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摘要

我们之前报道过两者之间的联系神经肽Y2受体（NPY2R)基因启动子snp和健康受试者血浆高密度脂蛋白胆固醇水平。为了阐明这一机制，我们构建了pGL3-Basic质粒NPY2R基因启动子rs6857530GG+rs6857715TT (G+T)或rs6857530AA+ rs6857715CC (A+C)，在培养的HepG中检测荧光素酶活性₂细胞、巨噬细胞和脂肪细胞。在HepG中检测(G+T)荧光素酶活性₂在巨噬细胞中检测到（A+C）。另一方面，（G+T）和（A+C）的荧光素酶活性与不含插入物的对照pGL3碱性质粒没有差异。迁移率移位分析显示，使用HepG可产生一个特定的移位带₂核提取物和两种寡核苷酸均含有SNP rs6857530A和G，同时它还显示了另一种SNP rs6857530G的特异性移位带。迁移率转移分析显示，使用巨噬细胞核提取物和单核苷酸多态性rs6857530G的寡核苷酸（但不使用单核苷酸多态性rs6857530A）可产生一个特定的转移带。从这些结果来看，NPY2R的单核苷酸多态性和细胞类型依赖性表达可能是理解两者之间关联机制的相关因素NPY2R单核苷酸多态性和血浆高密度脂蛋白胆固醇水平。

关键字

神经肽Y，神经肽Y2受体，SNPs, HepG₂，巨噬细胞，脂肪细胞，荧光素酶活性，迁移率测定，高密度脂蛋白

介绍

神经肽Y (NPY)被称为食欲生成肽，它通过NPY1受体(NPY1R)[1]刺激下丘脑的食欲。NPY在人体[2]中不仅通过NPY1R，而且通过NPY2R和NPY5R发挥多效作用。在啮齿动物和人类中，NPY通过下丘脑NPY2R抑制食欲[3,4]。然而，之前的报道已经证明应激诱导的内脏肥胖通过NPY2R在肝脏和脂肪组织，包括小鼠[5]的巨噬细胞。应激不仅刺激肾上腺皮质释放皮质醇，还刺激交感神经末梢释放儿茶酚胺和NPY。NPY还通过NPY2R[6]诱导人血管组织缺血性血管生成和斑块不稳定性。我们之前已经调查了5 '侧翼区域之间的联系NPY2R到市健康中心接受健康检查的受试者的snp和代谢特征[7]。不同SNP类型的受试者血浆高密度脂蛋白-胆固醇水平存在显著差异(rs6857530;GG < GA < AA或rs6857715;TT < TC < CC)。然而，这种关联背后的机制NPY2R基因变异和血浆高密度脂蛋白胆固醇水平仍有待阐明NPY2R基因单核苷酸多态性rs6857530或rs6857715，并使用这些瞬时转染HepG的构建物检测荧光素酶活性₂巨噬细胞和脂肪细胞。为了了解SNP依赖荧光素酶活性的机制，我们还使用含有SNP rs6857530型的寡核苷酸和HepG的核提取物进行了迁移位移分析₂和巨噬细胞。

材料和方法

报告质粒的构建

基因转录起始位点-662至+13的序列NPY2R利用引物(正向引物;5 ' -GCAGACACCTGTTAGGGAAATTGCTG-3 '和反引物5 ' -TCTCAGCCGCCTCCCGGGCTTGCAA-3 ')(图1a)。如前所述，使用酚-氯仿法从具有SNP类型的受试者全血细胞中提取DNA[8,9]。我们的研究得到了兵库大学研究伦理委员会[7]的批准。PCR产物与pT7 blue vector (Novagen)(图1b)按照厂家方案进行连接。亚克隆后，该构建物和pGL3-Basic/启动子载体(Promega Corp.， Madison, WI)(图1-b)用Hind III和Kpn I (New England Biolabs, Ipswich, MA)酶切并根据制造商的协议连接。克隆后，我们获得了带有(G+T)或(A+C)的pGL3-Basic质粒，并利用自动测序仪进行DNA测序，确认了质粒的DNA插入(Applied Biosystems)(图1c)。

图1。对于荧光素酶实验，从NPY2R使用引物（a）从每个SNP的血细胞DNA中扩增基因转录起始位点。荧光素酶启动子质粒pGL3-Basic、用于荧光素酶分析正常化的pRL-SV40和pT7-Blue如图所示（b）PCR产物经TA克隆后重新插入pGL3碱性质粒，DNA测序（C）证实插入物的正确定位和SNP分型。

细胞培养

人肝癌细胞系HepG₂（JCRB1371）、人急性单核细胞白血病细胞系THP-1（JCRB0112.1）和小鼠成纤维细胞系3T3-L1（IF050416）从日本大阪国立生物医学创新研究所的JCRB细胞库中获得₂在DMEM中加入1 g/L葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、10%胎牛血清(FBS) (GIBCO)培养细胞。THP-1细胞在含有5%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，加入160 nM佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯分化为巨噬细胞(LC Laboratories, Woburn, MA)。3T3-L1细胞在含1 g/L葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、10%胎牛血清的DMEM中培养，先加入170 nM胰岛素(SAFC Biosciences) + 0.5 mM IBMX (SIGMA) + 250 nM地塞米松，再加入170 nM胰岛素[10]，分化成脂肪细胞。所有细胞培养在37℃，5% CO下进行₂在湿化培养箱中，每2-3天更换一次培养基。

