看看最近的文章

摘要

肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)存在于癌症微环境中，会分泌促炎细胞因子，包括白细胞介素-2 (IL-2)和干扰素- γ (INFγ)。另一方面，肿瘤细胞发展出各种免疫逃避机制，包括下调抗肿瘤免疫反应。在本研究中，我们使用MCF7细胞(人乳腺癌细胞系)作为靶细胞，刺激特定人群的人外周血单个核细胞(PBMCs)。在体外．我们评估了在存在或不存在IL-2的情况下，细胞因子分泌的效应T细胞反应。我们的数据显示MCF7细胞几乎完全(99%)抑制ifn - γ的分泌，提示MCF7细胞具有调节活性。IL-2完全逆转了MCF7的抑制，并诱导IFNγ分泌增加4倍。有趣的是，细胞因子分泌试验(CSA)的结果证实了上述结果，并显示在含有PBMCs和MCF7细胞的混合培养液中，分泌ifn γ的T细胞的百分比比PBMC对照低11倍。一直以来，IL-2完全逆转了MCF7的抑制作用，其中ifn γ分泌细胞的百分比比PBMC对照组增加了14倍。此外，纯化mcf7特异性，CD45+， ifn γ分泌效应细胞导致纯度从1.54%显著增加到92%。纯化的ifn γ分泌效应细胞在MCF7靶细胞中诱导58%的凋亡，而在非靶细胞中诱导18%的凋亡。总的来说，这项研究提供了数据，证明了产生和纯化癌症特异性ifn γ分泌效应T细胞的可能性在体外能够以细胞特异性的方式诱导靶癌细胞的凋亡。

关键字

肿瘤免疫治疗，细胞因子分泌测定，IFNγ，抗肿瘤细胞因子，MCF7

简介

据世界卫生组织统计，乳腺癌是女性中最常见的肿瘤[1,2]。对癌细胞的免疫监测失败是主要的促成因素[3.］．在健康的个体中，免疫系统在癌症发展的早期阶段非常有效地检测和消除癌细胞[4］．然而，肿瘤细胞可能通过下调效应淋巴细胞和巨噬细胞的分化、激活和增殖，形成免疫规避策略，干扰免疫系统的抗肿瘤免疫[5，6］．

乳腺癌已被证明有不同的免疫细胞群浸润，包括肿瘤浸润淋巴细胞(TILs) [7]、自然杀伤(NK)细胞及巨噬细胞[7］．它们用细胞因子丰富肿瘤微环境，可能上调抗癌免疫反应[8，9］．另一方面，癌细胞刺激调节性T细胞(Treg)分泌免疫抑制肿瘤来源可溶性因子(TDSFs) [10］．这些因素已被证明在免疫抑制、癌细胞生长和血管生成中发挥作用[11］．免疫抑制由血管内皮生长因子(VEGF)介导[12，13，白细胞介素-10 [IL-10] [14和转化生长因子β (TGFβ) [15］．这些TDSFs通过改变T辅助因子1(Th1): T辅助因子2 (Th2)的比例，使其向抑制细胞介导免疫的Th2倾斜，从而对T细胞产生深远影响[16]，并通过下调T细胞上IL-2受体和干扰IL-2分泌抑制T细胞激活[17，18］．

在抗肿瘤免疫中，T细胞激活和IL-2的产生是由T细胞受体识别MHC复合体肽和T细胞上抗原呈递细胞(APCs)上的CD80与T细胞上的CD28接合引发共刺激信号[19］．然而，肿瘤细胞通过抑制MHC II类抗原呈递、下调共刺激信号和下调MHC I类信号来干扰细胞介导的免疫应答[20.]，从而阻止T细胞识别肿瘤。Treg细胞在抗肿瘤免疫抑制中发挥关键作用，通过表达CTLA-4结合APCs上的CD86，其亲和力高于T细胞上的CD28，从而抑制T细胞分泌IL-2 [11，21，22］．

抗肿瘤细胞因子，如肿瘤坏死因子α (TNFα)，干扰素γ (IFNγ)和白细胞介素2 (IL-2)，是由浸润肿瘤的免疫细胞分泌的[23］．这些抗肿瘤细胞因子诱导淋巴细胞分化和增殖，抑制增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[8］．IL-2已获FDA批准用于癌症治疗[24];然而，它是有毒的在活的有机体内药物在流通中的半衰期较差[25］．另一方面，研究人员已经证明过继免疫治疗可以通过扩大患者自身的til，有效地增强机体的免疫反应，以对抗癌细胞在体外在含有IL-2的培养物中，然后重新注射在体外-刺激的TILs进入肿瘤部位[26］．他们的结果显示，TIL数量的增加与TNF和IFNγ浓度的增加相结合。矛盾的是，IL-2已被证明间接促进Treg介导的免疫抑制，这种促进逆转，当大量的IL-2添加到培养中，Treg被抑制。总之，这些结果揭示了IL-2在调节肿瘤发展中的作用，并显示了IL-2无可争议的抗癌作用[27]，并提出了这种重要细胞因子在抗癌方面的一种可能的利用[27］．在最近的一项研究中，研究人员已经表明，通过注入患者自身的表达B细胞抗原CD19特异性嵌合抗原受体的T细胞，CD19+ B细胞白血病的免疫治疗是成功的。28，29]，结合T细胞中的CD137共刺激受体和T细胞抗原受体信号域的CD3-zeta信号转导成分[29］．结果显示，注入的T细胞膨胀了1000倍在活的有机体内尽管它们被注入的剂量非常低(1.5X10⁵/kg患者)。他们的结果进一步证明，注入的细胞在患者的血液和骨髓中持续存在超过6个月，同时仍然携带CD19的抗原特异性。该疗法用于难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者，并导致骨髓中检测到的特异性免疫反应，伴随着表达CD19的正常B细胞和白血病细胞的丢失[29］．

在这项研究中，我们提供的数据证明了提高癌症特异性，IFNg分泌效应T细胞的可能性，这可能用于抗肿瘤免疫反应。我们发现T细胞在与MCF7细胞共培养时分泌ifn - γ被MCF7细胞抑制，而这种抑制在加入IL-2后被逆转到更高的水平。这些结果表明，IFNγ分泌在抗癌免疫中起着重要作用，因此是癌细胞抑制的靶点。有趣的是，我们的结果显示，纯化的ifn γ分泌细胞以特定的方式诱导MCF7靶细胞的显著凋亡。综上所述，本报告的结果表明，抗原特异性T细胞可能通过以特定的方式诱导靶细胞凋亡来用于抗癌治疗方法。

