加州大学洛杉矶分校大卫格芬医学院神经科学和人类行为Semel研究所。智力与发育障碍研究中心，神经科学研究大楼，查尔斯E.杨南路635号，加利福尼亚州洛杉矶90095-7332
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DOI: 10.15761 / IMM.1000228。
我们之前发现，TSC1(转铁蛋白和IGF-1的组合)是髓磷脂缺乏的大鼠和脱髓鞘的成年小鼠中髓磷脂发生的一个强有力的诱导因子。最近，我们在早产儿小鼠模型中证明了单剂量TSC1可以再生少突胶质细胞祖细胞和髓磷脂。在这里，我们使用谷氨酸兴奋毒性(GME)导致围产期白质损伤的相同小鼠模型，测试了内源性巢蛋白表达神经祖细胞再生改善早产结局的假设。n -甲基- d -天冬氨酸(NMDA)、生理盐水、NMDA+TSC1或NMDA+TSC1后3 d立体定向注入P4小鼠幼鼠胼胝体。荧光分析显示，NMDA+TSC1注射组巢蛋白表达细胞强烈富集，其中许多细胞通过增殖产生。此外，当TSC1在原发性损伤3天后被注射时，它仍然能够减少心室增大并广泛拯救巢蛋白表达的祖细胞。注射后35天，MNDA+TSC1组共表达增殖标记Ki67、CNPase和微弱巢蛋白标记的细胞更为丰富。体视学分析显示，心室下区巢蛋白表达细胞的数量与心室容积呈负相关。兴奋毒性后延迟给药TSC1可减少心室肿大，但不如同时注射NMDA和TSC1时减少的多。因此，越早给药TSC1，越多的组织被挽救，如心室肿大减小所示。 Astrocytes responded to GME by upregulating the expression of estrogen receptor and this expression was attenuated in the presence of TSC1 suggesting a decreased inflammation and a lesser need for estrogen-mediated central nervous system (CNS) neuroprotection.
兴奋毒性，少突胶质细胞，PVL，髓鞘化，转铁蛋白/IGF-1
围产期脑损伤是终身神经功能障碍的常见原因。围产期脑损伤的病因复杂、多因素，缺氧缺血、炎症和兴奋性毒性都是围产期脑损伤的关键因素。新生儿护理显著提高了早产后的生存率，但仍存在与早产相关的严重神经疾病。在美国，大约50万或约12.5%的新生儿是早产儿。大约5-10%的出生<32周胎龄体重<1500克或以下的婴儿(极低出生体重，VLBW)表现出主要的运动缺陷，多达60%的婴儿有神经认知缺陷和/或行为和智力终身残疾[2-3]。在超过50%的超低体重婴儿中观察到的一种独特的损伤模式是脑室周围白质软化(PVL)，表现为弥漫性脑白质损伤，伴有预髓鞘化少突胶质细胞(OL)损伤。白质损伤与神经元和轴突异常相关，被称为早产儿脑病[4]。诊断PVL非常重要，因为存活下来的早产儿中有很大一部分会发展为脑瘫(CP)、智力障碍和/或视觉障碍。
无论脑室周围白质损伤是由于早产、围产期母亲感染或炎症引起的，由此产生的早期损伤都会破坏正常的大脑发育，改变其成熟状态，导致发育和行为缺陷，目前尚无治愈方法。
真核细胞有复杂的生存机制。其中包括热休克蛋白或应激蛋白(HSPs)。这些蛋白质不仅由热诱导，还由包括炎症细胞因子和介质在内的各种其他生理应激源诱导[5-6]。高敏感蛋白存在于细胞质、线粒体、过氧化物酶体和内质网中，它们确保了适当的蛋白质折叠。应激蛋白作为细胞已经或正在处于应激状态的指示物，奠定了发育和/或的发病机制退行性疾病和紊乱中枢神经系统。应激蛋白是根据分子量进行分类的，主要有5类高敏感蛋白(100,90,70,60)和分子量在12 - 43KDa之间的小高敏感蛋白，包括α-结晶蛋白和高敏感蛋白-32蛋白家族。HSP-32首次在接触重金属的细胞中被观察到，其特征为微粒体酶血氧合酶-1 (HO-1)[7-10]。这种血氧同工酶也可由活性氧代谢物(ROM)诱导[6-10]。HSP-32在正常大脑[11]中表达较低。缺血损伤或热休克后，神经元和神经胶质细胞中该蛋白水平升高[11,12]。OL的HSP-32[13]基础表达较低，在氧化应激和严重低温时[14]上调，但热休克时[15]不上调。
雌激素在男性和女性生殖组织以及非生殖系统(包括心血管、骨骼和中枢神经系统(CNS)[16])的发育、维持和生理中起着关键作用。雌激素通过与雌激素受体α (ERα)和ERβ(类固醇受体核受体超级家族的成员)结合来调节其作用。ERs与配体二聚体结合，进一步与调节基因转录的DNA序列相互作用[17,18]。最近，新的证据表明雌激素的快速非基因组作用似乎是通过核外ERα和/或ERβ介导的[19-22]。中枢神经系统是雌激素活动的主要靶点[23,24]，但雌激素调节中枢神经系统作用的机制尚不清楚。(25 - 28)．研究表明，跨物种的ERs基因[29]、小鼠[30]和人类的表达模式存在显著差异[31,32]，因此，数据不能从一个物种推断到另一个物种。雌激素的神经保护作用也在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和其他动物模型中被证明。这些作用是通过星形胶质细胞[33]中的雌激素受体a (ERa)介导的。这些作者通过条件删除受体表明，通过ERa的信号传递对雌激素在EAE中的有益作用是必不可少的。
到目前为止，PVL还没有治愈的治疗方法。然而，啮齿动物研究表明谷氨酸受体是潜在的治疗靶点[34]。特别是，通过过度激活离子化谷氨酸受体(包括α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸谷氨酸受体(AMPARs)， n -甲基- d -天冬氨酸受体(NMDARs)和海因酸受体[35]引起的兴奋毒性。报告的机制导致病理生理学打开了新的干预的大门。我们先前发现，TSC1(转铁蛋白和IGF1的组合)是髓磷脂缺乏的大鼠[36]和脱髓鞘的成年小鼠中髓磷脂发生的一个强有力的诱导因子，在这些小鼠中，用TSC1进行单一治疗就足以逆转后肢瘫痪[37]。最近，我们发现了TSC1对OL祖细胞的再生和伴随的白质损失减少[38]的影响。本研究仅针对早产的一个组成部分，即NMDAR诱导的兴奋性毒性，我们检测了TSC1对巢蛋白表达祖细胞的神经保护作用。我们使用HSP-32作为应激标记，并结合雌激素受体和细胞特异性标记的表达模式来了解表达巢蛋白的祖细胞和星形胶质细胞如何对这种侮辱做出反应。
它是围产期大脑缺氧缺血的主要靶点。WMI是功能和认知障碍的主要原因，在早产儿中检测到的比例很高。受伤的未成熟大脑表现出广泛的病变称为心室周围白质软化(PVL)。在早产儿中，PVL是缺氧缺血后最常见的脑损伤类型，导致脑瘫、认知障碍和终身残疾。不仅少突胶质细胞(OL)祖细胞是这种类型的侮辱的主要目标。在这里，我们证明巢蛋白表达的神经干细胞可能是新的OLs的来源，也会在早产儿中受到影响。我们还表明，心室增大在一次治疗中使用TSC1显著减轻。这种再生既通过损伤时已有的OL祖细胞和巢蛋白表达细胞的神经保护发生，也通过巢蛋白表达细胞的增殖和迁移发生。这项工作与我们之前关于TSC1对髓鞘形成[38]影响的报告一起，似乎是第一个通过巢蛋白表达细胞解决白质修复的方法，使用大脑中存在的两种自然分子，它们的化学计量学似乎对出生后大脑发育至关重要。
netin - gfp小鼠在加州大学洛杉矶分校(UCLA)在一个受限的、温度控制的、12小时:12小时光:暗循环下饲养，并可获得食物和水随意．使用出生后第4天(P4)的巢蛋白- gfp小鼠幼鼠。每个实验包括3个时间点和5个条件:未治疗小鼠，盐水，NMDA, NMDA+TSC1同时注射(N+TSC1sim)和NMDA+TSC1延迟注射3d (N+TSC1 3d)。脑内立体定向骨髓内注射，收集和切片组织以表征细胞表型，如[36]所述。通过HSP-32的表达监测细胞应激的评估。每个实验我们用6只老鼠。我们进行了三个独立的实验来评估NMDA单独或与TSC1一起对内源性OLPS存活、增殖和成熟的影响。根据前面描述的方法进行脑实质内注射[36-38]。
简单地说，netin - gfp P4幼犬注射如下。使用了眼科显微外科仪器和带有可调节适配器的立体定向装置，以适应小(新生儿)动物。动物被氟烷麻醉，并放置在立体定向框架上，用汉密尔顿注射器在细胞实质内给药。注射坐标为横向(右)1.2 mm，尾部至Bregma 0.7 mm。针插入胼胝体2.5 mm处。对照组由表达巢蛋白的小鼠组成，它们接受生理盐水注射，使用相同的方法。我们进行了单侧移植。注射因子的总体积为1.5 ml。
我们采用P4巢蛋白- gfp小鼠幼鼠围生期脑损伤模型，通过注射NMDA致围生期脑损伤。对P4小鼠进行NMDA立体定向注射，如给药因子所述(见下文)。
在生理盐水中制备原液:TSC-1也在生理盐水中制备，最终浓度为100ng IGF1和15µg载脂蛋白转铁蛋白(Tf不含铁)在2µl生理盐水中。
实验采用P4幼鼠。每个实验包括五个条件:未治疗小鼠，生理盐水，NMDA, NMDA+TSC-1同时注射(N+TSC-1 0d)和NMDA+ TS1延迟注射(N+TSC-1 3d)。N = 4 ~ 6只小鼠。netin - gfp转基因小鼠被安置在加州大学洛杉矶分校的一个受限通道、温度控制的圈养室内，循环12小时:12小时，食物和水自由分配。按照[36]的描述进行立体定向的脑实质内注射。将治疗药物送入胼胝体(CC)。针尖在注射前用木炭标记，以确定注射部位。按照[36]所述进行大脑收集和切片以表征细胞表型。动物在治疗后至少被保留两个月，每周进行3次行为评估。用HSP-90监测细胞应激的评估。 Acute experiments were performed with 350 microns brain slices.