荧光素酶报告实验

所有细胞接种于12孔板中。phorbol 12-myristate 13-acetate添加1 d后，THP-1细胞分化为巨噬细胞。加入初始鸡尾酒后2-3周，3T3-L1细胞分化为脂肪细胞。当HepG₂细胞亚汇合，巨噬细胞和脂肪细胞在分化至少一周后继续保持稳定，细胞与1µg未插入的指示质粒或对照质粒以及10 ng含有SV40启动子的pRL-SV40质粒共转染，SV40启动子连接到组成性表达的Renilla荧光素酶报告基因（Promega）（如图1b所示）。使用FuGENE（Promega）进行24小时的转染。根据制造商的说明收集细胞，并使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）和Turner design发光计TD-20/20（日本东京Promega）测定荧光素酶活性如前所述[11]。所有数据均标准化为Renilla荧光素酶活性。实验至少进行了三次，共四次。统计显著性通过使用SPSS（IBM SPSS，v.22.0）进行方差分析进行评估。

迁移率漂移分析

迁移率转移分析采用的方法与我们之前报告中使用的方法略有不同[11,12]。简而言之，HepG的核提取物₂使用NE-PER核和细胞质提取试剂盒（Thermo-Scientific）制备。使用

根据制造商的说明，LightShift Chemiluminescent EMSA试剂盒(Thermo Scientific)。反应混合物由核提取物、结合缓冲液、2.5%甘油、5 mM氯化镁组成，共20 μl₂， 50 ng/μl poly (dI/dC)， 0.05% NP-40和40 fmole生物素标记寡核苷酸

SNP rs6857530G或rs6857530A。未标记的(竞争对手)或5 ' -生物素化寡核苷酸rs6857530G (5 ' -GCTGATCATGGGCGGCAGATCTGAATCG-3'）或rs6857530A（5'-GCTGAT CATGGGC一个合成了GCAGGACTGACTCG-3’（通用生物技术公司）.对于竞争分析，添加0.8至8 pmole未标记的寡核苷酸作为竞争物。进行结合反应20分钟。在0.5 x TBE的6%聚丙烯酰胺凝胶上分离复合物。电泳后，在380 mA下将凝胶电转移到尼龙膜上30分钟。通过反式照明器交联后，进行印迹清洗、堵塞膜，并与链霉亲和素-辣根过氧化物酶溶液反应。与鲁米诺/增强剂溶液反应后，将膜暴露于ECL微型摄像机（阿默森药房生物技术公司）。

后果

我们在HepG中进行了荧光素酶分析₂，巨噬细胞从THP-1分化，脂肪细胞从3T3-L1分化，以研究NPY2R包括SNPs rs6857530G+rs6857715T (G+T)或rs6857530A+ rs6857715C (A+C)在内的顺式调控区域(转录起始位点的-662至+13序列)均可诱导转录活性。我们用含有(G+T)或(A+C)的pGL3-Basic启动子质粒，或不含插入(对照)的pGL3-Basic启动子质粒与pRL-SV40(含Renilla荧光素酶)共转染细胞系进行归一化。HepG细胞裂解物荧光素酶的相对活性₂(G+T)插入pGL3-Basic质粒为4.9±3.0(均值±SD)，显著高于(A+C);1.48±0.76 (P<0.05)，对照组;1.0±0.3 (P<0.05)(图2a)。(A+C)插入pGL3-Basic质粒的巨噬细胞裂解液的荧光素酶相对活性为2.72±0.48，显著高于(G+T);1.5±0.51 (P<0.05);1.0±0.21 (P<0.05)(图2b)。未检测到(G+T)和(A+C)插入pGL3-Basic质粒的脂肪细胞裂解液的荧光素酶活性(G+T;1.07±0.21 a + c;1.08±0.15及对照;1.0±0.07,P=0.694)(图2c)。

图2。荧光素酶在HepG中的活性₂细胞(a)、THP-1细胞分化的巨噬细胞(b)、5’-转染的3T3-L1细胞的脂肪细胞(c)NPY2R带有单核苷酸多态性rs6857530G+rs6857715T（G+T）或rs6857530A+rs6857715C（A+C）的基因。每个条代表平均值+/-标准偏差。*P<0.05vs。HepG中的控制和（A+C）₂（a） *P<0.05vs。巨噬细胞的(G+T)控制(b)。无插入的pGL3-Basic质粒。

