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摘要

eb病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染在10%的胃癌病例中存在，并在胃癌发生中发挥作用。自从抗HER2抗体曲妥珠单抗在HER2过表达胃癌中的疗效被证明以来，HER2的表达受到了越来越多的关注。然而，在EBV+胃癌中HER2过表达的频率明显较低。本研究的目的是分析EBV感染与胃癌细胞株HER2表达之间的关系。我们使用了her2阳性的胃癌细胞系JRST。采用细胞-细胞接触法感染EBV，命名为JRST-EBV。同时建立了转染新霉素抗性基因的细胞系;这些被用作对照，被称为JRST-Neo。采用real-time RT-PCR、western blot、MTT、scratch和caspase 3分析EBV感染对JRST的影响。在JRST-EBV和JRST-Neo细胞中HER2 mrna表达水平相似。 In contrast, HER2 proteinexpression levels were lower in JRST-EBV cells than in JRST-Neo cells. Expression of phospho MAPK and phosphor Akt, both of which are downstream signal molecules of HER2, was alsoreduced in JRST-EBV cells. MTT assays showed that proliferation activity was significantly lower in JRST-EBV cells than in JRST-Neo cells. Scratch assays showed that cell migration was significantlylower in JRST-EBV cells than in JRST-Neo cells. Caspase 3 assays showed that trastuzumab-induced apoptosis was lower in JRST-EBV cells than in JRST-Neo cells. Trastuzumab reduced migration of JRST-Neo cells but not that of JRST-EBV cells. These results suggest that EBV infection plays asuppressive role in HER2 expression in gastric cancer cells, which may explain the mutually exclusive relationship between EBV infection and HER2 expression in human gastric cancer.

关键词

EB病毒，胃癌，HER2，曲妥珠单抗，基因扩增

介绍

胃癌(GC)是全球癌症死亡率的第三大原因[1]。GC是一种异质性疾病，有多种环境病因和替代的致癌途径[2-5]。最近，癌症基因组图谱(TCGA)对胃癌进行了全面的分子鉴定，提出了一种分子分类，将胃癌分为四种亚型:eb病毒(EBV)阳性癌、微卫星不稳定(MSI)阳性癌、基因组稳定癌和染色体不稳定(CIN)[6]癌。在大约10%的GC病例中观察到EBV感染[7-14]。EBV阳性(EBV+) GC以男性为主，主要位于胃近端，组织学呈淋巴上皮瘤样，预后较好，CpG岛高甲基化表型(CpG island hypermethylphenotype, CIMP)。在胃癌细胞中，EBV通过诱导胰岛素样生长因子介导的自分泌信号[15]促进细胞增殖。EBV+ GCs PIK3CA、ARID1A突变频繁，TP53突变罕见，JAK2、CD274(又称PD-L1)、PDCD1LG2(又称PD-L2)、ERBB2 (HER2)[6]反复扩增。最近，一种抗HER2抗体，曲妥珠单抗(Tmab)被证明可以延长HER2过表达的胃癌患者的生存期[16-19]。虽然HER2基因扩增是HER2过表达的主要原因，但并不是所有HER2扩增的GC病例在免疫组化分析中都显示HER2过表达。这些结果表明HER2的表达不仅受基因扩增的调控，还受其他机制的调控。 HER2 overexpression (strong intensity, score 3) was observed in only one case (0.8%) among 123 patients with EBV+ GCs [8]. Importantly, the significantly lower frequency of HER2 overexpression observed in EBV+ GCs was independent of Lauren subtype and clinical stage, which further supports the concept of EBV+ GC as a distinct biological entity [6]. EBV-encoded RNA(EBER) 1 reportedly suppressed HER2 expression in an ovarian cancer cell line [20]. However, no reports have shown any association between EBV infection and HER2 overexpression in GC cell lines. The aim of this study was to analyze the association between EBV infection and HER2 expression in GC cell lines by establishing EBV-infected HER2-expressing GC cell lines using the cell-cell contact method [21].

材料和方法

细胞培养和EBV感染的细胞-细胞接触法

使用表达HER2的人GC细胞系JRST。细胞在37℃下在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM（Sigma-Aldrich）中生长^°C在空气中二氧化碳含量为5%的增湿大气中。JRST细胞通过细胞-细胞接触法感染重组EBV[21]。将新霉素抗性基因插入BXLF1[22]中的伯基特淋巴瘤细胞系Akata被修饰以产生重组EBV，并被用作病毒源。通过在含有500 ng/ml G418的培养基中培养分离G418抗性细胞克隆。在使用G418进行选择后，EBV感染的克隆被大量保留，但在进行进一步实验之前24小时，将G418从EBV感染的GC细胞系的培养基中移除。单独转染新霉素耐药基因的细胞系也被建立为对照，称为JRST Neo。用抗补体免疫荧光法检测EBNA1在丙酮：甲醇（1:1）固定的细胞中的表达。