按照前面描述的[36]进行大脑收集和切片以表征细胞表型。结合OLs的细胞和分期特异性标记物，确定治疗的有效性。
冷冻切片在免疫细胞化学前用PBS冲洗三次。一抗包括抗ki67 IgG抗体(Vector VP-K451);抗cnpase单克隆抗体(Chemicon MAB32R);Melita Shacner抗硫化物的O4单克隆抗体上清(Pfeiffer实验室的礼物);抗hsp -32单克隆IgG抗体(Stress Gene OSA-110)和抗caspase-9抗体(Novus bio, NB100-56118);抗雌激素α受体抗体(ERα抗体- C-311: sc-787 Santa Cruz, Biotechnologies)。以正常小鼠IgG、IgM抗体和正常兔抗体作为对照血清。按照先前描述的方法进行免疫荧光处理[36-38]。简单地说，大脑部分用PBS冲洗。样品在1% BSA (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)、0.3% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)和10%正常山羊或驴血清PBS中阻塞1小时。 Primary antibodies were diluted in carrier solution (1% BSA and 0.3% Triton X-100 in PBS) and incubated overnight at 4°C. After washing with PBS, cells were incubated with the appropriate secondary antibodies (1:200; Jackson Immuno-Research), for 1 h at room temperature washed with TBS and mounted onto slides with Vinol prepared in our laboratories). Samples were imaged using the LSM 510 META confocal microscope (Zeiss) and analyzed with the Axiovision software (Zeiss).
我们使用了Axio-Imager M2(蔡司)显微镜。使用光学分分器法(stereo -调查员，Micro-bright-field, mbf)对小鼠巢蛋白表达细胞进行定量。选择两个感兴趣的区域，SVZ和CC。整个心室次区(第三心室)和胼胝体分别用63X油浸物镜检查。每个地区随机抽取51个田地。使用蔡司公司的光学分析器系统随机模式和电动阶段在每个区域的已知部分直接计数细胞。当细胞核清晰可见并在计数框内时，计数细胞。每框面积为352 ~ 384 μ m2．只计算GFP细胞。
用卡瓦列里探头从微亮场(mbf)测量同侧脑室的面积，每个切片测量n15 ~ 22个电场。
冠状脑组织切片(300 μ m)用于TSC1的急性治疗。切片后置于30mm的培养皿中，使用488激光束用LSM 510共聚焦显微镜观察。每2.5分钟采集一次图像。
定量数据用均值±SE表示。采用单因素方差分析(ANOVA One-Way Variance Analysis)和事后Tukey HSD多重比较检验(post - hoc Tukey HSD multiple Comparison test)评估多组间平均值的比较，其中不同处理获得的数据与各自的生理盐水对照或同一年龄组内未处理的样本进行比较。P<0.05为显著性。不同颜色的星号表示对应的组，并表示相对于同一组内对照的显著性。行为研究数据采用方差分析和Kruskall Wallis多重比较检验进行评价。
NMDA的兴奋毒性效应在注射24小时后已经可见，相对于注射盐水或NMDA+TSC1的小鼠大脑，心室已经增大(图1B)。盐水注射无不良反应，心室大小正常。表达巢蛋白- gfp的祖细胞分布在心室周围和室下区(SVZ)。巢蛋白阳性细胞似乎从室下区(SVZ)迁移到脑实质(图1A)。相比之下，接受NMDA注射的大脑，除了心室增大外，获得了海绵状结构，巢蛋白表达细胞基本上从心室壁、SVZ和周围薄壁上消失(图1B)。当NMDA与TSC1共注射时，脑外观更健康，脑室略增大。然而，巢蛋白表达细胞在心室壁和SVZ中大量存在。这些细胞似乎以类似于注射生理盐水的大脑的方式迁移到薄壁组织中(图1C)。对同样的大脑部分进行免疫标记，检测应激蛋白HSP-32;注射盐水的小鼠没有表现出任何HSP-32，注射NMDA的小鼠也没有。 In contrast, the NMDA+TSC1 treatment elicited a robust expression and migration of nestin positive cells and HSP-32 expression in some nestin positive cells; many of them located at the level of the ventricular wall and in the SVZ as well as in a few migrating cells in the SVZ. Nonetheless, most nestin positive cells did not express HSP-32 in spite of their location. Some nestin negative/ HSP-32 positive cells were also found mostly in the parenchyma adjacent to the SVZ. In NMDA+TSC1 injected animals the ventricular wall and SVZ were intact and populated by nestin-expressing cells. They were bipolar cells migrating perpendicularly to the ventricular wall into the brain parenchyma. We also found nestin negative cells that were HSP-32 positive after injection (Figure 1C & D). Some of these cells appeared to migrate on nestin labeled radial glia-like cell fibers as shown (Figure 1D and D1 open arrow). By 7 days after injection no HSP-32 expression was found. HSP-32 was expressed by few of the cells within the clusters (data not shown). These cysts of progenitors were seen in the parenchyma or adjacent to the ventricle and were not present at later time points.