材料与方法

根据《赫尔辛基宣言》和《贝尔蒙特报告》的条款，本研究中使用的协议涉及从人体受试者获得的样本，该协议已于2009年获得阿拉伯干细胞(SCA)/阿曼-约旦IRB委员会批准，用于在研究目的中使用人类生物样本。该议定书也得到了约旦科技大学(JUST)伦理委员会的批准。

外周血单个核细胞的分离

我们使用了32名志愿者的12-14毫升外周血(PB)。血液保存在室温(RT)下，用磷酸缓冲盐水(PBS)稀释1:2。根据先前发表的程序，采用Ficoll-Paque(1.077)密度梯度离心(DGC)分离PBMCs [30.］．然后计数pbmc，并在10时重新暂停⁷细胞/毫升培养基(RPMI-1640培养基;补充谷氨酸，青霉素，链霉素和10%的胎牛血清。

t细胞体外刺激培养

在我们的系统中，MCF7乳腺癌细胞系作为靶细胞。PBMCs与MCF7细胞以5:1的E:T比例在12孔组织培养板上共培养。作为对照，PBMCs和MCF7细胞分别在单独的孔中培养，并以与其他培养变量相同的方式处理。将IL-2以1µl/ml的浓度加入复制孔。所有培养物均在37℃、CO浓度为5-7%的培养箱中培养₂4-5天。刺激后，分别收集细胞和培养基进行不同的下游测定。细胞在4°C下300 × g离心10分钟，进一步进行细胞因子分泌测定(CSA)，如下所示。分别收集上清液，并根据细胞仪珠阵列(CBA)的特定协议进行处理，如下所述。

细胞珠阵列(CBA)

为了测量上述培养物中分泌细胞因子的水平，我们根据制造商的协议使用了Th1/Th2细胞仪珠阵列(CBA) (BD Biosciences, USA)。首先，将人Th1/Th2细胞因子标准品重组到0.2 ml的分析稀释剂中，制备10倍体积标准品。九根管子按最高标准、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128和1:256的顺序标记。人类Th1/Th2细胞因子标准品然后用测定稀释剂进行连续稀释。然后，将每个人细胞因子捕获珠悬浮液混合，以10µl/试验，并将混合珠50µl转移到每个检测管中。然后加入PE检测试剂50µl/次，在相应样管中加入标准稀释剂50µl/次。所有试管在室温下黑暗孵育3小时，然后用1ml洗涤缓冲液洗涤，然后在200 × g离心5min。最后，在每个检测管中加入300 μ l的洗涤缓冲液，以便进行流式细胞术分析。

标记A、B、c三种细胞管制备细胞仪设置珠管，在三种细胞管中均加入50µl/管的细胞仪设置珠。在B管中加入FITC阳性对照的50µl，在c管中加入PE阳性对照的50µl。所有试管在室温下黑暗孵育30分钟。然后在B管和C管中加入400µl的洗涤液，在A管、B管和C管设置管中加入450µl的洗涤液进行流式细胞仪设置，然后将样品进行流式细胞术分析。

细胞因子分泌试验(CSA)

根据制造商的协议，对不同培养条件下的细胞进行测定，使用细胞因子分泌测定法(CSA) (Miltenyi Biotec, GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)确定IFNγ分泌细胞的百分比。在本实验期间，细胞一直保持在4°C。下面所有的数字都是为样本包含最多10⁷每个样本的细胞数。简单地，计数细胞，加入10 ml冷PBS缓冲液洗涤细胞，在4℃下300 × g离心10分钟。去除上清液，每10次用80 ul的冷RPMI培养基重悬细胞球⁷细胞。加入抗ifn - γ捕获试剂20 ul，冰育5分钟。捕获试剂由两个在Fc区相互结合的抗体组成;第一种抗体是抗CD45抗体，它允许捕获试剂与所有CD45+白细胞(PBMCs)结合，而另一种抗体是抗ifng抗体，它与同一细胞分泌的IFNγ结合。为了使激活的细胞分泌细胞因子，加入10 ml温培养基，在37°C的CO中培养细胞因子45分钟，使细胞分泌细胞因子₂培养箱，缓慢而温和地摇动，以防止细胞因子被其他非分泌细胞交叉捕获。在分泌期结束时，细胞立即从培养箱中取出并置于冰上。管子里装满了高达15毫升的冷缓冲液，并如上所述进行清洗。然后将细胞重悬在80 ul的缓冲液中，每个管中加入20 ul的抗IFNγ- pe检测抗体，在4°C下培养10分钟，使抗IFNγ抗体与捕获试剂上的IFNγ分子结合，在CD45+细胞表面。为了对ifn γ分泌细胞进行磁纯化，我们使用了MACS^®磁净化策略(美天益生物科技)。按照上述方法洗涤细胞，并在80 ul中重悬;然后在细胞中加入20 ul的抗pe微珠，4-8°C孵育15分钟。然后，按照上述方法洗涤细胞，并在500 ul缓冲液中重悬。每个样品取25 ul细胞进行流式细胞术分析。这些是未经纯化的原始样品(ORI)。为了纯化ifn γ分泌细胞，我们使用了两个MS柱(Miltenyi Biotec)来获得更高的纯度。首先用500 ul缓冲液洗涤制备柱，并丢弃出水。洗过的MS柱被放置在MiniMACS上^®分离磁铁，同时在磁铁下面放置一个15毫升的锥形管收集废水。细胞通过70µ的过滤器去除细胞团块，然后加载到制备的柱上。磁标记细胞(分泌ifn γ的细胞)被困在柱上，而非分泌细胞则飞过并被收集在柱下的锥形管中。柱洗三次，每次用500 ul缓冲液。然后，将柱从磁铁上移除，细胞被冲洗到磁铁上设置的新柱中，以重复提纯过程，以增加目标细胞群的纯度。按照上面的描述对新柱进行了清洗。分泌ifn γ的细胞最后从第二柱中洗脱到一个新鲜的锥形管中，并如上所述进行洗涤。采集ifn γ分泌细胞(阳性部分(POS))和非ifn γ分泌细胞(阴性部分(NEG))样本进行流式细胞术检测。分泌ifn γ和不分泌ifn γ的细胞最终被重悬在适当体积的培养基中与靶细胞进一步培养。

