜过滤器(Millipore，日本)过滤mitcells(#2)。过滤后的mitcells在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，37℃，含8% CO的湿化气体混合物中₂．每周用显微镜观察细胞增殖情况，直到6^th的一周。

DNA分析

mtDNA T9176C突变分析:从线粒体细胞中提取基因组DNA的方法如前所述[16,17]。线粒体细胞系样品在分选前分别标记为#2和#3，分选后分别标记为#2和#3。T9176C突变的缺失或存在通过PCR-RFLP分析得到证实，如前所述[10]。我们放大178 - bp片段mtDNA包括突变使用寡核苷酸引物5 -GGCCACCTACTCATGCACCTAA-3,对应mtDNA头寸9025 - 9046(向前),和5“-GTGTTGTCGTGCAGGTAGAGGCTTCCT-3”,对应于核苷酸9203 - 9177(反向),在核苷酸T-to-C失配9179,3 bp 3 '末端的底漆。

核DNA SURF-1基因分析

mitcell line的样本为#1，是在对mitcell进行分类之前获得的。对SURF-1基因的第3、4外显子进行分析。首对PCR寡核苷酸引物分别为5 ' - ttcgagggcttctggctccca -3 '(正向)和5 ' -AAGTAAAACAGGCCCTAGG-3 '(反向)[18]。PCR条件为94°C孵育5分钟，然后94°C孵育30秒，64°C孵育30秒，72°C孵育30秒，共35个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色。

结果

定义了核的SYTO绿强度范围

为了研究细胞的增殖，我们用流式细胞仪对线粒体细胞进行了分类。首先，用SYTO Green (SYTO16)测量对照杂交体，用流式细胞术确定细胞核的强度范围。(图1a和1b)。对照杂种细胞表现出两个强度峰值，分别对应于细胞周期的G1和G2阶段。我们把原子核的强度范围定义为落在这两个峰之间。我们根据这个定义对mitcell进行了排序。

流式细胞术对线粒体的分选

其次，有丝分裂细胞系（#2）和（#3）如图1-（c）和-（e）所示被选通。接下来，我们将门控细胞分为有核DNA区域的细胞（图1-（D）和（f）中的D）和无核区域的细胞（图2-（D）和（f）中的E）。在#2和#3的细胞中，D区分别占1.42%和0.56%，E区分别占98.00%和99.14%。收集分类后的细胞。有5000个2-D细胞（富含nDNA的有丝分裂细胞）、200000个2-E细胞（不含nDNA的有丝分裂细胞）、200个3-D细胞（富含nDNA的有丝分裂细胞）和70000个3-E细胞（不含nDNA的有丝分裂细胞）。数据证实了我们之前的发现，只有3%或更少的有丝分裂细胞具有核大小的DNA（富含nDNA），而超过97%的有丝分裂细胞缺乏核大小的DNA（缺少nDNA）[10]。

图1所示。(a, b).用SYTO Green定义核的强度范围。对照杂交体采用SYTO Green (SYTO16)进行流式细胞仪检测。左:纵轴为Syto16胞内峰值强度，横轴为Syto16胞内平均强度。右:门控区h的杂合体，纵轴为杂合体细胞数，横轴为Syto16细胞内的平均强度。杂交强度有两个峰值，分别对应于细胞周期的G1和G2阶段。我们把原子核的范围定义为在两个峰之间。

（c，d，e和f）：有丝分裂细胞无核DNA区域的门控。有丝分裂细胞类型（#2）（a，b）和（#3）（c，d）如图所示。垂直轴和水平轴与图1-a中的相同。图（c）和（e）中的区域H在图（d）和（f）中被选通。区域D和E根据DNA的数量进行门控：区域D是核大小的DNA，而区域E代表少量的nDNA。大多数有丝分裂细胞位于E区。

细胞计数

分选后进行细胞培养和计数，观察细胞增殖活性。没有一个被分类的mitcell显示大量的细胞死亡，并且在所有的群体中都看到了持续的生长。细胞计数显示直到14^th随后的14天间相对迅速的增殖^th和35^th在所有细胞系中(图2a)。富含ndna的mitcell系(细胞核大小的DNA)分别为#2(+)和#3(+)。它们的增殖速度快于(#2(-)和#3(-)):在#2(+)和#3(+)中，最大细胞数与初始细胞数的比例分别为25和14，而#2(-)和#3(-)的比例均为4(图2a和2b)。增殖研究结果表明，增殖不仅发生在富含ndna的mitcells中，也发生在缺乏ndna的mitcells中。

图2。分选的mitcell增殖。(a)采用台盼蓝排除试验计算平均细胞数。(+):富含ndna的线粒体，具有细胞核大小的DNA;(-):缺乏ndna的线粒体，失去细胞核大小的DNA。(b)在分选的mitcells(无ndna的mitcells)中观察到明显的增殖。

用等孔膜过滤器进行mitcell增殖分析

1.2μm和3μm等孔径迹蚀刻膜必须阻塞细胞核，因为Cybrid的细胞核大小约为5-10μm。在通过1.2μm等孔膜过滤器过滤的细胞系中，线粒体细胞出现在6^th在3 μm等孔膜过滤器过滤后的细胞系中，线粒体细胞从3^th周(图3)。