图1所示。巢蛋白- gfp小鼠的低倍率矢状面(A-C/ 24小时PI)和冠状面(D,D1, D2 24小时PI)脑组织切片。A) 6日龄未处理的动物。第三脑室壁和室下区(SVZ)显示迁移的巢蛋白表达细胞(箭头)和HSP-32的缺失。B) P5时用NMDA处理，P6时分析的动物大脑显示由nestin阳性和HSP-32阴性细胞组成的大囊肿。此外，第三脑室壁(箭头)和SVZ似乎已失去巢蛋白表达。C) P5时用NMDA+TSC1处理，P6时分析的动物大脑显示完整的心室壁(箭头)，所有区域的SVZ均较厚。与未处理的动物相比，更多的巢蛋白阳性细胞似乎向薄壁组织迁移，并有少量共表达HSP-32(箭头)。3 .答案D理查德·道金斯老鼠大脑的脑室。E)另一只动物在注射NMDA 24小时后的视图，心室壁被去除巢蛋白阳性细胞(箭头)。巢蛋白表达细胞聚集在心室附近(箭头所示)。周围仅可见到单个分散的巢蛋白表达细胞。F)在脑实质中，由共同表达巢蛋白和热休克蛋白-32的细胞形成了一个囊肿，呈现橙色。薄壁组织中有表达巢蛋白的细胞，这些细胞与囊肿呈同心圆排列。这些聚集的细胞可能会随着时间的推移而消失。G) NMDA+TSC1治疗小鼠的冠状面，可见大量“放射状胶质样”巢蛋白阳性细胞，长突起垂直于脑室壁(实箭头)，巢蛋白阴性/HSP-32阳性细胞似乎沿着这些纤维迁移(打开的箭头，(g1插入)。G2)。同一脑室低倍镜显示大量巢蛋白表达。 G3) Diagramatic representation of a coronal view of the mouse brain showing the lateral ventricle (Figure 1E).
第三脑室的大小在不同的治疗中受到不同的影响。图2显示了从6日龄小鼠(未治疗小鼠)或单独NMDA或NMDA+TSC1注射小鼠的大脑中获得的全心室的对比图像。对比图复合显示，早在单独注射NMDA 24小时后，单独注射NMDA的小鼠心室明显增大，而在TSC1存在的情况下注射NMDA时，心室增大减小。这个时间点的其他差异还包括，NMDA单独注射或与TSC1联合注射小鼠的巢蛋白表达细胞的分布，在注射NMDA的小鼠心室外部分没有巢蛋白+细胞，而使用TSC1的小鼠心室周围出现巢蛋白+细胞，它们向SVZ和实质的迁移似乎没有受到NMDA的干扰。许多巢蛋白表达细胞从心室壁出现并延伸到SVZ，显示ki67，这是增殖的标志;这在低倍率图像的插入中更加明显。周围薄壁上亦可见巢蛋白阴性Ki67阳性细胞。干预35天后，单独接受NMDA的小鼠与接受NMDA+TSC1的小鼠的大脑大小基本相同(图2)。
图2。处理24小时后巢蛋白- gfp转基因小鼠矢状面旁的低倍率视图。切片进行ki67和CNPase免疫标记。A)未治疗的6日龄动物或D)未治疗的35日龄小鼠。B)注射NMDA 24小时后，注射了NMDA的小鼠的心室与未接受NMDA+TSC1组合的小鼠相比已经明显增大。脑室壁及室下区可见nestin+、Ki67+和CNP+细胞。在许多情况下，nestin与Ki67(黄色细胞)共表达，表明它们起源于Ki67通过细胞增殖(插入)。D)未接受治疗的39日龄小鼠心室内部部分只有少量巢蛋白+细胞沿心室壁分散，SVZ细胞已从该区域迁移。心室外壁仍厚，但SVZ外几乎未见巢蛋白阳性细胞。E)此时注射NMDA的小鼠心室非常大，心室壁内部只有很少的巢蛋白阳性微弱标记细胞。在该区域几乎没有细胞表达Ki67和CNPase。F) NMDA+TSC1组小鼠的心室比没有TSC1组小鼠的心室小得多。心室外侧仍可见巢状细胞+，部分细胞从SVZ迁移至薄壁组织。许多这样的细胞(共表达Ki 67(插入)。此时在心室附近没有单独表达ki67的细胞，这表明它们可能已经迁移了。
利用体视学，我们接下来检查了GFP-nestin转基因小鼠的冠状旁切片，以测量心室大小，这些小鼠分别为未治疗或单独注射NMDA、NMDA +TSC1同时注射N+TSC1 sim或NMDA后延迟(3天)注射TSC1 (N+TSC1-3d)。冰冻切片(28 μm)被切割、清洗并安装在配有Stereo explorer软件(MBF)的AxioVision显微镜(蔡司)下进行检查。使用卡瓦列里探针(MB场)获得心室面积(图3)。每个时间点，每只小鼠的六个相邻冠状面切片的值从三个独立的实验中获得。这六个部分的平均值被认为是每只老鼠的值，每一个处理的各自的实验。在脑室内注射7天后，单独使用NMDA治疗的动物显示出更大的同侧心室。当同时注射TSC1 (N + TSC1sim) NMDA时，我们观察到脑室面积显著减少约50%(图3)。我们还研究了在细胞死亡后注射TSC1是否会增加神经保护作用，以及在损伤后数小时内会发生的活性炎症事件。我们观察到，脑室的面积缩小更多(低于50%的NMDA治疗小鼠)，但这种差异在统计学上不显著(图3)。
图3。同侧脑室的增大在不同治疗方法中有差异。利用体视学，我们接下来测量了3理查德·道金斯心室从中线开始。这种形态分析与上述测量的不同之处在于，这里只测量了脑室的同侧部分，并在给定的时间点在不同的治疗方法中进行了比较，而不是比较注射半球的侧脑室与未注射的(对侧)侧脑室在同一大脑部分的面积:单独NMDA(粉红色条);同时注射NMDA+TSC1(紫色条)和NMDA后延迟治疗TSC1(绿松石条)。单独注射NMDA的小鼠第三心室随着时间的推移出现明显的组织损失。同时注射NMDA + TSC1 35天后，第三脑室明显增大，但比未注射的小鼠大约8倍。接受延迟注射的小鼠的心室大小也比单独注射NMDA的小鼠小50%左右。PI-1组治疗间差异有统计学意义。在PI-35组中，同时给予TSC1的小鼠与在NMDA后3天给予TSC1的小鼠之间差异不显著，提示在NMDA后3天再给予TSC1的小鼠脑组织兴奋毒性可得到缓解;而单独NMDA细胞数量显著。数值表示为平均值±SEM; *p<0.05,‡P <0.01与对照组比较。
接下来，我们使用光学分分器探针(mbf)比较了不同处理SVZ和胼胝体(CC)中巢蛋白表达细胞的数量。与注射生理盐水的小鼠相比，注射NMDA后巢蛋白- gfp祖细胞有相当大的损失(图4)。注射一天后，巢蛋白阳性细胞的总数减少了66%，比注射生理盐水的小鼠小，绝大多数表达巢蛋白的细胞似乎保留了，反映了16%的损失。在盐水注射组中，SVZ和CC之间的细胞分布几乎相等，而在NMDA注射组中，SVZ中的细胞比CC中剩余的细胞更多，这可能是由于细胞迁移减少(图4A)。治疗35天后，同时接受NMDA + TSC1的小鼠CC中表达巢蛋白的细胞增加了39%，而TSC1治疗延迟3天的小鼠CC中表达巢蛋白的细胞减少了59%，而NMDA治疗小鼠CC中表达巢蛋白的细胞减少了45%。总的来说，这两个区域的细胞总数比同时接受NMDA + TSC1的小鼠要少。在这个时间点，对照组和NMDA + TSC1处理的小鼠在CC中显示的GFP标记细胞比在SVZ中显示的更多，这表明巢蛋白表达细胞在注射后一天及时向CC迁移。在治疗后35天，无论TSC1是否存在，接受NMDA的小鼠与对照组相比，在两个区域都显示出巢蛋白表达细胞的总数减少。有趣的是，同时或延迟接受N + TSC1的两组，此时CC中表达巢蛋白的细胞比SVZ中更多(注射35天后“35dPI”，图4B)。下一节将讨论这些发现的几个原因。