流式细胞术

从上述实验中获得的未纯化(ORI)、ifn γ分泌(POS)和非分泌(NEG)组分的细胞最后按照上述方法洗涤，然后重新悬浮在500 ul PBS缓冲液中进行流式细胞术分析。为了进行多次分析，所有部分的细胞都用抗cd3 - fitc andante- CD8- percp抗体进行共染，以便对pan T细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞进行多次门控和分析，此外还有结合在CD45+ wbc上的IFNγ-PE。流式细胞术分析是根据预先设定的专门设计的参数进行的。

ifn γ分泌细胞和非分泌细胞与MCF7细胞的共培养

在上述所有初始培养条件下，在IL-2存在或不存在的情况下，分别单独或与新鲜MCF7细胞群共培养未纯化的、ifn γ分泌型和非ifn γ分泌型pbmc。作为额外的对照，我们使用HeLa细胞作为另一种靶细胞类型，新鲜PBMCs也与MCF7细胞共培养。来自这些不同混合物的细胞在相同的培养条件下，以5:1 (E:T)的比例培养3天。

凋亡检测

评估来自上述不同培养物的未纯化的、分泌ifn γ的或不分泌ifn γ的细胞对靶MCF7细胞的杀伤作用在体外将上述共培养细胞用1 ug/ml Hoechst 33342 (Sigma)孵育10分钟，评估染色质凝结情况原位使用荧光显微镜(尼康，日本)，台班蓝染色并评估细胞活力，或清洗去除PBMCs，并用Annexin V-FITC孵育剩余的粘附MCF7细胞(BD Biosciences，圣何塞，CA, USA)，并使用BD FACS Calibur流式细胞术评估细胞凋亡(BD Biosciences)。

结果

收集了32名志愿者的外周血单个核细胞(pmcs)。平均每位志愿者采集了13.1 ml血液。PBMC平均得率为54.2 × 10⁶PBMCs，含5.8%的粒细胞，0.054 × 10⁶红细胞表面/毫升。这些PBMCs在随后的培养中被使用，单独或与MCF7乳腺癌细胞一起，加入或不加入白细胞介素-2 (IL-2)作为T细胞刺激剂。

在体外MCF7细胞与PBMCs共培养5天后，根据特定的培养条件显示出不同的细胞行为(图1)。单独培养的MCF7细胞形成单层贴壁细胞(图1B和E)。相比之下，单独培养的PBMCs处于悬浮状态(图1- a和D)。当PBMCs与MCF7细胞共培养时，没有观察到形态学行为的变化(图1- c)。向MCF7细胞中添加IL-2并没有引起任何形态上的改变(图1-E)。相反，在pbmc中加入IL-2确实能诱导形成小而多的细胞聚集体(图1-D)。有趣的是，MCF7细胞与添加IL-2的PBMCs共培养会形成更大但更少的细胞聚集体(图1-F)。

图1所示。MCF7乳腺癌细胞与PBMCs的初始培养和共培养。PBMCS、MCF7细胞单独培养或联合培养，加入或不加入IL-2，如材料和方法所述。细胞培养皿在37°C和5% CO中培养₂5天。以上照片是在第五天拍摄的。图中显示的是在PBMC+MCF7与IL-2共培养时最明显的细胞聚集物，表明T细胞激活。

第5天收集上述培养物的细胞和上清。使用上清液来评估分泌细胞因子的总体概况(图2-A)。这是通过使用细胞仪珠阵列(CBA)实现的，其结果如图2所示。本研究感兴趣的是γ干扰素(IFNg)的分泌。我们的结果显示，当PBMCs单独培养时，培养基中分泌的IFNg达到817 pg/ml(图2-B)。意料之中的是，随着IL-2的加入，分泌的IFNg水平升高到更高的水平(27322 pg/ml)。有趣的是，在PBMC+MCF7共培养中，分泌的IFNg水平下降到几乎无法检测的水平(9 pg/ml)。当IL-2加入到PBMC+MCF7中时，分泌的IFNg水平增加到3394 pg/ml(图2-B)。

图2。分泌细胞因子的概况:细胞珠阵列(CBA)结果。PBMCS、MCF7细胞按材料和方法中所述单独培养或共培养。细胞培养皿在37°C和5% CO中培养₂5天。第5天收集上清，按照材料和方法进行CBA试验。图(A)显示了与IFNg、TNFa、IL-10、IL-5、IL-4和IL-2细胞因子浓度相关的峰值。图(B)中的柱状图表示每个样本中每种细胞因子的确切浓度。

我们也在第5天收集上述培养物中的细胞，使用细胞因子分泌测定法(CSA)分析分泌IFNg的细胞(图3)。如图3- a所示，我们的结果表明，0.11%的CD45+/CD3+ T细胞在仅含PBMCs的培养物中分泌IFNg。加入IL-2后，ifng分泌细胞的比例增加到1.54%(图3-A)。无论是否加入IL-2, MCF7细胞均未分泌IFNg。有趣的是，在PBMC+MCF7共培养物中IFNg的分泌明显受到抑制，降低到0.01%(图3-A)。然而，当IL-2加入到PBMC+MCF7培养基中时，这种抑制作用被完全逆转到更高的水平(0.51%)(图3-A)。这些来自PBMC+MCF7培养的ifng分泌细胞，然后使用CSA的富集部分进行纯化(图3-B)。我们的结果显示，CD45+/CD3+ T淋巴细胞在纯化的细胞组分中分泌IFNg(图3-B)。使用MACS从PBMC+MCF7+IL-2培养物(1.54% ifng分泌细胞)中纯化ifng分泌细胞^®磁柱产生92.85%的纯分泌细胞(图3b)。分泌ifng的T淋巴细胞均为CD8+和CD8-。这些细胞进一步用于后续与新鲜MCF7或HeLa细胞群的共培养(图4)。

图3。干扰素- γ (IFN-g)分泌细胞的概况:PBMCS、MCF7细胞在IL-2存在或不存在的情况下，按照材料和方法中所述单独培养或共同培养5天。在第5天收集细胞，按照材料和方法中的描述进行细胞因子分泌试验(CSA)。上面的点图在CD3+ T细胞(CD3- percent)上进行门控。(A)流式细胞术点图显示分泌IFNg的CD3+ T细胞的百分比。(B)显示使用Anti - PE-MACS微珠磁纯化后CD45+/IFN-g分泌细胞的百分比。这些细胞与新鲜MCF7细胞一起用于下游培养。方框中的数字表示每个样本中CD45+/IFNg分泌细胞占CD3+细胞总数的百分比。

