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摘要

背景:弥漫性轴索损伤(DAI)是脑外伤的主要病因之一，是由脑快速变形引起的神经元轴突的冲动拉伸引起的。DAI以细胞器和蛋白质积累形成的轴突逐渐肿胀为特征，这种肿胀是DAI病理的形态学标志。近年来，随着计算力学的快速发展，整个损伤大脑的应力和应变细节逐渐清晰，有限元头部模型能够更好地预测脑损伤，并以更详细的神经元耐受标准评估保护安全方法。本研究通过对培养的大鼠皮层神经元β-淀粉样前体蛋白(β-APP)的观察，评估精确控制的脉冲应变和应变率引起的轴突损伤，并获得各轴突运输功能障碍和破坏水平对功能障碍的耐受标准。方法:研制了能向神经元提供不同应变组合和应变速率的单轴拉伸装置。通过对比显微镜下基底的实验位移历史和培养基底的FE应变分布分析，验证了神经元的不同加载条件。采用不同菌株组合和应变率对大鼠原代皮层神经元进行拉伸，加载后3h对β-APP进行免疫染色，荧光显微镜观察。结果:通过荧光图像观察和计数拉伸后β-APP-积累在轴突上形成的肿胀和球的数量。轴突运输的功能障碍定义为具有β- app -积累的轴突肿胀的神经元的比率，轴突运输的中断分别定义为具有β- app -积累的轴突球的神经元的比率。随着应变和应变速率的增加，轴突转运功能紊乱程度增加。 Conclusions: The mechanical threshold of dysfunction and disruption of axonal transport were the strain with 0.22 and the strain rate with 27 /s. The intervals between swellings on an axon are constant and do not depend on the axonal injury level nor the magnitude of the strain of the axons.

关键字

创伤性脑损伤，弥漫性轴索损伤，β-淀粉样前体蛋白，轴突肿胀，轴突球，损伤阈值，轴突运输，有限元法，轴突拉伸，脉冲应变

背景

弥漫性轴索损伤(DAI)是由头部突然的惯性载荷引起的神经细胞广泛损伤，并伴有脑组织[1]快速变形引起的神经轴突拉伸。这种机械损伤破坏轴突细胞骨架中的神经丝结构，导致局部压实和/或运输受损。由此产生的神经丝和运输物质的积累引起局灶性轴突肿胀[2]。轴突肿胀导致继发性轴突切开术，导致神经元与靶组织断开，细胞死亡[3,4]。

与细胞器和蛋白质积累相关的轴突肿胀是DAI病理[5]的形态学标志。过去DAI的组织学诊断多采用银染色，既往称为“轴突回缩球”，但头部损伤[6]后，一般需12- 24h后才会出现回缩球。早期检测可以通过免疫标记通过轴突转运[7]传递的β-淀粉样前体蛋白(β-APP)来实现。β-APP在轴突运输中断的地方积聚[8]，早在头部损伤后1.75-3小时就可检测到β-APP[9-11]。威尔金森等．[12]通过测量β- app免疫标记的损伤轴突的最小直径，研究了死后脑组织中受损轴突肿胀的大小与生存时间之间的关系，并报道了轴突肿胀的平均大小与生存时间之间存在强、正、显著的关系。

更好地理解轴突损伤各个阶段的生物力学和病理生理学之间的关系，可能会为创伤性轴突损伤的预防和治疗提供未来的进展。近年来，包括详细大脑结构在内的头部有限元模型作为一种生物力学方法被开发出来，被认为是研究人类头部在各种撞击条件下响应的最有力工具。有限元模型不仅能够预测大脑在各种撞击条件下的应力和应变，而且能够预测细胞的损伤和死亡，具有更详细的神经细胞耐受标准。从力学角度出发，应提供与有限元模型更相容的形式，以组织水平荷载测量为依据的公差准则。

由于大脑是一个粘弹性的生物组织，它的机械响应取决于应变的大小和速率。当轴突受到脉冲拉伸时，应变总是伴随着不同的应变速率。研究脑组织变形引起的轴突损伤应采用与应变率相关的动态控制应变，其中基底位移的时程必须反复稳定地产生。然而，利用有限元模型难以获得与有限元模型相适应的应变和应变速率的公差准则在活的有机体内模型由于缺乏一个可访问的组织[13]。