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

通过RT-PCR分析EBNA1、LMP2A、BARF0和EBER1的表达。从细胞系中提取总RNA。从总RNA合成cDNA，并使用400 ng/μl等份cDNA进行PCR。GAPDH基因用作内部对照。前面已经描述了用于扩增每个基因的PCR引物序列和热循环条件[21]。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，并在紫外线照射下通过溴化乙锭染色进行可视化。所有PCR至少重复两次以验证结果。

蛋白质印迹分析

将裂解后的细胞用RIPA裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂在TBS中刮取，制备细胞蛋白提取物。将样品稀释，调整蛋白浓度进行western blot分析。蛋白分别在7.5%和10%的SDS-PAGE凝胶上解析，用于分析HER2和其他蛋白。蛋白对照也进行电泳，随后转移到PVDF膜上。使用化学发光法和特异性抗体对样品进行可视化。使用的抗体有HER2 (3B5, Abcam)、Path Scan Multiplex Western Cocktail 1 (#7100, Cell Signaling)、Akt (#9272, Cell Signaling)、ERK1 (K-23, Santa Cruz)和actin (Thermo Fisher Scientific)。所有抗体均按制造商建议的浓度应用。

MTT法细胞增殖分析

采用MTT法测定细胞生长速率，使用cell count Kit-8 (Dojindo)。细胞以每孔2 × 103细胞的比例接种在96孔板上，在不含G418的10%胎牛血清中培养。孵育24、48、72和96 h后，每孔加入细胞计数试剂盒-8溶液，在450nm处测量吸光度。

体外迁移试验（划痕试验）

约1 × 106个细胞/孔接种在6孔板上，在含10%胎牛血清和不含G418的DMEM中培养，37℃过夜^°C + 5% CO_2.. 当细胞半汇合时，使用200μl移液管尖端轻轻划过平板的中心轴。用PBS冲洗培养皿并更换培养基。立即测量划痕的初始宽度。培养24、48、72和96小时后，测量剩余细胞穿过划痕线的迁移距离，如前所述[22]。所有划痕试验均重复进行。

Tmab治疗的敏感性分析

用caspase 3和划痕法检测Tmab(20µg/ml)的敏感性。

统计分析

所有统计分析均使用JMP软件。P值均为双侧，P< 0.05有统计学意义。

结果

ebv感染GC细胞的建立

采用细胞接触法建立了EBV感染的GC细胞系。用携带新霉素抗性基因的EBV感染JRST细胞，并在含有500 ng/ml G418的培养基中培养分离G418抗性细胞克隆。通过EBNA1、LMP2、BARF0和EBER1的RT-PCR以及EBER1的免疫荧光染色，在JRST-EBV细胞中确认了潜伏1型EBV感染（图1）。

图1。ebv感染GC细胞的建立。(a)在JRST-EBV和JRST-Neo细胞中进行EBNA1、LMP2A、BARF0和EBER1的RT-PCR检测。(b) EBNA1 inJRST-Neo和JRST-EBV细胞免疫荧光染色。Cl,克隆。

EBV感染后HER2表达的变化

实时RT-PCR分析EBV感染后HER2 mRNA表达的变化。HER2 mRNA表达在JRST-EBV和JRST Neo细胞之间没有差异（HER2的相对数量：1.3对1.1，P=0.35）。随后，进行westernblot分析以阐明EBV感染后HER2蛋白水平的变化。HER2蛋白在JRST-EBV细胞中的表达低于JRST Neo细胞（图2）。为了证实这一变化，我们对HER2进行了免疫荧光染色。HER2在JRST-EBV细胞中的染色也低于JRST Neo细胞（图2）。

图2。EBV感染后HER2表达的变化。(a) HER2 inJRST-Neo和JRST-EBV细胞的RT-PCR。(b) Western blot分析JRST-Neo和jrst - ebv细胞中的HER2。(c) JRST-Neo和JRST-EBV细胞HER2免疫荧光染色。Cl,克隆。

EBV感染对HER2下游信号的影响

westernblot分析HER2下游信号如MAPK和Akt的表达。尽管MAPK和Akt表达保持不变，但JRST-EBV细胞中磷酸化MAPK和磷酸化Akt的表达低于JRST Neo细胞（图3）。

图3。EBV感染对HER2下游信号的影响。western blot检测JRST-Neo和jrst - ebv细胞中磷酸化MAPK、MAPK、磷酸化Akt、Akt和PTEN的表达。Cl,克隆。