图4。将MCF7或HeLa靶细胞与IFNg分泌或非分泌、MCF7特异性或il -2应答的PBMCs进行培养和共培养。MCF7或HeLa靶细胞分别单独培养，或与不同PBMC群体(效应细胞)分别共培养2天，如材料和方法所述。PBMC群体要么分泌IFNg，要么不分泌IFNg，要么是mcf7特异性的，要么是IL-2应答的PBMCs。以上照片拍摄于第2天(48小时后)。图中显示的是在MCF7细胞与分泌ifng的PBMCs共培养时最明显的细胞聚集物。分析这些样本中的细胞在MCF7和HeLa靶细胞(CD45-)中的凋亡情况。传说:一:MCF7细胞,B:海拉细胞,C: MCF7-specific IFNg分泌PBMCs, D: MCF7-specific IFNg非机密PBMCs, E: IL2-responding IFNg分泌PBMCs, F: IL2-responding IFNg非机密PBMCs, G:结合文化的细胞和C, H:结合文化的细胞和D,我:结合文化的细胞和E, J:结合文化的细胞和F,凯西:结合文化细胞B和C,李:结合文化的细胞从B和D, M:B和E细胞的联合培养:B和F细胞的联合培养。

将上述培养物中未纯化的PBMCs和纯化的IFNg分泌T细胞和IFNg非分泌T细胞分别与新鲜的MCF7细胞或HeLa细胞共培养。如图4所示，这些培养物的细胞形态与图1所示的初始培养物不同。与最初培养的MCF7+ IFNg分泌PBMCs相比，MCF7+ IFNg分泌PBMC培养物中有更大、更明显和明显的细胞聚集(图4-G)。从PBMC+IL2培养中纯化的IFNg分泌T细胞和IFNg非分泌T细胞被用作MCF7非特异性效应细胞，而HeLa细胞被用于评估MCF7刺激的IFNg分泌PBMCs的特异性。

然后分析IFNg分泌细胞和非分泌细胞对MCF7靶细胞诱导凋亡的作用。采用不同方法评估和确认MCF7靶细胞的凋亡情况。首先去除PBMCs，然后清洗粘附的MCF7细胞，然后评估。我们首先用台潘蓝染色法评估细胞膜通透性(图5)。我们的结果显示，在MCF7单独细胞培养中，7%的MCF7细胞台潘蓝阳性。当MCF7细胞与之前培养的未纯化的PBMC共培养时，17%的MCF7细胞对台帆蓝呈阳性，而MCF7+新鲜PBMC共培养的MCF7细胞对台帆蓝呈阳性的比例为9%。有趣的是，在MCF7+ IFNg分泌PBMC共培养中，64%的MCF7细胞台番蓝阳性，而在MCF7+ IFNg不分泌PBMC中，只有13%的MCF7+ IFNg细胞台番蓝阳性。此外，当HeLa细胞与分泌IFNg的PBMC共培养时，16%的HeLa细胞呈阳性，而当HeLa细胞与不分泌IFNg的PBMC共培养时，阳性比例为3%(图5)。

图5。通过台潘蓝染色评估MCF7细胞与不同群体PBMCs共培养反应中的死亡。MCF7或HeLa靶细胞分别单独培养，或分别与不同PBMC群体(效应细胞)共培养3天，如材料和方法所述。PBMC群体要么分泌IFNg，要么不分泌IFNg，要么是MCF7特异性的，要么是MCF7非特异性的，IL-2应答的PBMCs。去除PBMCs，清洗其余粘附的MCF7细胞，然后收集，台潘蓝染色。每条柱状图代表所述每种培养条件下台盼蓝染色细胞的数量。每个样本中至少有200个细胞被计数。图例:M, MCF7细胞单独;M + Fr。P, MCF7细胞与新鲜批次PBMCs共培养;M +联合国。P, MCF7 cells co-cultured with unpurified PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 cultures; M+IFN+P, MCF7 cells co-cultured with purified IFNg secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 cultures; M+IFN-P, MCF7 cells co-cultured with purified IFNg non-secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 cultures; M+IFN+IL-P, MCF7 cells co-cultured with IFNg secreting PBMCs from PBMC+IL2 cultures; M+IFN-IL-P, MCF7 cells co-cultured with IFNg non-secreting PBMCs from PBMC+IL2 cultures; He+IFN+P, HeLa cells co-cultured with IFNg secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 cultures; He+IFN-P, HeLa cells co-cultured with IFNg non-secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 cultures.

然后我们用Hoechst染色分析MCF7细胞中的染色质凝结，以确定细胞发生凋亡的百分比(图6)。我们的结果显示，在单独培养的MCF7细胞中，4%的MCF7细胞染色质凝结(图6- a)。在MCF7+未纯化的PBMC中，14%的MCF7细胞染色质浓缩(图6-D)，而在MCF7+新鲜PBMC培养中，只有4%的MCF7细胞染色质浓缩(图6-G)。有趣的是，在MCF7+ IFNg分泌PBMC培养物中，58%的MCF7细胞有浓缩染色质(图6-E)，而在MCF7+非分泌PBMC培养物中只有10%的MCF7细胞有浓缩染色质(图6-F)。作为对照，我们使用HeLa细胞作为pmcs杀伤的靶细胞。当HeLa细胞与MCF7+PBMC+IL2培养液中分泌IFNg的PBMCs共培养时，有12%的HeLa细胞染色质浓缩(图6-H)，而与MCF7+PBMC+IL2培养液中分泌IFNg的PBMCs共培养时，只有3%的HeLa细胞染色质浓缩(图6-I)。

图6。MCF7细胞与不同群体PBMCs共培养后染色质凝结。MCF7或HeLa靶细胞分别单独培养，或与不同PBMC群体(效应细胞)分别共培养2天，如材料和方法所述。PBMC群体要么分泌IFNg，要么不分泌IFNg，要么是MCF7特异性的，要么是MCF7非特异性的，IL-2应答的PBMCs。去除PBMCs，其余粘附的MCF7细胞用Hoechst染色分析染色质凝结情况，以确定凋亡细胞。图示百分比表示染色质浓缩的细胞数量(亮细胞)。每个样本中至少有200个细胞被计数。A、MCF7单独;B, MCF7细胞+ IFNg分泌PBMC+IL2培养物中的PBMCs;C, MCF7细胞+ PBMC+IL2培养的IFNg非分泌PBMCs;D, MCF7细胞+ MCF7+PBMC+IL2培养未纯化的PBMCs; E, MCF7 cells + IFNg secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 culture; F, MCF7 cells + IFNg non-secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 culture; G, MCF7 cells + fresh batch of PBMCs; H, HeLa cells + IFNg secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 culture; I, HeLa cells + IFNg non-secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 culture.