图4。第三脑室SVZ和CC中表达netin - gfp的祖细胞总数的比较。矢状面检查，使用光学分分器探针(mbf)和63X油物镜计数巢蛋白表达祖细胞。A)早在GME后1天，NMDA注射小鼠中表达巢蛋白的祖细胞总数就急剧减少，SVZ中留下的细胞比迁移到CC的细胞多。同时注射NMDA + TSC1的小鼠显示25%表达巢蛋白的细胞减少，而单独注射NMDA的小鼠几乎减少66%。在注射盐水和NMDA的小鼠之间差异显著，而在未注射盐水或未处理的对照组和N + TSC1小鼠之间差异不显著，表明SVZ和CC中表达巢蛋白的细胞数量与单独注射NMDA的小鼠相比非常接近。SVZ的意义(＊P)<0.05，对于CC (＊P)与对照组相比<0.05。B)注射后35天，无论TSC1是否存在，盐水注射小鼠的巢蛋白表达细胞数量均高于NMDA注射小鼠的巢蛋白表达细胞数量;单独使用NMDA，表达巢蛋白的细胞总数的损失从66%减少到45%。此时NMDA+TSC1同时注射，巢蛋白表达细胞总数减少39%。当TSC1在NMDA给药3天后延迟注射时，可看到更明显的降低。尽管如此，与注射NMDA的小鼠相比，更多的细胞迁移到CC。柱状表示各组的均值±SE。＊与对照组比较P<0.05。N+TSC1sim和N+TSC1给药3天后CC细胞数量差异显著(＊P<0.01)，提示注射TSC1越早，更多表达巢蛋白的细胞被保留。
为了了解在SVZ中表达巢蛋白的细胞是否被TSC1从静止状态动员到活跃的迁移状态，我们检查了ki67阳性细胞的总数，这些细胞既不是巢蛋白阳性，也不是CNPase阳性，如图5所示。只有一小部分细胞被发现是ki67，并且不被OL标记CNPase或祖标记nestin所识别。有趣的是，在这个时间点，在不同处理中，巢蛋白表达细胞的数量几乎相等，即使小鼠同时接受NMDA+TSC1，该区域也只有少数CNPase表达细胞(如图5所示)。然而，发现了更多的CNPase阳性细胞，这表明TSC1诱导OL成熟原位。接下来，为了证明巢蛋白表达细胞的增殖，我们寻找了巢蛋白- gfp +/Ki67+细胞群。Ki67(细胞增殖标志物)和巢蛋白的免疫细胞化学结果显示，部分表达巢蛋白的细胞是由细胞增殖产生的。计数表达Ki67的细胞总数。在脑实质内单独注射生理盐水或NMDA 7天后，表达巢蛋白的细胞数量非常低，而这些细胞与抗ki67共同标记。两组注射NMDA并同时或三天后用TSC1处理的细胞中，表达巢蛋白的细胞数量几乎是盐水对照组的两倍。这些结果证实了一个表达巢蛋白的祖细胞池是通过细胞增殖产生的(图5)。
图5。心室下区再生通过表达巢蛋白的祖细胞亚群的增殖以及通过直接动员沉默的巢蛋白表达细胞。注射后7天，在同侧半球第三脑室SVZ周围矢状面选取十个野。首先，只有表达巢蛋白- gfp的细胞被计数(柱的绿色部分)，这些细胞的增殖标记Ki67为阴性。数值表示为平均值±SEM;*p<0.01的处理与对照组。有趣的是，在NMDA治疗后，再注射3天延迟的TSC1, nestin阳性细胞的总数略高于NMDA治疗小鼠。将各实验条件下的巢蛋白+细胞数量与未处理小鼠的巢蛋白+细胞数量进行比较。Ki67和nestin在SVZ(条的橙色部分)的共表达也通过计数SVZ周围相同十个区域的双标记细胞来评估。对照组表达巢蛋白的细胞总数低于治疗组。大约三分之一的细胞共同表达nestin和Ki67。NMDA处理的小鼠也显示产生了新的巢蛋白表达细胞通过ki67表达评估细胞增殖。一个惊人的发现是，在同时或在NMDA给药后三天内接受NMDA +TSC1的小鼠中，形成了两倍的巢蛋白表达细胞通过细胞增殖与对照组相比。在同时注射的N+TSC1中，表达巢蛋白的细胞总数几乎翻倍，其中近50%是新的祖细胞通过细胞增殖。注射NMDA, 3 d后再进行TSC1处理，非增殖巢蛋白阳性细胞数量略多，而非增殖巢蛋白阳性细胞数量略多通过增殖达到40%左右。数值表示为平均值±SEM;*p<0.01治疗组与对照组(未治疗组)比较。
为了证实沉默的巢蛋白表达祖细胞的直接招募，我们使用7个月大的小鼠大脑检测了TSC1对成年大脑中巢蛋白表达细胞的出现和迁移的影响。切片置于带相机的倒置显微镜下进行延时实验。当开始计时并加入TSC1时，认为是时间“0”。GFP-nestin的表达从一开始就可见，并在治疗后的SVZ 1h保持不变。尽管如此，在这段时间里，我们观察到SVZ的巢蛋白阴性区域，随着时间的推移，该区域的黑暗被强烈的绿色荧光标记。而在TSC1处理后50分钟左右，另一个区域在0时刻呈强烈的绿色，逐渐变暗。有趣的是，使用TSC1的单一处理可以诱导表达巢蛋白的新生细胞的几波。可见单细胞;一些似乎从密集的SVZ迁移到邻近的薄壁组织，保持绿色至少1.45小时(115分钟，实验持续时间)。我们观察到，在时间0时SVZ比之后的时间点窄。 Twenty-four hours after treatment, the intensity and extent of GFP-nestin expression had declined but did not disappear (Figure 6).
图6。TSC1诱导侧脑室SVZ内巢蛋白表达细胞的“觉醒”。为了评估NSC的“觉醒”和迁移，我们使用7月龄巢蛋白绿色荧光蛋白(GFP)小鼠300 μ m厚度的新鲜脑切片进行区分di新生GFP-nestin表达式。使用TSC1治疗的冠状面脑切片显示侧脑室在115分钟内呈单一聚焦平面。注意在暴露于TSC1几分钟内室壁和室下区域明显增厚。我们观察了gfp巢蛋白表达细胞的动态行为。一些阴性区域(黄色矩形)在处理后1分钟开始被巢蛋白-GFP强烈标记，从11分钟开始逐渐可见(开放箭头)，并在109分钟(1h 49分钟，实箭头)继续显示100%的SVZ光。与此同时，SVZ在第0时刻表达强烈到中等绿色荧光的区域逐渐变为阴性，直到第88分钟(1h 28分钟)未检测到GFP。有趣的是，同样的区域在100分钟后开始再次亮起，并在9分钟后被强烈标记，此时侧脑室的全视图为GFP阳性。伴随这些现象的发展，单双极细胞从SVZ迁移到邻近的薄壁组织(箭头)。最初，只有几个细胞可见，但随着时间的推移，垂直于SVZ的细胞行被观察到(小箭头)。值得注意的是，加入TSC1 11分钟后，巢蛋白阴性区域变为阳性，而该区域下方则相反。17min后，同样的区域关闭，在TSC1加入组织切片后的33min再次变为绿色。 Starting at 17 min green cells appeared to have moved beyond the SVZ into the brain parenchyma. This region of the SVZ was the most active as it went gradually on (at 33 and 100 min) and off (at 17 and 73min). The complete SVZ became nestin-GFP positive at 109 min. Migrating cells had increased in number with time and of the SVZ took place during the first 33 min.
