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摘要

足月时出现肝钙化灶，膀胱出口阻塞48-72小时后出现急性肾小管坏死，提示模型存在显著应激。我们试图定义模型中每个步骤对这些发现的贡献。21只母羊，27只妊娠期为60天的羊羔，采用氧化亚氮、氧气和异氟烷麻醉，分为3组:A组仅麻醉60分钟，B组通过左侧切口子宫暴露30分钟，c组通过左侧切口子宫暴露30分钟，c组通过左侧切口子宫暴露30分钟。子宫暴露，每只胎羊剖宫产12分钟(C组)，48-72小时后分娩，比较心脏、肠道、肝脏和肾脏的组织学变化。A组11只，B组10只，c组6只，仅使用戊巴比妥安乐死的羔羊出现中央肝坏死。A组1只羔羊肾脏有组织学改变(近端小管空泡变性)，B组无组织学改变，c组除1只羔羊外其余均有组织学改变(近端小管空泡变性)。这可能表明显著的肾应激，可能表明潜在的长期肾损害。

关键字

胎儿手术、麻醉、手术压力

介绍

在过去的15年中，我们开发并完善了一系列模型，探索羊胎儿的肾脏和膀胱发育[1-15].在一些足月分娩的羔羊中，肝脏中央部分有小的钙化灶，表明在妊娠早期发生了中央肝坏死。在膀胱出口梗阻后的最初几天内处死的羔羊中，有迹象表明发生了急性肾小管坏死（ATN）经常见到的人[6]。我们决定测试手术的每一步，除了实际造成梗阻外，以确定麻醉剂和羔羊暴露可能产生的影响（如果有的话）。目前没有关于胎儿麻醉如何影响胎儿器官发育的报告。我们假设这些研究可能会对麻醉可能对接受开放式胎儿手术的人类胎儿产生影响。

材料和方法

　 After approval was obtained from the Animal Ethics Committee of Wellington School of Medicine and Health Sciences, University of Otago, Wellington Animal Ethics Committee (Wellington, New Zealand, approval number 2-11) twenty-one timed gestation ewes (60-day’s gestation) were transported from the farm 24 to 48 hours before the operation. They were examined by ultrasound to confirm the pregnancy and avoid unnecessary operations. The ewes were initially induced using intravenous thiopentone (20 mg/kg). They were then intubated and anesthesia was maintained on spontaneous respiration with a 50% nitrous oxide and 50% oxygen mixture, and 1% Isoflourane. Isoflourane was maintained at 1-2% with the level adjusted as required to provide a safe, effective anesthetic. The current approach is a modification of our original approach to the pregnant ovine uterus. The modifications include induction using intravenous (IV) Thiopentone, rather than Halothane inhalation, and routine monitoring of maternal heart rate and oxygen saturation. Blood pressure is not routinely monitored. The use of bupivacaine injected into the subcutaneous tissue and directly around the exposed segmental nerves during the incision removes the need for post-operative analgesia.

根据管理情况将母羊分为3组。A组仅麻醉60分钟。在这组母羊被放置在他们的右侧，因为需要左侧切口。B组采用左侧切口显露子宫，保持显露30分钟。C组采用左侧切口显露子宫。然后通过子宫横切术打开子宫，将每只胎儿羊的后躯暴露12分钟，抓住它们的腿。这些时间是基于我们在1999-2013年之前的200项胎儿研究中创建各种阻塞性尿路病模型所花费的时间[1-15]。产生梗阻性尿路病变的平均时间大约是60分钟。在这些手术中，子宫暴露时间平均为30分钟，每次胎儿手术都需要打开子宫，保持胎儿尾端暴露时间平均为12分钟;一般来说，男性胎儿的这段时间较短，而女性胎儿的这段时间略长。 Because the lambs in Groups A & B were not exposed at all, we decided not to attempt to monitor any of the lambs. Actual monitoring of the lambs would have been technically difficult, given their small size (Table 1) and the fact that only the caudal end of the lambs in Group C were exposed.

表1。比较各组体重、冠-臀长。

		A组(n = 11)		B组(n = 10)		C组(n = 6)
体重（克）		71.1±13.5 *		79.8 ± 12.2*		81.7 ± 10.2*
Crown-to-rump长度(厘米)		13.4±1.0 *		13.9±0.9 *		14.0±0.6 *

各组间差异无统计学意义。

* p > 0.05

手术结束后，C组胎儿返回子宫，用3-0 Vicryl®(Covidien Japan INC) 2层封闭子宫。在B组和C组中，用单丝可吸收缝合线封闭母羊的腹部(Covidien Japan INC)。所有切口均采用无菌手术技术封闭。