SNP rs6857530位于公认的Sp1共识引用5 ' -(G/T)GGGCGG（G/A）（G/A）（C/T）-3’。SNP rs6857530G符合该一致序列的80%，而SNP rs6857530A符合70%。为了阐明SNP和细胞类型依赖性转录活性的原因，使用带有rs6857530G或rs6857530A的寡核苷酸和HepG的核提取物进行迁移率转移分析₂和巨噬细胞。当使用HepG的核提取物时，移动分析也显示出类似的条带₂以及含有rs6857530A或rs6857530G的寡核苷酸（图3a，箭头A）。此外，只有当试验使用含有rs6857530G的寡核苷酸（图3a，箭头B）时，迁移率转移试验才显示另一条带.流动性转移试验显示，当试验使用带有rs6857530G的巨噬细胞和寡核苷酸的核提取物，但不使用rs6857530A（图3b）时，出现单一条带。所有这些都出现了特定的转移带，因为未添加核提取物时未检测到条带，并且通过剂量依赖性添加未标记的竞争对手时，条带不清晰。

图3。迁移率移位分析显示，使用HepG的核提取物可产生特定的移位带₂具有顺式调节区寡核苷酸的细胞(a)和巨噬细胞(b)NPY2R基因rs6857530A和rs6857530G。

讨论

我们之前已经证明了这一点NPY2R上游基因snp与健康受试者血浆hdl -胆固醇水平相关肝细胞、脂肪细胞和巨噬细胞对测定血浆hdl -胆固醇水平很重要。由于该SNP位于顺式调节区域NPY2R基因，我们假设NPY2R基因表达依赖于HepG中的这种SNP类型₂以THP-1分化的巨噬细胞、3T3-L1分化的脂肪细胞为模型。转录水平的NPY2R无论SNP类型或细胞类型如何，通过荧光素酶分析评估基因低或缺失。这与Gepis组织或基因卡中的数据一致。这些数据库显示NPY2R基因在肝脏、脂肪细胞、单核细胞等多种细胞中广泛表达，但表达水平较低。有趣的是，本研究证实了pGL3-Basic质粒的荧光素酶活性NPY2R与单核苷酸多态性基因上游(G + T)中检测出HepG2细胞,与单核苷酸多态性(A + C)中检测出巨噬细胞(图2)。有趣的是推测肝NPY2R表达主题的单核苷酸多态性(G + T)与(A + C)但不降低血浆脂蛋白胆固醇水平,NPY2R巨噬细胞表达的主题与单核苷酸多态性(A + C)而不是(G+T)提高血浆高密度脂蛋白胆固醇水平。肝脏表达血浆hdl -胆固醇的主要调节因子，如载脂蛋白A1 (Apo A1)、ApoA1结合蛋白、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、清清剂受体- b1和肝脂肪酶[13-15]。THP-1表达血浆hdl -胆固醇的主要调控因子，如ATP结合盒A1和ATP结合盒G1[16,17]。在HepG2和巨噬细胞中，NPY如何通过NPY2R调控HDL代谢相关分子的表达，尚需进一步研究。插入pGL3-Basic质粒的荧光素酶活性NPY2R在脂肪细胞中未检测到(G+T)和(A+C)两种SNP的上游基因(图2)，这表明血浆hdl -胆固醇水平的差异不太可能归因于脂肪细胞中NPY2R表达的SNP依赖差异。但是，我们不能排除荧光素酶活性的缺乏是由于前脂肪细胞的物种差异造成的可能性。没有人前脂肪细胞系。

rs6857715附近的序列不包括可能与已知转录因子结合的一致序列(DNASIS-Mac v3.2;日立东京,日本)。因此，两者之间的关联背后的机制NPY2R基因SNP rs6857715和血浆hdl -胆固醇水平仍不清楚。然而，rs6857530附近的序列包含了可能与Sp1结合的一致序列。有报道称Sp1是一种锌指转录因子，与许多启动子的富G-C基序结合，参与细胞生长、凋亡、分化和免疫应答等多种过程[18-20]。在本研究中，迁移迁移实验证实了类似的HepG复合物₂含有含有rs6857530G或rs6857530A的寡核苷酸的核提取物和含有rs6857530G的寡核苷酸的另一复合物（图3a）。另一方面，流动性移位实验显示巨噬细胞核提取物有单一复合物，含有rs6857530G，而没有rs6857530A(图3b)。如果图3a中箭头a所示的条带和图3b中箭头所示的条带被认为包含一个阻遏因子，而图3a中箭头B所示的条带包含一个激活因子，那么这可能与SNP和细胞类型依赖的转录活性是一致的。虽然还需要另一个假设，即激活因子比抑制因子更有效地激活转录NPY2RHepG中的SNP基因rs6857530G₂什么样的转录因子与单核苷酸多态性和细胞依赖性相关尚待澄清NPY2R基因转录活动。

这些结果表明NPY2R肝细胞中的（G+T）基因和巨噬细胞中的（A+C）基因可能至少部分决定血浆HDL胆固醇水平。最近的药物，如CETP抑制剂，可以提高血浆高密度脂蛋白胆固醇水平，但不会降低心血管事件复发的风险[21]。因此，简单降低血浆高密度脂蛋白胆固醇是否有益仍有争议。此外，HDL具有包括免疫功能在内的多效性作用[22]。虽然需要进一步研究以了解更精确的潜在机制，但NPY2R可能是治疗特定疾病患者低HDL胆固醇血症的有用靶点NPY2R基因单核苷酸多态性。

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