然而，轴突损伤早期观察到的沿轴突的肿胀可通过拉伸和剪切应力再现在体外脑外伤患者弥漫性脑损伤后出现轴突肿胀，模型与病理有显著相似之处[14-17]。斯特等．[14]实现了一个在体外建立轴突损伤的单轴拉伸模型，分别独立控制应变和应变率，观察应变率对神经牵张损伤的影响。然而，轴突运输功能障碍和中断之间的区别没有被观察到，也没有提到功能障碍和中断的定量评估。脉冲应变与轴突损伤(轴突肿胀和球泡独立观察)之间的定量关系尚不清楚。

本研究通过观察培养的大鼠皮层神经元β-APP对脉冲拉伸致轴突损伤的影响。独立定义和观察轴突运输功能障碍和轴突运输中断，并评估轴突运输功能障碍和中断的机械阈值。

方法

单轴拉伸装置及PDMS腔

在动态加载条件下，膜上单轴拉伸的结果比双轴变形的结果更合适，以便定量评价应变速率对拉伸损伤神经元的影响。为了实现不同应变速率下的单轴应变，研制了单轴拉伸装置。研制了具有薄衬底的聚二甲基硅氧烷(PDMS)腔体。利用有限元法计算了神经元培养基质中心周围的应变分布。

结果表明:在拉伸方向上，垂直应变与应变之比保持在10%以内;单轴拉伸装置由伺服驱动器(RCS3-SA8C, IAI，静冈县，日本)，伺服驱动器控制器(SCON-C;IAI)，用于测量拉伸位移的线性传感器(LP-20F, Midori precision，东京，日本)，用于测量拉伸载荷的测压元件(TCLS, Toyo Sokki，神奈川，日本)，测压元件转换器(LC14111, Unipulse，东京，日本)，可编程逻辑控制器，a /D转换器单元(KV-3000 CPU, Keyence，大阪，日本)，交流电源单元(KV-U7, Keyence)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)室，如图1(a)所示。

数字1.单轴拉伸装置

单轴拉伸装置及其部件。该装置由显微镜台上的PDMS室、线性传感器、测压元件、伺服驱动器和电线(a)组成。PDMS室的一端夹在显微镜台上，另一端连接到不锈钢板上，通过撞击塞子(B1)来停止位移。不锈钢板通过导线与执行器滑块连接，导线的另一端与铁片(B2)连接。铁块被设置在滑块上的磁铁强烈吸引。(B3)。分别给出了拉伸过程(C1)和释放过程(C2)的装置加载机构示意图。

PDMS腔体的一端夹紧在显微镜台上，腔体的另一端连接在不锈钢板上，通过撞击塞子(B1)来停止不锈钢板的位移。不锈钢板通过导线与执行器滑块连接，导线的另一端与铁片(B2)连接。铁块被滑块(B3)上设置的磁铁强烈吸引。加载机构的原理图如图1所示，分别为拉伸过程(C1)和释放过程(C2)拉伸和释放过程分别描述如下。连接到PDMS室的不锈钢板由伺服驱动器通过导线沿(C1)所示箭头方向拉动。不锈钢板被拉和移动，直到板击中塞子。不锈钢板保持在原来的位置，在执行机构的加速度由松弛的电线和室突然拉在一个恒定的速度，一旦张力应用到电线。固定在PDMS腔室底部的衬底在拉伸PDMS腔室的同时被拉伸。在拉伸过程的最后阶段，不锈钢板撞击塞子并突然停止，铁片从滑块上的磁铁上分离(C2)。随后，PDMS腔和衬底在弹性力的作用下被拉伸回到原来的状态。通过上述过程，该装置可以在拉伸和释放过程中产生半正弦位移波形。

带井和薄衬底的PDMS腔室的基本结构如图2(a)所示。以10:1的质量比将基础、pdms预聚体和固化剂(SYLGARD 184有机硅弹性体套件，道康宁，米德兰，密歇根州，美国)混合，并在连接到干燥真空泵的圆形干燥器中对混合物进行除氧。将除氧后的混合物分别倒入聚苯乙烯方盒和厚度分别为0.3 mm和10mm的不锈钢模具中(B)，在65℃的热板上固化1h。固化后，两部分用除氧混合物粘结，在65°C下固化1h (C)。

数字2.PDMS室

有孔的PDMS腔室，四个点固定在不锈钢板上，将厚度为0.3 mm的薄PDMS基板粘在高度为10mm的PDMS板下烘烤。用固定在腔室下面的不锈钢板拉伸腔室(A)，细胞在孔底面的中心区域用10mm × 30mm进行培养(B)。PDMS腔室烧制并硬化(C)。