接下来，我们检测了单独或联合TSC1注射NMDA后35天心室下区(SVZ)星形胶质细胞的状态。为了识别星形胶质细胞，我们检测了GFAP的表达，使我们能够可视化它们的状态(也就是说,正常星形胶质细胞或活性星形胶质细胞)。我们还测定了雌激素r α抗体的表达。巢蛋白表达细胞在早产模型中未表达雌激素受体。在SVZ中，注射生理盐水的小鼠星形胶质细胞外观正常，仅部分血管表达雌激素- r -α(图7A ~ D)。相比之下，注射NMDA后，SVZ及邻近实质的星形胶质细胞表现出更明显的强烈表达GFAP的细胞过程。星形胶质细胞对GME的反应是上调雌激素受体-α，该受体在一些血管中也有表达(图7 E-F)。注射NMDA+TSC1后星形胶质细胞没有反应，数量减少，只有少数星形胶质细胞共表达GFAP和雌激素- r。雌激素r标签是沿着纤维扩散分布的，而不是在它们的细胞体内。雌激素- r不由巢蛋白- gfp祖细胞表达(图I-L)。NMDA+TSC1干预后星形胶质细胞仍然存在，大多数星形胶质细胞共同表达雌激素R-和GFAP(图7 J,K)。表达巢蛋白的细胞不显示ER-α。
图7。在SVZ中，雌激素- r将GME的定位从血管转移到星形胶质细胞。双免疫荧光检测雌激素受体α(雌激素- r α)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。A-D盐水处理小鼠P40时，雌激素r α只存在于血管中，而不存在于星形胶质细胞中。相比之下，NMDA受体35d PI (d = days;雌激素R与GFAP共定位主要在星形胶质细胞的细胞体中，也在血管中强烈表达。星形胶质细胞变大，呈纤维状，具有明显的强表达GFAP (E-H)的过程。有趣的是，在NMDA+TSC-1处理的小鼠(I,J,K,L)中，大多数但不是所有的星形胶质细胞仍然增大，它们的细胞体明显标记有GFAP。其他星形胶质细胞胞体和突起较小，无反应性，数量较少，只有少数星形胶质细胞共表达ER-α。标签沿纤维而不是星形胶质细胞胞体弥漫性分布。雌激素- r不通过巢蛋白- gfp前体(插入体)表达。
在胼胝体(CC)显示，在P40非治疗动物(a - d)中，ER-α主要存在于血管和少数星形胶质细胞中。在这个区域NMDA似乎影响更强的星形胶质细胞，非常活跃的图8G。这种强烈的星形胶质细胞增生伴随着ER-α的表达从血管转移到星形胶质细胞，并且这两种标记物共同定位于大多数星形胶质细胞(Fand H)。与此相反，在同时注射NMDA+TSC1的小鼠中(图8 I-L)，雌激素受体的免疫反应性显著降低，星形胶质细胞增生提示微环境正常化。
图8。胼胝体矢状面。双免疫荧光检测雌激素受体(ER-α)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。胼胝体(CC)显示，未治疗动物(a - d) ER-α主要存在于血管和少数星形胶质细胞中。相比之下，NMDA注射小鼠(E-F) ER-α与GFAP共定位主要在细胞体中，并在血管中强烈表达。星形胶质细胞反应性强，标记性强，呈纤维状。有趣的是，在NMDA+TSC-1处理的小鼠(H,I,J,K)中，星形胶质细胞似乎没有反应，它们的数量较少，细胞体较小，GFAP标记的细胞突起也较小，它们的数量较少，只有少数共同表达ERα。ERα几乎不存在于血管中，表达ERα的细胞和GFAP分布在纤维中，而不是在细胞体中。ERα不由巢蛋白- gfp前体表达。插入物显示，在与GFAP/ ERα共标记细胞相邻的巢蛋白表达细胞中，ERα标记缺失。
为了确定哪些祖细胞在兴奋毒性后更容易死亡，我们检测了表达巢蛋白或O4的细胞中caspase 9的表达。注射生理盐水的小鼠体内Caspase 9无表达。相比之下，NMDA注射液导致caspase 9的强烈表达和O4免疫反应性的消失。Caspase 9在细胞中表达，并以沿SVZ和邻近薄壁组织散布的“点状”模式表达。在一些病例中，caspase 9和巢蛋白共定位，但绝大多数表达巢蛋白的细胞caspase阴性。同时注射NMDA + TSC1的小鼠状态明显改善，O4在OL细胞体的SVZ和细胞过程中均有表达。Caspase 9表达减少，主要局限于SVZ。NMDA注射液与TSC1治疗3 d后的效果相似，O4在SVZ附近的薄壁组织中表达，caspase在SVZ的少数区域中表达，表达强度中等。同时治疗和延迟治疗之间的主要区别是OL显示O4毛状细胞过程，而接受TSC1治疗的大脑，在NMDA治疗3天后显示垂直于脑室壁的一排排表达O4的小细胞和SVZ中较薄的巢蛋白阳性细胞层。在少数细胞中，Caspase似乎与巢蛋白重叠，但与O4不重叠(图9)。
图9。在兴奋毒性期间或之后，由TSC1产生的差异神经保护作用．对照组小鼠注射生理盐水(A-D)。A). SVZ和心室壁部分区域有巢蛋白阳性细胞。B) SVZ及邻近薄壁组织中也存在O4表达细胞。C)注射生理盐水的小鼠不表达Caspase 9。D)三个标记的合并视图。单独使用NMDA (E - h)的小鼠在心室壁(E)显示出强烈的巢蛋白标记祖细胞(E) = SVZ中几乎没有，而在邻近的薄壁中有大量的单细胞。F)毛细胞过程中O4阳性细胞很少。G)这些O4阳性细胞共表达caspase 9。单细胞的突起也较少。 In addition, the full area surrounding the lateral ventricle of the injected hemisphere showed caspase intense staining as “puncta”. These puncta seemed to be predominant in comparison to the extent of O4 labeled puncta. H) Very few nestin positive cells co-expressed caspase 9. When NMDA was injected simultaneously with TSC1 (I–L), nestin-labeled cells were seen across the wall of the ventricle, SVZ and adjacent parenchyma (I). There was much more O4 expressed in small size OLPs; some could be seen as bipolar cells with long processes than in mice injected with NMDA alone. More O4 labeled puncta were observed (J). In these mice, some but not all, nestin-expressing cells co-expressed caspase 9 (L). The delayed administration of TSC1 3 days after NMDA injection resulted in a spongy-like tissue M–P). Nonetheless, both the expression of nestin (M) and O4 (N) were preserved and O4 positive cells were negative for caspase 9 (O). It also appeared as if caspase 9 was labeling cells other than nestin-expressing and O4 labeled cells, in which cases caspase 9 seemed to label flatter cells (O).