然而，PTEN wa2021的表达版权归OAT所有。版权所有

EBV感染对细胞增殖和迁移的影响

接下来，我们分析EBV感染对胃癌细胞增殖和迁移的影响。在MTT检测中，JRST-EBV细胞的增殖明显低于JRST-Neo细胞(P< 0.01)(图4)。为了评估EBV感染对GC细胞迁移的影响，进行划痕实验。JRST-EBV细胞的迁移活性明显低于JRST-Neo细胞(216 nm vs 316 nm, P=0.03)(图4)。

图4。EBV感染后细胞增殖和迁移。采用MTT法(a)和划痕法(b)分析JRST-Neo和JRST-EBV细胞的增殖和迁移。

EBV感染的GC细胞对Tmab治疗的敏感性降低

用caspase 3和划痕法检测Tmab敏感性。caspase 3检测结果显示，Tmab诱导的JRST-EBV细胞凋亡低于JRST-Neo细胞(图5)。Tmab减少了JRST-Neo细胞的迁移，但没有减少JRST-EBV细胞的迁移(图5)。

图5。EBV感染的GC细胞对Tmab治疗的敏感性降低。在JRST Neo和JRST-EBV细胞中使用半胱天冬酶3试验（a）和划痕试验（b）检测Tmab敏感性。

讨论

据报道，EBV+GCs表现出潜伏期I（或II）型EBV感染，并表达EBNA1、LMP2A、BARTs和EBER1/2[9]。在这项研究中，我们使用细胞-细胞接触法成功地用EBV感染了表达HER2的GC细胞系JRST[21]。RT-PCR和免疫荧光染色证实潜伏期1型乙型肝炎病毒感染。这些结果表明，感染EBV的JRST细胞是分析EBV感染和GC中HER2表达的合适模型。

有趣的是，EBV感染在蛋白质水平下调了HER2的表达，但在mRNA水平上没有下调。在ToGA研究中，22%的HER2扩增病例在免疫组化分析中未显示HER2蛋白过度表达[16]。我们的结果进一步支持了在GC中可能存在HER2表达抑制物的观点。EBV感染可能与在GC中观察到的HER2扩增和HER2过度表达之间的差异有关。

分析EBV感染对HER2下游信号的影响;phospho-MAPK和phospho-Akt表达下调，提示这种下调影响了肿瘤的表型。据报道，EBV感染通过启动子CpG岛甲基化诱导PTEN表达缺失，导致PI3K-AKT信号通路在GC[23]中激活。而EBV感染对JRST细胞中PTEN的表达无影响。

然后分析EBV感染的功能意义。EBV下调JRST GC细胞的增殖和迁移活性。这些结果提示HER2信号通路在表达HER2的JRST GC细胞株中发挥重要作用，因此EBV感染后其下调导致其增殖和迁移活性降低。最后，分析EBV感染对Tmab敏感性的影响。EBV感染降低了Tmab的抗肿瘤作用，提示EBV抑制HER2导致了Tmab耐药。抗Tmab的主要机制有三种:HER2结构或周围环境的改变，下游信号效应体的失调，如PIK3CA突变或PTEN失活，以及HER2与其他膜受体[19]的相互作用。在本研究中，EBV感染不影响JRST中PTEN的表达。为了解决GC中的问题，需要进行进一步的分析。

壮族等报道EBNA1可能在卵巢癌细胞系[20]中作为her2基因的转化抑制因子。两种病毒癌蛋白，SV40大T抗原和腺病毒-5 E1a基因产物，据报道也抑制HER2的表达[24,25]。由于EBNA1在结构和功能上与这些病毒癌蛋白不同，EBNA1可能通过一种不同的机制[20]抑制HER2的表达。壮族等提示EBNA1抑制HER2可能是由间接的蛋白-蛋白相互作用机制介导的，因为在HER2启动子元件[20]上没有发现EBNA1特异性的结合序列。需要进一步的分析来解决GC中的这些问题。

我们的研究结果提示，EBV感染对胃癌细胞HER2表达具有抑制作用，这可能解释了人类胃癌中EBV感染与HER2表达之间的互排性关系[8,12]。在临床环境中，Tmab可能对绝大多数EBV+ GC患者没有希望。另一方面，在EBV+ GC病例中，相关基因扩增的JAK2、PD-L1和PD-L2表达增加，提示JAK2抑制剂、PD-L1/L2和/或PD-1拮抗剂以及PI3K抑制剂对该亚组GCs[6]的治疗有希望。利用EBV感染的JRST和其他GC细胞系，分析EBV感染对这些分子改变的影响也很有前景。

的利益冲突

两位作者宣称没有相互竞争的利益。