培养表面应变分布的有限元分析

采用有限元法对培养表面的应变分布进行了数值分析。腔室的有限元模型如图3(A)所示。x轴的一个方向对应拉伸方向和y轴对应于在坐标系中垂直于拉伸方向。

数字3.PDMS室应变分布的有限元分析

通过有限元分析得到了PDMS室的应变分布。PDMS室的有限元模型(A).培养基质在PDMS室位移4 mm时的纵向(B1)和横向(B2)应变分布。拉伸位移与培养基质四个点(C1)的纵向应变(C2)或横向应变(C3)之间的关系。

采用LS-DYNA ver有限元软件进行了数值计算。采用LSTC (Livermore Software Technology Corporation, CA, USA)的971和JSOL (Tokyo, Japan)的Jvision 3.0作为前后处理器。腔室模型的材料性质如下[18]所示。密度:9.2 × 10²公斤/米^3.杨氏模量:0.75 MPa，泊松比:0.49

拉伸数值分析结果如图3(B)和(C)所示，腔室以0.5 m/s的速度拉伸4mm。整个培养面纵向即x轴方向的应变分布如图3(B1)所示，垂直于拉伸方向即y轴方向的应变分布如图3(B2)所示。拉伸方向的应变(B1)表示拉伸，垂直于拉伸方向的应变(B2)表示压缩。在培养表面的四个元素上评估了拉伸应变。a、b、c、d四个点如图3(C1)所示。x轴方向上4个点的应变如图3(C2)所示，y轴方向上的应变分别如图3(C3)所示。如图3(C2)所示，当最大拉伸位移为4mm时，b点、c点和d点拉伸方向上的拉伸应变为0.3，而在离培养面末端(较短边缘)较近的点上，拉伸应变为0.25。在c点和d点的培养面中心附近产生了垂直于拉伸方向的0.02 - 0.03的压应变，越靠近边缘应变越大，在a点产生了较大的0.06-0.07的压应变，如图3(C3)所示。在c点处得到拉伸方向上的拉应变为0.3，在垂直方向上的压应变为0.02-0.03。

数值计算结果表明，与拉伸方向的拉应变相比，垂直方向的压应变可以控制在10%以内。

培养面中心的位移历史

实验测量了PDMS腔内培养面中心的变形。PDMS腔体通过单轴拉伸装置，每次拉伸0.5 mm，共拉伸4mm。在显微镜下观察培养面中心区域并拍照，根据表面附着的标记，通过图像分析计算中心周围的应变。

通过显微镜图像计算拉伸前后PDMS室培养物的Green-Lagrange应变。每0.5 mm位移到4mm共得到培养基质中心点拉伸方向和垂直方向上的应变，并绘制在图4(A)中。实验中，在最大位移为4 mm时，拉伸方向拉应变为0.3，垂直于拉伸方向的压应变小于0.03。不同拉伸速度下中心点位移历史如图4(B)所示。冲击1对应应变速率为11 s时的应变0.10^－1，冲击2对应应变速率21 s时应变为0.15^－1，冲击3对应应变速率为27 s时的应变为0.22^－1冲击4对应应变速率为38 s时的应变为0.30^－1,分别。曲线在前10毫秒内通过拉伸而站立，在后10毫秒通过与站立相同的比例释放而收敛。预期基底上的神经元通过基底被拉伸/压缩，具有类似的变形历史。

数字4.PDMS室位移测量

实验观察了固定在PDMS室上的培养基质在单轴拉伸时的应变和位移。得到了强迫位移与细胞培养中心周围变形的关系。与纵向应变(A)相比，垂直于拉伸方向的应变保持在10%以内，位移对应于几次冲击(冲击1:应变0.10，应变速率11s)^－1，冲击2:0.15,21秒^－1，冲击3:0.22,27秒^－1，影响4;0.30 38秒^－1)表示为时间的函数。在所有四种情况下，位移通过拉伸在10毫秒内达到最大值，并在接下来的10毫秒内通过释放(B)返回到原始位置。

大鼠皮层初级神经元的培养

原代大鼠皮层神经元(Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)在添加2.5 mL/L GLUTAMAX-I (Gibco)和20 mL/L B27 Supplement (Gibco)的Neurobasal培养基(Gibco)中培养，条件为5% CO₂37°C湿度100%。将细胞以6 × 10的速度接种到PDMS室的poly - d -lysine包被培养底物(10 mm × 30 mm)中⁴细胞/厘米²7-9天，如图5所示。将年龄与受应变的神经元在PDMS室中培养，作为假对照，在不接受任何机械负荷的情况下，将神经元置于单轴拉伸装置中并从单轴拉伸装置中取出。