最后，我们使用与凋亡细胞特异性结合的Annexin V分析了不同PBMC群体对诱导MCF7靶细胞凋亡的影响(图7)。与之前的结果一致，我们的数据显示，在单独培养的MCF7细胞中，2.1%的MCF7发生了凋亡(图7- a)，相比之下，PBMC+IL2培养的MCF7+ IFNg分泌PBMCs和PBMC+IL2培养的MCF7+ IFNg不分泌PBMCs分别为8.9%和6.4%(图7- b和7- c)。相比之下，在MCF7+未纯化的PBMC培养物中，13.9%的MCF7细胞凋亡(图7-D)，而在MCF7+新鲜PBMC培养物中，2.7%的MCF7细胞凋亡(图6-G)。有趣的是，与上述结果一致的是，在MCF7+ IFNg分泌细胞培养物中，51.4%的MCF7细胞发生凋亡(7-E)，而在MCF7+ IFNg非分泌细胞培养物中，只有7.4%的MCF7细胞发生凋亡(图7-F)。当使用HeLa细胞时，HeLa+ IFNg分泌细胞培养物中有1.3%的HeLa细胞凋亡(图7-H)，而HeLa+ IFNg非分泌细胞培养物中有0.5%的HeLa细胞凋亡(图7-I)。

图7。Annexin V法检测MCF7细胞凋亡。利用Annexin V抗体与凋亡MCF7细胞表面的磷脂酰丝氨酸(PS)结合，分析效应子PBMCs诱导MCF7细胞凋亡的作用。MCF7细胞单独培养，或与其他细胞群一起培养3天。去除PBMCs，分析剩余的粘附MCF7细胞Annexin V与PS的结合情况，以确定凋亡细胞。用碘化丙啶(PI)去除坏死细胞。上述直方图对PI负总体进行门控。直方图显示Annexin V阴性群体(活细胞，左峰)和Annexin V阳性细胞(凋亡细胞，右峰)。数字表示门控细胞群中Annexin V阳性细胞的百分比。A、MCF7单独;B, MCF7细胞+ IFNg分泌PBMC+IL2培养物中的PBMCs; C, MCF7 cells + IFNg non-secreting PBMCs from PBMC+IL2 culture; D, MCF7 cells + Unpurified PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 culture; E, MCF7 cells + IFNg secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 culture; F, MCF7 cells + IFNg non-secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 culture; G, MCF7 cells + fresh batch of PBMCs; H, HeLa cells + IFNg secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 culture; I, HeLa cells + IFNg non-secreting PBMCs from MCF7+PBMC+IL2 culture.

版权所有OAT。版权所有

讨论

在本研究中，我们旨在诱导针对MCF7乳腺癌细胞的抗原特异性T细胞应答在体外．我们的结果表明MCF7细胞通过下调T淋巴细胞ifng的分泌来抑制I型免疫反应。相比之下，IL-2逆转了MCF7介导的T细胞激活抑制，并导致细胞介导的免疫应答上调，表现为IFNg分泌CD3+ T细胞的数量显著增加，以应答MCF7细胞。有趣的是，我们的数据显示，纯化的、活的、MCF7刺激的、ifng分泌的效应T细胞在新鲜的一批MCF7细胞上诱导了放大的凋亡效应，而这些效应是MCF7特异性的，不影响其他类型的癌细胞。

在本研究中，我们利用健康个体的外周血单个核细胞(PBMCs)作为效应免疫细胞。我们利用MCF7乳腺癌细胞作为靶细胞。对收集的PBMC的质量进行评估，以确定污染的粒细胞和红细胞(rbc)的百分比。平均而言，PBMC收集的细胞中含有87%的单个核细胞，少于9%的粒细胞，以及数量不显著的红细胞。PBMC人群中CD3+ T细胞、CD19+ B细胞和CD14+单核细胞的比例分别为48%、27%和13%。

最初，PBMCs单独培养，或与MCF7细胞共培养5天，在存在或不存在IL-2作为T细胞刺激剂的情况下。共培养5天，以允许PBMC群体中的抗原呈递细胞(APCs)摄取MCF7抗原，APCs处理抗原，向T细胞呈递抗原，T细胞激活，分化为效应细胞，并分泌IFNg。

然后用不同的方法分析PBMCs和MCF7细胞对彼此的影响。我们首先观察了共培养细胞群的行为在体外(图1)。这些观察提供了pmbc和MCF7细胞之间相互作用的初步评估，并提供了关于PBMC行为的提示，因为当PBMCs处于悬浮状态时，MCF7细胞作为贴壁细胞生长。与其他培养物相比，在特定培养条件下观察到PBMC细胞聚集，这首次表明了PBMC种群的激活状态(图1)。我们的数据显示，PBMC在单独培养物中聚集最少(图1- a)，是所有PBMC培养物的典型特征。在PBMC+MCF7培养中未观察到明显的额外聚集(图1-C)，这首次提示MCF7细胞不会引起明显的PBMCs激活。意料之中的是，PBMC+IL-2培养物显示出大量的细胞聚集物(图1-D)，表明添加IL-2后T细胞激活的逻辑反应。有趣的是，与PBMC+MCF7+IL-2培养相比，PBMC+MCF7+IL-2培养中PBMC聚集物较少，且体积较小(图1-F)，这表明MCF7细胞可能对PBMC群体内细胞聚集物的形成具有抑制作用。