对动物进行野外行为评估。野外试验用于测量运动能力和探索驱动能力。竞技场是间接照明的，由一个28 x 28 x的盒子组成，分为4个象限。老鼠总是被人用尾巴根部抓着。小鼠被放置在开放场地的中心，并允许探索仪器5分钟。在5分钟的测试后，老鼠被放回它们的笼子里。在P4处给予NMDA的小鼠在治疗后9天开始进行开放野测试，结果显示诱发的运动过度活跃，而未治疗的小鼠和单独接受TSC1的小鼠在5分钟内访问野的次数要低得多。随着注射时间的推移，这些差异趋于消失。治疗27天后，无显著差异，如图10所示。
图10。NMDA在早期诱发多动行为。最初，未接受治疗的小鼠和9天前注射TSC1的小鼠有相似的行为，小的差异并不显著。相比之下，单独注射NMDA或注射NMDA + TSC1的动物表现为多动，与对照组(未治疗)小鼠相比差异显著。治疗27天后，所有组的行为相似，但与未治疗的小鼠相比，nmda治疗小鼠的差异显著。相比之下，TSC1组和N-TSC1组小鼠的行为基本相同，差异不再显著。
促进中枢神经系统的髓鞘形成作为一种潜在的治疗干预策略，以克服髓鞘缺乏并不是一个新的概念。1996年，Mc Morris和McKinnon[39]回顾和汇编了来自不同实验室的数据，包括他们自己的工作，其中明确了OL的发展和维护是由生长因子调节的。在这里，我们想将OL调节剂的类别从“生长因子”扩展到“生长和营养因子”，IGF-1从其中用于EAE动物模型。这些小鼠轴突周围出现了薄髓磷脂[40,41]，临床症状有所改善。关于IGF-1对OL和髓鞘/再鞘形成的影响，已有许多方面的研究。然而，治疗髓磷脂缺乏的方法仍然难以找到。在目前的论文中，我们只关注一种干预措施，即通过在兴奋性毒性后再生早产儿形成的白质，从而使早产儿受益。
在发育过程中，胚胎细胞内承诺和谱系限制的内在基因组机制受环境信号的调节。这一点在神经细胞培养和神经细胞移植的研究中变得更加明显，这些研究在评估细胞移植细胞对中枢神经系统修复的潜力方面非常有用。干细胞生物学的出现为髓鞘坏死和脱髓鞘疾病的细胞替代疗法提供了更有前途的前景。越来越多的研究涉及干细胞制备和成功生成大量可复制的OL[43,44]。基于BrdU的掺入，我们之前发现在未受影响的髓鞘缺陷大鼠突变体(md大鼠)中，TSC1[36]刺激静止的干细胞/祖细胞增殖。在本研究中，我们使用相同的动物模型，试图确定表达巢蛋白的祖细胞对NMDA注射的反应以及TSC1对表达巢蛋白的细胞群的影响。注射NMDA后，脑室壁和SVZ中表达巢蛋白的细胞全部丢失，SVZ和脑实质呈海绵状。相比之下，在TSC1存在的情况下，在心室壁和SVZ中发现巢蛋白标记的细胞。这些细胞似乎迁移到薄壁组织中，证明了l和SVZ。NMDA没有扰乱他们已知的路径和能力。 Thus, TSC1 made the environment permissive for survival of nestin-expressing cells. The stereology data showed that one day injection 66% of the nestin-expressing cell population had been lost due to excitotoxicity caused by NMDA while TSC1 seemed to protect nestin-expressing cells from NMDA when injected simultaneously, having lost only 16% of the nestin labeled cell population. At this early time point, the number of cells found at the ventricular wall together with those in the SVZ and cells found in the CC was very similar within their own group (也就是说,NMDA组)，表明一些表达巢蛋白的细胞在侮辱之前已经迁移到CC。到14天，在添加或不添加TSC1的处理中，GFP-nestin阳性细胞的总数非常相似，占未处理和注射盐水的幼崽的总数的50%。在PI第1天，使用TSC1的小鼠有更多的巢蛋白阳性细胞，但在13天后不再存在;这可能是由于其中一些细胞在迁移到CC的过程中失去了SVZ中的巢蛋白表达。这是合理的，因为我们之前在遗传性白质营养不良的大鼠模型中发现，OLPs对TSC1的反应是从祖细胞期向前移动到早成髓磷脂的OL[36]。我们从目前研究的这部分了解到，当NMDA和TSC1同时注射时，GFP群体在很大程度上得到了保护，在稍后的时间点，如治疗后35天，似乎有第二波巢蛋白阳性细胞到达CC，要么是因为它们有延迟迁移，要么是因为它们是最初表达巢蛋白的祖细胞的后代，这些祖细胞在受损伤后存活了下来。延迟注射TSC1后，巢蛋白表达细胞的数量与PI-14时相同。这可能是由于给药TSC1的延迟导致兴奋毒性损伤后巢蛋白表达细胞的延迟增殖。另外，注射TSC1可以增强已有的和新的巢蛋白阳性细胞在SVZ外的迁移。第三种可能性是，一些细胞停止表达巢蛋白，因为它们倾向于开始表达一种特定细胞类型的早期标记，最有可能是OLPs，正如我们之前所展示的[36]。
据报道，随着OLPs向更成熟的表型发展，它们对氧化应激变得更脆弱，从而导致诱导细胞死亡[45]，因此，我们下一步检查了应激蛋白HSP-32的存在，作为氧化应激的标记在整个治疗。未接受治疗的小鼠没有表达热休克蛋白-32，因为它(哟勒pondría“它们”)没有受伤。单用NMDA处理的小鼠未表现出HSP-32的表达。而在NMDA+TSC1处理的小鼠中，巢蛋白表达细胞在心室壁和SVZ中共同表达HSP-32。巢蛋白阴性/HSP-32阳性细胞常沿巢蛋白径向细胞突起迁移。HSP-32的表达表明，新形成的细胞对WMI有反应，但最有可能被HSP-32挽救。相比之下，在接受NMDA的小鼠中，神经祖细胞无法表达HSP-32，只导致大量细胞丢失，缺乏组织修复和再生。因此，表达HSP-32的细胞越多，它们的存活和整个大脑的恢复就越有希望。
基于BrdU的合并，我们之前已经证明TSC1在脑白质营养不良[36]大鼠模型中动员并触发巢蛋白表达祖细胞的增殖。最近，我们在这里使用的同一小鼠兴奋毒性模型中发现，部分CNPase阳性OL共表达Ki67，这表明TSC1通过OLPs增殖产生了一些OL。通过ki67表达量的测定，发现大量细胞增殖，且增殖细胞数量大于ki67和CNPase共表达的细胞数量。这些较高的数字出现在注射TSC1后的早期时间点，随着时间[38]的函数下降。这里使用增殖标记Ki67，我们试图确定表达巢蛋白的祖细胞是否增殖。事实上，我们发现在早期的时间点(注射后24小时)，大量表达巢蛋白的细胞被标记为抗ki67。最显著的发现是，当TSC1在NMDA注射三天后被注射时，与非TSC1注射的NMDA小鼠相比，该治疗产生了两倍多的表达nestin和Ki67的细胞，以及1.7多表达Ki67/CNPase的细胞。
的体外实验非常有用地证明，当脑组织进入与TSC1接触时，在心室/室下区(SVZ)巢蛋白- gfp的表达迅速被诱导并快速增加，即使在成年小鼠中也是如此。此外，这种效果是持续的，并引发巢蛋白阳性细胞的波动，不仅在治疗后立即出现，而且以延迟的方式出现在SVZ的不同区域。这一事实非常有希望，不仅解决围产期白质再生，而且通过自我神经祖细胞的扩大来取代神经退行性疾病中丢失的细胞，并进一步指导其表型命运。此外，这些结果表明，表达巢蛋白的祖细胞的募集涉及两个亚群，通过增殖产生的新细胞和非增殖细胞，通过表达巢蛋白响应TSC1并迁移到薄壁组织。这两个种群似乎都有助于表达cnpase的种群的再生。
已知雌激素作用主要由核雌激素受体ERα和ERβ介导，另外也有非基因组膜效应的报道。ER受体与配体结合后被激活[47,48]。这两种受体可能暂时在特定细胞中表达[49,50]，并可能协同或拮抗作用，这取决于细胞/组织。ERs的作用似乎取决于特定组织固有的转录因子的差异[51,52]，使用雌激素受体敲除(KO)小鼠的[53]显示了雌激素治疗的ERα保护作用。此外，ERα的表达在星形胶质细胞中是必要的，而不是神经元，以防止巨噬细胞和t细胞在中枢神经系统的炎症。研究还表明，ERα配体的治疗具有高度选择性在活的有机体内因此，我们想确定TSC1是否至少部分通过作用于星形胶质细胞来介导其神经保护作用。