在第一次手术后48至72小时，胎儿在全身麻醉下使用前一切口剖腹产分娩。选择这些时间是为了能够识别任何ATN或中央肝坏死，因为在足月没有任何影响的迹象(除了偶尔的肝钙化病灶)。在一些羊羔中，胎儿被安乐死，使用注射戊巴比妥在脐带。最后10只母羊的羊羔被改为放血献祭，在麻醉母羊的同时剪断脐带，原因如下所述。测量每只羔羊的冠-臀长和体重。所有的器官在出生后立即被摘除，并置于福尔马林中。比较心脏、肠道、肝脏和肾脏的组织学变化。

肾脏采用苏木精-伊红（HE）、马森三色（Masson）染色和CD10免疫组织化学染色，心脏采用Masson染色，肝脏和肠道采用HE染色切片检查。

结果

我们在27个妊娠60天的胎儿中创建了分级外科应激模型。所有的动物都在第一次手术中存活了下来。因为有些母羊是双胞胎，所以A组有11个胎儿，B组有10个，c组有6个。在最初的程序中，只有1个被认可。将该羔羊进行暴露(C组)。第2只羔羊在祭祀时被发现，纳入b组。各组模型的冠-臀长、体重如表1所示。

在脐带注射戊巴比妥的羔羊中，我们注意到肝脏中心区域的变化(图1a)，在这些羔羊的尸检过程中似乎有进展。因为我们担心这种中央肝坏死可能是戊巴比妥的直接影响，我们决定完成这项研究，以放血的方式牺牲羔羊。这些羔羊中没有出现中央肝坏死。在组织学检查中，肝脏中央部分显示广泛坏死(b)。这在放血法宰杀的羔羊肝脏中未发现。

图1a。戊巴比妥牺牲60天胎儿肝脏的肉眼观察。肝的中心部分和其余部分之间的颜色变化是用箭头画出来的。

b。中央肝坏死用箭头标出。

使用未配对学生t检验，三组之间的冠-臀长或体重没有统计学差异。各组肠道无明显组织学改变。在心脏中，心内膜出现了缺血性变化(图2)，但这些变化仅在戊巴比妥牺牲的羔羊中可见。

图2。这是心脏的左心室。心内膜和下壁心肌缺失。因为这些特征仅在使用戊巴比妥安乐死的羔羊身上出现，因此被认为是对非常不成熟的组织的直接毒性作用

在肾脏中，我们发现近端小管出现空泡变性(图3)。a组中只有1只羔羊出现这种变化。B组中所有羔羊组织学正常。C组所有羔羊均有一定程度的空泡变性。

图3。近端小管（HE）S3中典型的空泡变性（透明细胞质）

近端小管3[16]节段可见近端小管上皮空泡状变性(图4)。然而，在更严重的病例中，近端曲小管也累及。根据HE评分将空泡化程度分为三组。当评分为0时，未见液泡变化(图5a)。当评分为1时，可见节段3的变化(图5b)，当评分为2时，变化延伸至近曲近端小管(图5c)。

图4。小管包括近曲小管(PCT)，由S1、S2、S3节段组成，也称为近曲直小管(PST)、Henle袢、髓质升肢(MTAL)、皮质升肢(CAL)和远曲小管(DCT)。(来自Fujiwara et al[18]。

图5。近小管上皮空泡变性评分。(a)未见空泡变性，评分0分。(b)仅近端小管S3可见空泡变性，评分1。(c)近曲小管及S3(评分2)可见空泡变性。

评分系统(表2),A组只有一个案例1分和所有其他的羊羔在这组得分为0,所有的羔羊一样在b组相比之下,3的羔羊在C组1和其他3分2分。与评分为0分的正常羔羊肾脏相比，评分为2分的近端小管空泡变性羔羊肾脏近端小管扩张。CD10免疫染色显示，评分为0和评分为2的羔羊近端小管管腔内壁细胞的染色程度有显著差异(图6a, b)。

图6。CD10免疫染色，特异性染色近端小管。与评分为0 (a)的正常羔羊肾脏相比，评分为2 (b)的近端小管液泡变性羔羊肾脏近端小管扩张。

表2。各组近端小管空泡变性评分。

		A组(n = 11)	B组(n = 10)		C组(n = 6)
	得分0	10	10		0
	得分1	1	0		3.
	得分2	0	0		3.