图3。有丝分裂细胞经1.2μm和3μm等孔滤膜过滤后增殖。

分选和培养的无nDNA有丝分裂细胞中线粒体DNA的T9176C突变

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测线粒体dna T9176C突变。在分选之前，mitcell均为野生型，有178-bp扩增片段，未被ScrfI切割(图4a)。分选培养获得的线粒体均为野生型。它们包括有和没有细胞核大小DNA的线粒体细胞。这些结果证实了在整个分选和培养过程中mtDNA在这些细胞中的稳定性(图4a和4b)。

核DNA SURF-1基因分析

外显子3和42021的PCR版权所有。版权所有在所有有丝分裂细胞中保留380 bp片段。PCR产物的数量不同（图4c）。

图4。多聚酶链反应(PCR)用于线粒体dna和nDNA的检测。(A和B):分选培养前后聚合酶链反应限制性片段长度分析(PCR-RFLP)。#2和#3为线粒体细胞系，#C为杂交体阳性对照。M巷是ψ174/HindⅢ的尺寸标记。(+)富含ndna的线粒体具有细胞核大小的DNA，(-)缺乏ndna的线粒体失去细胞核大小的DNA。(A):分选前的mitcell lines。#2和#3的178 bp扩增片段未被ScrfI切割，#C的178 bp扩增片段被切割为151 bp和27 bp片段(27 bp片段未显示)。(B):分选培养后的线粒体。#2(-)， #3(+)和#3(-)的178-bp扩增片段未被切割。(C): SURF-1核基因3、4外显子的PCR产物。 Lanes 1-5 were the cell lines of #1( #1-13, 1-15, 1-18, 1-20 and 1-22). Lane M is a size marker. The fragment size is 380 bp.

讨论

最近一项比较线粒体和α-蛋白细菌的研究发现了许多基因组相似性，有力地支持了线粒体（真核生物的能量产生细胞器）曾经是自由生活细菌的观点[9]。人们普遍认为，自自由生活的α-蛋白细菌与其宿主（真核生物）发展出有益的（共生）关系以来，大约已经过去了20亿年。由于大多数线粒体基因组在进化过程中转移到细胞核，线粒体成为永久性的乘客[5,6]。没有人相信当线粒体从细胞核中分离出来时，它能够独立增殖。我们使用流式细胞术和等孔膜过滤器对有丝分裂细胞进行的增殖研究表明，它们可以在没有细胞核的情况下存在和增殖，这表明有丝分裂细胞具有原核性质（图2和图3）。有丝分裂细胞来源于将无线粒体的HeLa细胞与血小板融合获得的Cybrid细胞[10,16]。Cybrid是有核的真核生物，也就是说,它们是进化上的高级细胞。然而，在从杂交种转化为丝粒细胞的过程中，它们变成了原核生物，因此从进化的角度来看，它们变得不太发达。

Guy和他的同事发现，与正常ND4基因的同素异变表达互补，可以逆转在G11778A突变时发生的氧化磷酸化严重缺陷，从而导致Leber遗传性视神经病变(LHON)[19-22]。他们的结果表明，细胞核中的mtDNA基因可以在线粒体中有效地发挥作用。

我们最近报道，mitcell可以在无氧条件下存活，它们可以通过无氧代谢途径产生能量。线粒体酶分析显示，在线粒体细胞中复合物II+III和IV的活性与杂种细胞中的类似，而柠檬酸合酶活性则丧失。复合物II的所有亚基均由nDNA编码，复合物III和复合物IV的亚基均由mtDNA和nDNA[12]编码。

这些DNA研究证实，经T9176C突变分析，分类后的无nDNA的mitcell具有mtDNA，未分类的mitcell具有nDNA的SURF-1基因。SURF-1基因位于染色体9q34。由于SURF-1基因的突变导致Leigh综合征合并复杂IV(细胞色素c氧化酶)缺乏[23,24]。SURF-1组装复合物IV亚基并维持复合物IV活性。

这些结果表明，mitcell的呼吸链/氧化磷酸化系统被mtDNA和nDNA有效编码，而mitcell可能是原核生物。我们推测一些重要的核基因，如complex II和complex III的SURF-1和nDNA，可能在细胞从杂交细胞向mitcell转化的过程中被系统或功能地从细胞核运输到mitcell。

确认

感谢Shigeo Ota教授、Ikuroh Ohsawa教授(日本医科大学老年医学研究所生物化学和细胞生物学系)和Shitara Yujiro博士(TWMU病理学系)的建议。我们也感谢Yasuhiko Nagasaka先生(Beckman Coulter Inc.)对流式细胞仪的技术支持，以及由美子Yumiko女士和高桥理子女士(TWMU儿科)的技术支持。这项工作部分得到了T. Satake奖学金基金会的支持，部分得到了日本厚生劳动省(Ministry of Health, Labor and Welfare, Japan)的#14-Syouni-006“基于证据的医学临床研究”(Clinical Research for Evidence - Based Medicine)的资助。这项工作也得到了日本厚生劳动省疑难疾病(线粒体紊乱)研究补助金的支持。

的利益冲突

没有一个

参考文献

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