Caspases调节细胞因子的成熟和释放。凋亡的caspases (caspases 3、6、7、8和9)通过外在或内在途径[55]执行凋亡细胞死亡。在神经系统疾病中，炎性caspase促进免疫激活，而凋亡caspase在神经元中被激活，以应对免疫分子介导的细胞毒性、生长因子信号减弱和兴奋毒性[56,57]。Caspases 3、7和9主要介导细胞凋亡，但它们也可能介导小胶质细胞对脂多糖的反应激活[58,59]。炎症反应涉及最近发现的多蛋白复合物，称为inflammasomes“[60]。炎症小体是一种细胞质的多蛋白平台，能够激活促炎半胱天冬酶和产生强烈的炎症反应[61]。炎症小体激活与感染、免疫和炎症过程的潜在机制有关[62]。在目前的研究中，caspase 9主要在表达O4的细胞中表达，即使是在NMDA和TSC1治疗后的35天，这表明在兴奋性毒性后，有一个延长的轻度炎症过程，O4 OL群体在兴奋性毒性损伤后35天仍有反应。这些结果扩展了先前报道的氧化应激易感性的发现，导致OL，特别是O4阳性细胞诱导细胞死亡[45]。
最近有报道称，成熟的IGF-1可以触发三种酶，即丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸肌醇磷脂酶C-γ (PLC-γ)，这三种酶是IGF-1主要的下游调控因子[63]。它还能减少NMDA诱导的海马神经元自噬。IGF-1对自噬的保护作用伴随着磷酸化akt (p-AKT)和磷酸化mtor (p-mTOR)的上调[63]。我们从Caspase-9免疫荧光中获得的数据显示，在O4表达细胞的细胞内、胞质结构中有广泛的斑点分布。此外，这些小点也大量分布在细胞外区域，提示其定位于髓鞘。扩张性炎症的另一个迹象是星形胶质细胞而不仅仅是血管中雌激素的表达。
NMDAR在功能和结构突触可塑性中发挥着关键作用[64]。尽管如此，尚不清楚NMDA如何影响神经胶质细胞中的这种受体。马修斯et al。报道了NMDA诱导癫痫发作[65]。然而，低剂量的NMDA可产生无临床表现的癫痫放电，但已知细胞死亡和多动可能是神经元死亡的结果。最初我们预期TSC1会减轻多动症，但NMDA的作用在早期时间点占主导地位。对这些令人惊讶的结果的解释可能来自一份关于谷氨酸通过降低IGF-1受体酪氨酸磷酸化作用于NMDA受体的报告，而IGF-1受体酪氨酸磷酸化降低了培养神经元的生存信号[66]。另一个因素可能是olp迁移的延迟，正如我们之前使用相同的小鼠模型[38]报道的那样。新形成的OLs到达裸轴突的延迟也可能导致髓鞘形成延迟引起的过度活跃。在之后的时间点OL有髓鞘轴突，因此，神经元功能可能已经正常化。
以前的结果生成道奇et al。研究表明，在家族性ALS小鼠模型中，向中枢神经系统输送IGF-1足以延缓疾病进展，并首次证明IGF-1减弱了促进疾病进展的非神经细胞的病理活性[67]。在20世纪90年代，重组形式的IGF-1(肽)被Cephalon公司用于两项ALS临床试验。他们每天皮下注射这种分子，并显示出适度的效果，但没有提高生存率。另一项临床试验证实，IGF1既不能减缓肌萎缩侧索硬化症患者虚弱的进展，也不能减缓其功能恶化(A. Madsen, MDA/ALS新闻杂志)。回顾起来，这些试验很有可能没有显示出可靠的结果，主要有三个因素:A)它的传递方法，因为大多数药物没有到达中枢神经系统;B)半衰期短;C)最重要的是要治疗的疾病的性质。肌萎缩性侧索硬化症是一种进行性神经退行性疾病，这意味着需要持续或定期进行治疗，以保护细胞和支持功能细胞，同时延缓疾病进展。在现有技术的支持下，基因治疗提供了更稳定和持续的IGF1的“生产”和“传递”来治疗神经退行性疾病，如ALS。相比之下，我们在这里证明TSC1是一个有效和有效的配方来减轻早产儿白质损伤。 We previously showed that separately both transferrin and IGF1 support OL survival, maturation and increase myelination by both normal and myelin deficient OL [14,36,68]. Thus, it is not surprising that a single administration of the cocktail is sufficient to trigger and generate a second wave of progenitors to form the white matter. Therefore, in order to overcome the extensive tissue loss typical of PVL, the intervention should occur as early as possible. One can predict that a continuous or periodical delivery of TSC1 during the perinatal life would be deleterious as it would alter the environment and OLPs will not know if they have to move forward in the lineage or remain immature and produce more OL if the environmental conditions allow for it. In the adequate milieu after the excitotoxic insult and a single TSC1 dosis, OL will mature and synthesize all myelin components and myelin.
各种营养因子已显示出对神经保护的希望，但考虑到它们在正常发育中的作用，它们作为治疗剂的作用还不容易阐明。IGF-1对胎儿大脑的生长和成熟以及OL前体的分化都很重要[69)]。在中枢神经系统受到损伤后，IGF-1具有“促进”生存的特性，有助于预防或减弱围产期缺氧和兴奋性毒性对中枢神经系统的损伤[70-72]。此外，经鼻内给药也被证明有效[73]。
中枢神经系统中IGF-1的正常活动涉及多种信号通路。与IGF‐1受体(IGF1Rs)结合的配体触发受体自磷酸化并与对接蛋白结合。细胞通过从受损的线粒体释放细胞色素c触发凋亡形成。细胞色素与atp依赖性蛋白水解因子1(APF -1)单体结合，然后产生APF七聚体或七聚体凋亡体。Pro-caspase-9，在凋亡小体中募集或直接与Apf1结合，激活caspase-9，裂解pro-caspase-3并激活它。Caspase-3依次分解细胞组分，使其循环利用[74]。因此，在我们的实验范例中，TSC1中含有的外源性IGF-1可能会阻止线粒体损伤和细胞色素释放，阻断导致细胞凋亡的caspase链事件。缺氧诱导因子1α (HIF-1α)激活是对缺氧预处理诱导的继发性HI损伤保护的关键调节因子[75-76]。HIF-1α是一种神经转录因子，通过与HIF-1β结合稳定在缺氧状态。稳定后，它会产生多种具有神经保护作用的下游靶点，包括IGF-1、血管内皮生长因子和促红细胞生成素[77]。
铁是生命所必需的，它在细胞中的数量受细胞表面转铁蛋白受体(TfR)介导的铁作为转铁蛋白-铁的摄取所控制。铁调节蛋白(IRP)与铁响应元件(IRE)在TfR mRNA的3 ' -非翻译区相互作用调节TfR的合成。irp作为细胞铁的传感器[78]。活性氧和活性氮引起的细胞氧化损伤是由细胞铁稳态控制的[79]。暴露在H2O2，增强了TfR mRNA的表达，其中TfR似乎是氧化应激和TfR介导的铁摄取之间的联系。转铁蛋白(Tf)是哺乳动物所有正常细胞的铁载体糖蛋白。在循环中，它在成人体内饱和到30%左右。因此，考虑到细胞损伤后铁自由基的螯合释放。在中枢神经系统中，Tf是由OLs和脉络丛合成的。铁(Fe)高密度存在于OLs和髓鞘中，铁和Tf都是所需的髓鞘生产[80]。正如Takeda及其合作者和其他作者所讨论的，过量和/或游离铁可以通过催化过氧化氢产生羟基自由基而具有细胞毒性[81]。在神经退行性疾病中，如阿尔茨海默病和帕金森氏病[82,83]发现大脑铁含量增加，氧化应激被认为是神经退行性疾病的致病机制。相反，大脑Tf水平随着年龄的增长而下降，当老年痴呆症和帕金森病叠加在衰老过程中时，下降幅度会很大[84]。因此，铁相关蛋白Tf、铁蛋白和转铁蛋白受体(TFR)的化学计量对维持中枢神经系统功能至关重要。当olp和或髓鞘破裂时，游离铁被释放出来。在我们的实验模型中，Tf可能作为一种短暂的螯合剂，同时合成铁蛋白(铁蛋白)，帮助防止氧化应激和脂质过氧化。