数字5.培养神经元的荧光图像

大鼠皮层神经元(绿色)和星形胶质细胞(红色)的荧光图像。微管相关蛋白2 (MAP2)染色标记树突，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色标记星形胶质细胞。

实验过程中，PDMS腔内的介质未被清除，实验时间为5 min。设备和环境温度均保持在37℃。实验结束后将PDMS箱放回CO2培养箱。

轴突损伤的单轴拉伸

轴突拉伸后动态变形的一个主要影响是轴突运输的中断，导致在短短几个小时内运输物质在轴突肿胀中积累[17]。肿胀沿连接的轴突呈周期性间隔出现，就像串珠一样，形成一种病理表型，称为“轴突静脉曲张”[19]。创伤性脑损伤(TBI)后不久发现的轴突病理是轴突断开点处的单个肿胀，被描述为末端“轴突球”(以前称为“缩回球”)[1,19 -21]。在本研究中，β-APP在加载后3小时进行染色，并使用配备荧光镜单元(U-MWIG3, Olympus)的倒置荧光显微镜(IX71, Olympus, Japan)进行观察。培养物用杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)和Ca冲洗^{2 +}和毫克^{2 +}在室温下用4%的多聚甲醛固定20分钟。

用0.3% Triton X-100在室温下渗透5分钟后，用5%山羊血清在室温下阻断60分钟，并以1:50稀释的兔多克隆抗-β-APP (51-2700, Invitrogen, Life Technologies)作为一抗，在4℃过夜。随后，10 μg/mL Alexa Fluor 594偶联山羊抗兔IgG (H+L)二抗(A-11037, Molecular Probes, Life Technologies)室温作用60分钟。Β-APP-accumulated拉伸后形成的轴突肿胀和轴突鳞茎通过荧光图像进行定量观察和计数，如图6所示。

数字6.β应用免疫染色

假对照(上)、轴突肿胀(中)和轴突球泡(下)的相位对比图(左)和荧光图(右)。β-APP为红色。在应变为0.30，应变速率为38 s的拉伸条件下，β-APP在轴突膨大体和轴突球中积累^－1．

轴突转运功能障碍定义为β- APP累积轴突肿胀的神经元比例。轴突运输的中断被定义为具有累积β- app的轴突球的神经元的比率。此外，我们还分别评估了每100 μm轴突肿胀的数量和轴突球所处的轴突长度。轴突长度由Image J(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD, USA)手动测量。结果以4次独立实验的均数±标准差(SD)表示。每个PDMS底物共分析200-300个神经元。均数比较采用Steel的多重比较检验。一个p小于0.05被认为是显著的。

结果与讨论

当应变为0.22，应变速率为27 s时，积累β- app的轴突显著增加^－1应变为0.30，应变速率为38 s^－1如图7中的“*”所示。虽然随着应变和应变速率的增加，膨胀的轴突数量显著增加，但可以认为球泡的产生是伴随着的一定的阈值，如0.22和27秒^－1．轴突的快速拉伸可损伤轴突细胞骨架，导致轴突细胞失去弹性，轴质转运受损。轴突随后的膨胀发生在离散的球泡形成或在积累细胞器的细长静脉曲张中。透射电镜(TEM)紧随其后在体外拉伸显示沿轴突的单个微管周期性断裂，区域对应轴突形态的波动。

数字7.轴突损伤的形成率

有β- app积累的轴突肿胀(左)和轴突鳞茎(右)的神经元比例。四对应变和应变速率也如图4(B)所示。*符号表示在每个条件下使用Steel的多重比较检验与假对照相比具有统计学意义的差异(p < 0.05)。结果以4次独立实验的均数±标准差(SD)表示。

然而，在轴突的任何区域，通常只有不到三分之一的微管断裂。在数小时内，这些微管断裂部位演变为周期性肿胀，导致不偏不倚的转运中断[22]。肿胀的产生可以看作是轴突运输的时间功能障碍，在神经元与目标组织断开连接的过程中发生继发性轴突切开术，细胞死亡。

综上所述，在应变速率为27 s时，应变为0.22时，轴突转运功能障碍和中断的阈值^－1．豚鼠视神经电生理阈值报道为0.33[33]，大鼠脑切片培养引起海马细胞死亡的应变阈值报道为0.18[33]。两个先前的研究表明，我们的研究中获得的功能障碍和中断的阈值是相当适当的