然后我们评估了MCF7对PBMCs分泌细胞因子的影响。我们测量了培养上清液中分泌细胞因子的水平，以及每种培养条件下分泌ifng的PBMCs的百分比。为了确定分泌细胞因子的水平，我们使用Th₁/ Th₂巨细胞珠阵列(CBA) (BD Biosciences)，它能够测量培养基中分泌的细胞因子，包括IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFα和IFNg(图2-A和-B)。本研究感兴趣的是IFNg作为I型免疫反应中的主要细胞因子。IFNg由活化的CD4+ Th1细胞和CD8+细胞毒性T细胞分泌。我们的数据表明，单独培养时PBMCs分泌817 pg/ml(图2-B)。当IL-2添加到PBMC培养物中时，IFNg分泌量大幅增加，达到27,322 pg/ml。有趣的是，当MCF7细胞与PBMCs共培养时，它们几乎完全阻止PBMCs分泌IFNg (9 pg/ml)。这些结果表明，MCF7癌细胞的抗免疫活性可能包括阻断IFNg等炎症分子的分泌作为一种免疫逃避机制。相反，当IL-2添加到PBMC+MCF7培养物中时，它完全逆转了MCF7对PBMCs分泌IFNg的抑制(3394 pg/ml)(图2-B)。一个有趣的观察是，MCF7细胞有效地抑制了IL-2介导的PBMCs上调IFNg分泌，从27,322 pg/ml下降到3394 pg/ml。

为了识别效应T细胞的特定群体，我们使用细胞因子分泌试验(CSA)来检测和物理分离PBMCs中分泌IFNg的特定群体的细胞，这些细胞对MCF7细胞、IL-2或两者的结合产生反应。CSA检测采用双特异性单克隆抗体试剂(捕获试剂)，该试剂由Fc区偶联的抗cd45抗体和抗IFNg抗体组成。一方面，该捕获试剂与所有CD45+白细胞结合(无论激活与否或IFNg分泌)，而抗IFNg抗体与分泌的IFNg分子结合。由于MCF7细胞不表达CD45，因此SCA只会将PBMCs纳入分析IFNg分泌情况。该检测方法经过优化，以防止交叉捕获，这种交叉捕获可能是由于一个细胞表面的捕获试剂与样品中其他相邻细胞分泌的IFNg结合而导致的。只有分泌IFNg的CD45+ pbmc才会在其表面结合IFNg。第二个抗IFNg抗体被偶联到phyocythrin (PE)上，它可以识别IFNg分子上的另一个表位，从而通过流式细胞术检测CD45+/IFNg分泌细胞。

我们的CSA结果显示，根据特定的培养条件，CD3+ T细胞分泌了不同水平的IFNg。通过执行特定的流式细胞术门控策略，该策略包括在淋巴细胞上绘制基于正向和侧向散射特性的物理门控，在CD3+ T细胞上门控，然后使用抗CD8+抗体vs. IFNg图来区分CD3+ T细胞门控内的CD8+和CD8- (CD4+)分泌细胞和非分泌细胞。通过这种方法，我们可以分析分泌IFNg的特定PBMCs群体中CD8+和CD4+ T细胞的百分比。由于抗IFNγ-PE仅与表达CD45的细胞结合，因此不需要进一步的CD45抗体。我们的数据显示，0.11%的CD3+ T细胞在PBMC单独培养中分泌IFNg，这代表了IFNg的背景分泌(图3-A)。IL-2有效且显著地增强了T细胞的活化，并导致IFNg分泌细胞数量增加15倍，达到所有CD3+ T细胞PBMC+IL-2培养的1.54%。有趣的是，MCF7细胞有效抑制了90% T细胞的IFNg分泌(在PBMC+MCF7培养中为0.01%，而在PBMC单独培养中为0.11%)。

在PBMC+MCF7培养物中加入IL-2后，MCF7介导的T细胞IFNg分泌抑制被逆转。然而，MCF7细胞对IFNg分泌的抑制作用有效地减少了IFNg分泌细胞的数量，从PBMC+IL-2培养物的1.54%下降到PBMC+MCF7+IL-2培养物的0.51%。在PBMC+IL-2培养物中，IL-2介导的IFNg分泌增加是一种非抗原特异性反应，因为IFNg分泌水平在没有MCF7细胞存在的PBMC培养物中可见。然而，在PBMC+MCF7+IL-2培养中，IFNg分泌的增加至少部分是MCF7特异性的，因为激活是在MCF7细胞存在的情况下进行的。

为了测试在PBMC+MCF7+IL-2培养中看到的ifng分泌T细胞是MCF7抗原特异性T细胞，还是只是IL-2应答的MCF7抗原独立T细胞，我们设计了下一组实验。我们的目的是通过物理分离PBMC+MCF7+IL-2培养的ifng分泌T细胞来检测这些ifng分泌T细胞的抗原特异性，并与其他类型的细胞相比，测试它们诱导靶MCF7细胞凋亡的能力。我们使用抗pe MACS磁标记CSA中pe阳性、ifng分泌细胞^®微磁。然后细胞通过MACS^®磁柱;分泌ifng的细胞结合在柱上，而非分泌ifng的细胞通过。然后将柱从磁铁中取出，收集ifng分泌细胞。我们为每个样品使用两个磁柱来增加ifng分泌细胞的纯度。我们的结果表明，我们从PBMC+MCF7+IL-2培养物中获得了高纯度(92.85%)的分泌ifng的CD3+ T细胞(图3-B)。这些IFNg分泌细胞代表了一种独特的活细胞群，它们共享一个共同的效应机制，即IFNg分泌。

然后，我们通过与新鲜的MCF7细胞共培养，以及如下所述的其他实验设置，测试上述实验中纯化的两个群体(ifng分泌细胞和ifng非分泌细胞)诱导凋亡的能力。因为众所周知IL-2是激活而非杀伤所必需的[31我们没有在最后的共培养中添加IL-2。共培养只进行了3天，以允许以抗原特异性的方式诱导细胞凋亡，而不允许通过PBMCs引起新的和完全的效应反应。

通过三种不同的方法分析不同群体PBMCs对MCF7靶细胞的特异性杀伤:凋亡细胞和坏死细胞吸收台盘蓝(图5)，Hoechst染色浓缩染色质(图6)和Annexin V染色流式细胞术分析磷脂酰丝氨酸表达(图7)，具体分析凋亡细胞。这三种方法可以定量测量上述不同培养环境下的细胞凋亡情况。