讨论

人类胎儿手术的起源可追溯到20世纪60年代，当时几个不同的群体进行开放式胎儿手术，为继发于Rh不相容性的红细胞增多症胎儿进行交换输血[17]。这些技术被Liley首创的经皮腹腔内输注所取代[18]20世纪80年代，随着超声技术的发展，人们对开放式胎儿手术的兴趣重新兴起[19,20]，并且在动物模型中定义了几种可能致命的可矫正病变的发育病理生理学[21-24]。在随后的30年中，这项基础和临床研究的投资使越来越多的胎儿患者受益，并刺激了对胎儿正常和异常发育的持续研究。据报道，产前诊断为梗阻性泌尿疾病的临床结果，但长期结果不如预期的好en预期[25-28]。梗阻性尿路疾病的胎儿治疗现在包括开放式胎儿手术、经皮V-A分流术和胎儿镜检查程序，仅对精心挑选的患者进行[28-30]。

2021年版权燕麦。所有权利reserv

在过去的15年里，我们一直在评估胎儿干预治疗严重下尿路梗阻(LUTO)，并在胎羊模型中探索肾脏和膀胱发育[1-15]，因为LUTO与高围产期死亡率和出生后肾损害相关。我们以前的研究表明，在完全梗阻的情况下，肾源性区[5]的壶腹扩张非常早。这种扩张扭曲壶腹，抑制壶腹的正常分裂，有效地防止肾发生。如果梗阻没有解除，就不会形成进一步的肾单位。在这些尿路梗阻对肾小球形成的早期影响的研究中，我们发现，在造成尿路梗阻后48小时内，肾脏表现出广泛的急性小管坏死(ATN)。我们最初的观点是这些变化是手术时低血流量造成梗阻[5]的结果。然而，目前尚不清楚的是，这些变化是由创建模型所需的麻醉和手术暴露引起的。这项研究就是为了解决这个问题而设计的。

人ATN肾活检的典型特征是空泡化;近端小管细胞刷状边缘缺失;管状细胞脱落进入管腔，导致铸型阻塞。间质水肿伴轻度至中度白细胞浸润可产生宽间距小管。尽管有“急性肾小管坏死”一词，坦白地说，坏死细胞并不常见，尽管有明显的功能损害[31]，但通常只有有限的组织学证据表明损伤。

在我们的模型中，组织学改变位于所谓的第3节段[16]区，这是肾内外周血流最敏感的区域。一般认为肾缺血的改变首先见于近端小管。在我们之前的阻塞性泌尿系统疾病模型中，扩张首先发生在近端小管而不是远端小管[5]。从这些结果来看，近端小管对缺血非常敏感，而且对梗阻后腔内压力增加也非常敏感。本研究旨在探讨单纯麻醉、子宫暴露和胎儿暴露对肾脏缺血性损伤的作用。麻醉单组(A组)1只，子宫暴露组(B组)1只，均无空泡化。C组手术时未检测到1个子宫角内有2个胎儿，仅1只胎羊暴露12分钟。这只羔羊得了1分。这些变化均见于位于肾皮质和髓质之间的第3节。另一个留在暴露子宫的胎儿属于B组，没有空泡化，我们给这只羔羊的肾脏评分为0。 We felt that it was reasonable to include this lamb in Group B as it had been exposed to exactly the same insult as the rest of the lambs in that Group. These results, we submit, strongly suggest that the histological change of vacuolation is the result of some degree of ischemia. Interestingly, sloughing of tubular cells into the tubular lumen was seen in most of the lambs in this study, which is a feature commonly seen in ATN. These changes were not located in segment 3, but were seen in the distal tubules and collecting ducts. This may imply that the fetal kidney is exquisitely sensitive to minimal hypoxia at this stage of gestation. However, ATN is completely reversible, and it is possible that even repeated insults of this nature may not be detectable at term. ATN might be more sensitive than vacuolation but this study clearly demonstrated a significant difference in the three groups using vacuolation as a marker of a more severe insult.

CD10免疫染色显示，评分为0和评分为2的羔羊近端小管管腔内的细胞染色程度有显著差异。这可能反映了近端小管细胞刷状边界的缺失，这可能是最近近端小管损伤的一个更敏感的指标。为了证实这一点，需要进行电子显微镜研究，而这些研究尚未完成。这三组患者的组织学变化存在明显差异，但需要更多的研究来阐明这些变化的机制以及手术过程中的每一步对其发展的贡献。

我们假设胎儿肾对缺血变化非常敏感，肾空泡化将被认为是肾缺血的可靠指标。这项研究表明，在胎儿早期，即使是相对轻微的压力也会导致发育中的器官发生缺血性变化，但肾脏似乎是对这种损害最敏感的器官。一些缺血性变化在短期应激后是可逆的，但长期缺血或胎儿应激可能导致永久性损伤。这表明，长期随访肾功能对出生时有明显肾道异常的长期幸存者很重要，可能所有胎儿都在妊娠早期受到母体全麻的影响。

现在大多数胎儿干预都是在镇静状态下使用胎儿镜检查，而不是在全身麻醉下进行开放性胎儿手术。然而，开放式胎儿手术仍然是胎儿修复脊髓脊膜膨出[32,33]和偶尔切除先天性肺畸形[34]或骶尾部畸胎瘤[35]的最常见方法。希望本研究中报告的胎儿受辱程度的逐渐增加将提供一些科学依据，以说明在接受开放式胎儿手术的患者中麻醉剂对胎儿的风险。

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