LaPlaca等．[24]报道3D培养神经元的细胞损伤和细胞死亡的应变速率小于30 s^－1．至少0.05应变[25]损伤后可观察到波动。虽然需要更详细和广泛接受的评估方法来判断轴突运输功能障碍和神经元断开，但观察β-APP的积累仍可能是细胞水平上创伤性轴突损伤最可靠的定量标志物之一。

与假对照组相比，每100 μm轴突肿胀数呈拉伸依赖关系略有增加;但拉伸条件之间的变化不显著，如图8(左)所示。如图8(右)所示，可见轴突球所在轴突的轴突长度也无统计学意义上的显著变化。上述结果表明，无论拉伸条件如何，轴突肿胀都是在固定的间隔内形成的。

数字8.轴突损伤的正常化

左为每100 μm轴突肿胀数，右为观察到轴突球的轴突长度。四对应变和应变速率也如图4(B)所示。

Monnerie等．[26]报道在轴突拉伸损伤后5 min ~ 5 h, 70 ~ 90%的珠粒在0 ~ 10 μm范围内分离，沿枝晶轴分布规律相似。满足等．[13]也报道海马细胞死亡与组织应变有关，而与应变率无关。

随着近年来以有限元为代表的计算力学的迅速发展和一些头部有限元模型的建立，力学意义上的神经元耐受度或轴突损伤阈值变得越来越重要[27-29]。虽然头部损伤标准(HIC)是最广泛接受的损伤标准，但HIC不能包括脑损伤和硬膜下血肿等脑震荡。由于HIC仅由相对于时间的合成平移加速度来定义，因此很难找到HIC与旋转头部运动[30]之间的相关性。培养轴突方向被控制的神经元，是为了更精确地接受神经元详细的机械阈值要求。Nakadate利用微流体培养技术控制神经元轴突伸长方向，建立了单轴拉伸培养神经元的实验模型等．[31]。他们通过使用PC12细胞表明，轴突相对于拉伸方向的取向角的差异影响了轴突肿胀、断裂和收缩的形成。

相反，脑震荡性轻度创伤性脑损伤一直备受关注，因为尽管名字如此，但这些损伤绝不是“轻微的”，而且事故本身有时会被忽视和重复。重复创伤性损伤可导致脑细胞的累积性损伤，与中、重度脑损伤相比，损伤较为严重。人类脑震荡的生物力学研究试图将机械输入与局部组织变形(如压力、应力/应变反应)联系起来，这对于正确评估脑损伤结果是必要的。必须有一个阈值，低于这个阈值就不会发生功能损失，超过这个阈值就会发生不可逆转的大脑功能变化。损伤后后遗症很难在细胞水平上解决在活的有机体内．的在体外Slemmer报道了实验研究等．［33］．膜变形的程度导致双轴应变或拉伸分别为0.31(轻度)，0.38(中度)和0.54(严重)，这表明海马细胞可能易受反复轻度创伤损伤后的累积损伤。单轴拉伸装置可以更独立地控制应变和应变速率，有望应用于方向可控的神经元轴突上。这可能使单个神经元损伤与重复损伤的累积量联系起来，因为每个轴突都被清楚地识别。

结论

研制了一种能同时给予神经元应变和应变率的单轴拉伸装置。在PDMS底物上培养的大鼠原代皮层神经元轴突被一些应变和应变速率拉伸。β-APP在加载3 h后进行免疫染色，荧光显微镜观察。通过获得荧光图像，计数β-APP积累拉伸后轴突肿胀和轴突上产生的球。轴突运输功能障碍定义为具有累积β- app的轴突肿胀的神经元的比率，以及具有累积β- app的轴突球的神经元的比率。随着应变和应变速率的增加，轴突转运的功能障碍和中断程度逐渐加重。轴突转运功能障碍和中断的阈值为应变为0.22，应变速率为27 s^－1．轴突肿胀之间的间隔相当恒定，不受损伤的程度或轴突应变的大小的影响。

相互竞争的利益

OAT版权所有。版权所有

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

SA设计了这项研究。HN开发了这种设备。YK进行数值分析并观察免疫荧光染色。AN参与序列比对。RW构思了这项研究，参与了设计和协调，并帮助起草了手稿。所有作者均已阅读并批准最终稿。

确认

这项工作得到了日本科学促进会的科学研究资助(B)(25289064)和青年科学家资助(B)(24700459)的部分支持。

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