使用台盼蓝排除法，我们的数据显示，在仅MCF7和MCF7+新鲜PBMC培养中，死亡率分别为7%和9%，这代表了这些类型的5日龄培养中的背景死亡率。MCF7细胞与未纯化的(未去除ifng分泌细胞)PBMCs共培养，从先前的PBMC+MCF7+IL-2培养中提取，导致17%的MCF7细胞杀伤。MCF7细胞凋亡的增加主要是由于效应细胞群的存在(ifng分泌和可能其他效应细胞类型)。有趣的是，MCF7细胞与从PBMC+MCF7+IL-2培养物中纯化的ifng分泌PBMCs共培养可导致64%的MCF7细胞死亡。相比之下，MCF7细胞与来自相同PBMC+MCF7+IL-2培养的ifng -非分泌细胞共培养可导致13%的MCF7细胞死亡。分泌IFNg和不分泌IFNg的PBMCs之间的明显区别提供了IFNg分泌作为PBMCs的效应机制与靶细胞凋亡之间的直接联系。此外，将MCF7细胞与先前PBMC+IL-2培养的分泌ifng或不分泌ifng的PBMCs共培养(未暴露于MCF7)，分别导致12%和8%。这表明il -2介导的PBMCs激活(在MCF7靶细胞缺失的情况下)不足以显著增加靶细胞凋亡。更有趣的是，为了测试ifng分泌的PBMCs的上述反应是否与mcf7特异性，我们将ifng分泌细胞与另一种癌症细胞系HeLa细胞共培养。我们的结果表明，HeLa细胞与先前PBMC+MCF7+IL-2培养的mcbmc刺激、ifng分泌和ifng不分泌的PBMCs共培养，分别导致16%和3%的杀伤作用，表明MCF7刺激的PBMCs杀伤作用的显著增加是MCF7特异性的，而不会对其他类型的靶细胞产生相同的反应。

然后，我们通过评估染色质凝结来评估MCF7刺激、ifng分泌的PBMCs诱导靶MCF7细胞凋亡的能力。我们的分析表明，MCF7刺激、ifng分泌、CD45+ PBMCs可显著增加MCF7靶细胞凋亡，这与台帆蓝排除的上述结果一致。与上述所有其他实验变量相比，MCF7与MCF7刺激、ifng分泌、CD45+、PBMCs共培养的MCF7细胞凋亡率最高(58%)。这清楚地表明，MCF7刺激，ifng分泌，CD45+， PBMCs诱导MCF7特异性凋亡，这是PBMC群体中MCF7靶细胞暴露于效应细胞的结果。

此外，为了提供另一种评估MCF7靶细胞凋亡的方法，我们使用Annexin V(一种可识别凋亡细胞表面磷脂酰丝氨酸的磷脂结合蛋白)通过流式细胞术检测凋亡。为了区分凋亡细胞和坏死细胞，我们使用了fitc结合的Annexin V和碘化丙啶的图谱。纳入评估的细胞为Annexin v - fitc阳性和pi阴性。

与上述使用Trypan Blue的细胞膜通透性和使用Hoechst染色的染色质凝结结果一致，我们使用Annexin V的结果再次表明，MCF7刺激，ifng分泌，CD45+， PBMCs诱导最大凋亡(51% Annexin V阳性)的MCF7细胞，以一种MCF7特异性的方式，而在其他实验设置中没有看到。

综上所述，通过评估细胞膜通透性对MCF7靶细胞的杀伤作用，并通过染色质凝集和磷脂酰丝氨酸去极化分析特异性凋亡分析，不同PBMC群体诱导MCF7靶细胞凋亡的相关数据表明，MCF7刺激、ifng分泌、CD45+、PBMCs诱导的MCF7靶细胞凋亡显著增加。我们的结果显示，新鲜批次的PBMCs对靶MCF7细胞的杀伤作用极小。新鲜的PBMCs不会杀死MCF7细胞，因为正如我们在前一组实验中所示，它们被MCF7细胞下调了调控，而现在我们不添加IL-2。此外，PBMC+IL-2培养的PBMCs对MCF7细胞的杀伤作用是IL-2激活的PBMCs的一种一般反应，而不是MCF7的特异性反应，这表明在MCF7细胞缺失的情况下，IL-2激活PBMC并不一定会导致后续MCF7靶细胞的凋亡显著增加。

重要的是，与我们实验设置中的任何其他效应细胞相比，分泌ifng的PBMCs显著增加MCF7凋亡，这与MCF7靶细胞的杀死与ifng分泌直接相关。另一方面，不分泌ifng的PBMCs诱导MCF7细胞凋亡的数量远低于分泌ifng的细胞，但比未纯化的PBMCs杀死MCF7靶细胞的数量少一半以上;这表明除了ifng分泌细胞外，MCF7细胞中也存在能诱导细胞凋亡的效应细胞。我们实验室目前正在研究其他效应细胞类型的鉴定和表征。

当MCF7细胞与IFNg不分泌细胞共培养时，MCF7细胞凋亡的比例是MCF7+未纯化PBMCs的一半以上，说明MCF7细胞诱导凋亡的机制不依赖于IFNg的分泌。这可能是由于IFNg非分泌细胞中存在另一群效应细胞，或者由于间接杀伤效应，凋亡的MCF7细胞在纯化发生前就注定死亡。然而，第一个假设更符合逻辑，因为我们改变了新的培养介质，有多种机制对抗癌细胞的免疫反应，包括利用抗肿瘤细胞因子。这一现象还需要进一步的研究。我们实验室目前正在研究其他效应细胞类型的鉴定和表征。

本研究的目的是测试我们是否能够以排他的方式培养能够诱导靶细胞凋亡的癌细胞特异性效应t细胞。我们的目标是分离mcf7刺激，ifng分泌的T细胞，并确定它们对靶细胞的凋亡活性的特异性。我们关注IFNg分泌作为针对MCF7靶细胞的细胞免疫应答的效应机制。

最后，在本报告中，我们提出了一种独特的方法，用于物理分离纯净的、活的、分泌ifng的效应CD3+ T淋巴细胞，这种淋巴细胞能够以细胞特异性的方式诱导癌细胞凋亡。这种独特的方法打开了开发个体化癌症疫苗的可能性，利用自身的，效应，癌细胞特异性T细胞，可能专门针对癌细胞在活的有机体内不影响健康组织

参考文献

1. Khang D, Rim HD, Woo J(2013)韩国版身体形象量表在乳腺癌患者样本中的信度和效度。精神病学Investig10: 26-33。［Crossref］
2. Ginsburg OM, Love RR(2011)乳腺癌:全球大多数受影响女性的一种被忽视的疾病。乳房J17: 289 - 95。［Crossref］
3. 3.王晓燕，王晓燕，王晓燕，等(2013)结直肠癌患者先天免疫与适应性免疫的相关性研究。世界J肠胃醇: WJG19日:174 - 84。［Crossref］
4. 周mt, Moller A, Smyth MJ(2012)癌症的炎症和免疫监测。Semin Cancer Biol22: 23-32。［Crossref］
5. Deepak P, Acharya A(2010)肿瘤细胞介导的抗肿瘤免疫及其免疫抑制机制:肿瘤源性可溶性因子和细胞因子的作用。免疫29日:421 - 58。［Crossref］
6. DeNardo DG, Coussens LM(2007)炎症与乳腺癌。平衡免疫反应:乳腺癌进展过程中适应性和先天免疫细胞之间的相互作用乳腺癌治疗9: 212。［Crossref］
7. Oble DA, Loewe R, Yu P, Mihm MC, Jr(2009)聚焦TILs:人黑色素瘤中肿瘤浸润淋巴细胞的预后意义。癌症Immun9: 3。［Crossref］
8. 张宏，张晓燕，张晓燕，唐诺克IF(2008)肿瘤细胞因子与症状和转归的关系。Nat Rev癌症8: 887 - 99。［Crossref］
9. Ben-Baruch A(2003)乳腺癌发展中的宿主微环境:乳腺癌进展中的炎症细胞、细胞因子和趋化因子:肿瘤-微环境相互作用。乳腺癌治疗5: 31-6。Crossref］
10. Curiel TJ (2007) Tregs和对癌症免疫治疗的重新思考。J clinin投资117:1167 - 74。Crossref］
11. Antony PA, Restifo NP (2005) CD4+CD25+ T调节细胞，癌症的免疫治疗和白细胞介素-2。J Immunother28:120-8。［Crossref］
12. 陈晓燕，陈晓燕，陈晓燕，等(2012)抗血管生成分子对肿瘤免疫功能的调节作用。临床开发免疫: 492920。［Crossref］
13. 杨志强，张志强，张志强，等(2009)血管内皮生长因子在肿瘤免疫抑制中的作用。Curr Mol Med9:702-7。［Crossref］
14. Banerjee S, Halder K, Bose A, Bhattacharya P, Gupta G等(2011)TLR信号介导的IL-10和IL-12启动子区域的差异组蛋白修饰导致肿瘤相关巨噬细胞的功能损害。致癌作用32: 1789 - 97。［Crossref］
15. Perez N, Karumuthil-Melethil S, Li R, Prabhakar BS, Holterman MJ等(2008)CD80优先共刺激可导致il- 10依赖性TGF-beta1(+)自适应调节性T细胞生成。J Immunol180: 6566 - 76。
16. Kim R, Emi M, Tanabe K(2006)癌症免疫抑制和自身免疫疾病:肿瘤免疫的免疫抑制网络之外。免疫学119: 254 - 64。
17. 蒋军，吴超，吕波(2013)细胞因子诱导的杀伤细胞促进抗肿瘤免疫。J翻译医学11: 83。［Crossref］
18. Brown MD, van der Most R, Vivian JB, Lake RA, Larma I，等(2012)肿瘤完全切除后抗原交叉呈递的丢失与保护性肿瘤特异性CD8(+) t细胞免疫的产生相关。Oncoimmunology1: 1084 - 94。［Crossref]
19. Baleeiro RB, Wiesmuller KH, Dahne L, laddemann J, Barbuto JA，等(2013)颗粒结合但不可溶的MHC II类配体直接激活人树突状细胞。《公共科学图书馆•综合》8: e63039。［Crossref］
20. Sugata K, Satou Y, Yasunaga J, Hara H, Ohshima K，等(2012)HTLV-1 bZIP因子通过抑制Th1细胞因子的产生而损害细胞介导的免疫。血119: 434 - 44。
21. McNally A, Hill GR, Sparwasser T, Thomas R, Steptoe RJ (2011) CD4+CD25+调节性T细胞通过调节IL-2内稳态控制CD8+ T细胞效应分化。美国国家科学研究院108: 7529 - 34。［Crossref］
22. Watanabe MA, Oda JM, Amarante MK, Cesar Voltarelli J(2010)调节性T细胞与乳腺癌:免疫发病机制的意义。癌症转移29日:569 - 79。［Crossref］
23. Macchetti AH, Marana HR, Silva JS, de Andrade JM, ribeio -Silva A等(2006)早期乳腺癌肿瘤浸润CD4+ T淋巴细胞反映淋巴结受累。诊所(圣保罗)61: 203 - 8。［Crossref]
24. Boyman O, Sprent J(2012)白细胞介素-2在免疫系统稳态和激活中的作用。Nat Rev免疫112: 180 - 90。［Crossref］
25. Thavendiranathan P, Verhaert D, Kendra KL, Raman SV(2011)高剂量白介素-2治疗转移性黑色素瘤导致暴发性心肌炎。溴J放射性醇84: e99-e102。［Crossref］
26. Ellebaek E, Iversen TZ, Junker N, Donia M, Engell-Noerregaard L等。(2012)自体肿瘤浸润淋巴细胞和低剂量白细胞介素-2在转移性黑色素瘤患者中的过继细胞治疗。转化医学杂志10: 169。
27. Jahn T, Zuther M, Friedrichs B, Heuser C, Guhlke S等(2012)一种靶向霍奇金淋巴瘤细胞的il12 - il2抗体融合蛋白增强NK和T细胞的激活，以抗肿瘤攻击。《公共科学图书馆•综合》7: e44482。［Crossref］
28. Pham CD, Mitchell DA(2012)用嵌合抗原受体治疗癌症。免疫疗法4: 365 - 7。［Crossref］
29. Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH(2011)嵌合抗原受体修饰的T细胞在慢性淋巴细胞白血病中的作用。N英语J医学365:725-33。
30. Posel C, Moller K, Frohlich W, Schulz I, Boltze J, et .(2012)密度梯度离心降低骨髓单个核细胞产量。《公共科学图书馆•综合》7: e50293。
31. Iacobelli M, Rohwer F, Shanahan P, Quiroz JA, McGuire KL(1999)原代人T细胞中il -2介导的细胞周期进展和凋亡抑制不需要NF-kappa B或激活蛋白-1的激活。J Immunol162: 3308 - 15所示。［Crossref］