重要的是，我们之前已经在脊髓发育不良(遗传性髓鞘缺失)[36]和成人中枢神经系统进行性脱髓鞘[37]的动物模型以及脊髓严重挤压的小鼠模型中显示了tsc1对髓鞘形成的协同作用。在目前的研究中，我们证明单剂量TSC1对保护NMDA损伤时存在的OLPs和巢蛋白表达祖细胞是必要和充分的。因此，在谷氨酸兴奋性毒性的情况下，TSC1也作为一种神经保护剂。对增强不成熟大脑修复的疗法的研究已经持续了20多年，而且还在继续。我们相信，目前的工作朝着修复早产儿白质的共同目标迈出了一步，进而将导致长期运动和认知结果的改善。据我们所知，TSC1是唯一一种旨在动员内源性干细胞/祖细胞来取代失去或不健康的OL，旨在通过早产儿的髓鞘化恢复中枢神经系统功能的治疗方法。
这项工作部分由国家多发性硬化症协会PP1498资助;智力与发展障碍研究(HD-04612)。我们感谢Carlos Cepeda博士对手稿的改进意见。
国家多发性硬化症协会PP1498部分证明了对这项工作的财政支持;NICHD智力与发展障碍研究HD-04612。所有其他作者均声明无竞争利益
研究项目的规划和方向:A Espinosa-Jeffrey。R. Arrazola, S. Barajas, B. Chu, A. Taniguchi，手稿的起草:A Espinosa-Jeffrey，手稿的重要知识内容的批判性修订:J. de Vellis, A Espinosa-Jeffrey和A. Feria-Velasco。“所有作者都可以访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。”
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2016年6月08日
录用日期:2016年6月22日
出版日期:2016年6月25日
©2016 Espinosa-Jeffrey A.这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可条款发布，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Espinosa-Jeffrey A, Arrazola RR, Chu B, Taniguchi A, Barajas SM(2016)营养因子干预在围产期兴奋性毒性模型中再生巢蛋白表达细胞群:围产期脑损伤和早产的意义。整合分子医学3:DOI: 10.15761/ im .1000228。
加州大学洛杉矶分校智力与发育障碍研究中心神经科学研究大楼375E室，查尔斯·e·杨南路635号，邮编90095-7332，电话:310-825-1747;传真:310-206-5061
图1所示。巢蛋白- gfp小鼠的低倍率矢状面(A-C/ 24小时PI)和冠状面(D,D1, D2 24小时PI)脑组织切片。A) 6日龄未处理的动物。第三脑室壁和室下区(SVZ)显示迁移的巢蛋白表达细胞(箭头)和HSP-32的缺失。B) P5时用NMDA处理，P6时分析的动物大脑显示由nestin阳性和HSP-32阴性细胞组成的大囊肿。此外，第三脑室壁(箭头)和SVZ似乎已失去巢蛋白表达。C) P5时用NMDA+TSC1处理，P6时分析的动物大脑显示完整的心室壁(箭头)，所有区域的SVZ均较厚。与未处理的动物相比，更多的巢蛋白阳性细胞似乎向薄壁组织迁移，并有少量共表达HSP-32(箭头)。3 .答案D理查德·道金斯老鼠大脑的脑室。E)另一只动物在注射NMDA 24小时后的视图，心室壁被去除巢蛋白阳性细胞(箭头)。巢蛋白表达细胞聚集在心室附近(箭头所示)。周围仅可见到单个分散的巢蛋白表达细胞。F)在脑实质中，由共同表达巢蛋白和热休克蛋白-32的细胞形成了一个囊肿，呈现橙色。薄壁组织中有表达巢蛋白的细胞，这些细胞与囊肿呈同心圆排列。这些聚集的细胞可能会随着时间的推移而消失。G) NMDA+TSC1治疗小鼠的冠状面，可见大量“放射状胶质样”巢蛋白阳性细胞，长突起垂直于脑室壁(实箭头)，巢蛋白阴性/HSP-32阳性细胞似乎沿着这些纤维迁移(打开的箭头，(g1插入)。G2)。同一脑室低倍镜显示大量巢蛋白表达。 G3) Diagramatic representation of a coronal view of the mouse brain showing the lateral ventricle (Figure 1E).
图2。处理24小时后巢蛋白- gfp转基因小鼠矢状面旁的低倍率视图。切片进行ki67和CNPase免疫标记。A)未治疗的6日龄动物或D)未治疗的35日龄小鼠。B)注射NMDA 24小时后，注射了NMDA的小鼠的心室与未接受NMDA+TSC1组合的小鼠相比已经明显增大。脑室壁及室下区可见nestin+、Ki67+和CNP+细胞。在许多情况下，nestin与Ki67(黄色细胞)共表达，表明它们起源于Ki67通过细胞增殖(插入)。D)未接受治疗的39日龄小鼠心室内部部分只有少量巢蛋白+细胞沿心室壁分散，SVZ细胞已从该区域迁移。心室外壁仍厚，但SVZ外几乎未见巢蛋白阳性细胞。E)此时注射NMDA的小鼠心室非常大，心室壁内部只有很少的巢蛋白阳性微弱标记细胞。在该区域几乎没有细胞表达Ki67和CNPase。F) NMDA+TSC1组小鼠的心室比没有TSC1组小鼠的心室小得多。心室外侧仍可见巢状细胞+，部分细胞从SVZ迁移至薄壁组织。许多这样的细胞(共表达Ki 67(插入)。此时在心室附近没有单独表达ki67的细胞，这表明它们可能已经迁移了。
图3。同侧脑室的增大在不同治疗方法中有差异。利用体视学，我们接下来测量了3理查德·道金斯心室从中线开始。这种形态分析与上述测量的不同之处在于，这里只测量了脑室的同侧部分，并在给定的时间点在不同的治疗方法中进行了比较，而不是比较注射半球的侧脑室与未注射的(对侧)侧脑室在同一大脑部分的面积:单独NMDA(粉红色条);同时注射NMDA+TSC1(紫色条)和NMDA后延迟治疗TSC1(绿松石条)。单独注射NMDA的小鼠第三心室随着时间的推移出现明显的组织损失。同时注射NMDA + TSC1 35天后，第三脑室明显增大，但比未注射的小鼠大约8倍。接受延迟注射的小鼠的心室大小也比单独注射NMDA的小鼠小50%左右。PI-1组治疗间差异有统计学意义。在PI-35组中，同时给予TSC1的小鼠与在NMDA后3天给予TSC1的小鼠之间差异不显著，提示在NMDA后3天再给予TSC1的小鼠脑组织兴奋毒性可得到缓解;而单独NMDA细胞数量显著。数值表示为平均值±SEM; *p<0.05,‡P <0.01与对照组比较。
图4。第三脑室SVZ和CC中表达netin - gfp的祖细胞总数的比较。矢状面检查，使用光学分分器探针(mbf)和63X油物镜计数巢蛋白表达祖细胞。A)早在GME后1天，NMDA注射小鼠中表达巢蛋白的祖细胞总数就急剧减少，SVZ中留下的细胞比迁移到CC的细胞多。同时注射NMDA + TSC1的小鼠显示25%表达巢蛋白的细胞减少，而单独注射NMDA的小鼠几乎减少66%。在注射盐水和NMDA的小鼠之间差异显著，而在未注射盐水或未处理的对照组和N + TSC1小鼠之间差异不显著，表明SVZ和CC中表达巢蛋白的细胞数量与单独注射NMDA的小鼠相比非常接近。SVZ的意义(＊P)<0.05，对于CC (＊P)与对照组相比<0.05。B)注射后35天，无论TSC1是否存在，盐水注射小鼠的巢蛋白表达细胞数量均高于NMDA注射小鼠的巢蛋白表达细胞数量;单独使用NMDA，表达巢蛋白的细胞总数的损失从66%减少到45%。此时NMDA+TSC1同时注射，巢蛋白表达细胞总数减少39%。当TSC1在NMDA给药3天后延迟注射时，可看到更明显的降低。尽管如此，与注射NMDA的小鼠相比，更多的细胞迁移到CC。柱状表示各组的均值±SE。＊与对照组比较P<0.05。N+TSC1sim和N+TSC1给药3天后CC细胞数量差异显著(＊P<0.01)，提示注射TSC1越早，更多表达巢蛋白的细胞被保留。
图5。心室下区再生通过表达巢蛋白的祖细胞亚群的增殖以及通过直接动员沉默的巢蛋白表达细胞。注射后7天，在同侧半球第三脑室SVZ周围矢状面选取十个野。首先，只有表达巢蛋白- gfp的细胞被计数(柱的绿色部分)，这些细胞的增殖标记Ki67为阴性。数值表示为平均值±SEM;*p<0.01的处理与对照组。有趣的是，在NMDA治疗后，再注射3天延迟的TSC1, nestin阳性细胞的总数略高于NMDA治疗小鼠。将各实验条件下的巢蛋白+细胞数量与未处理小鼠的巢蛋白+细胞数量进行比较。Ki67和nestin在SVZ(条的橙色部分)的共表达也通过计数SVZ周围相同十个区域的双标记细胞来评估。对照组表达巢蛋白的细胞总数低于治疗组。大约三分之一的细胞共同表达nestin和Ki67。NMDA处理的小鼠也显示产生了新的巢蛋白表达细胞通过ki67表达评估细胞增殖。一个惊人的发现是，在同时或在NMDA给药后三天内接受NMDA +TSC1的小鼠中，形成了两倍的巢蛋白表达细胞通过细胞增殖与对照组相比。在同时注射的N+TSC1中，表达巢蛋白的细胞总数几乎翻倍，其中近50%是新的祖细胞通过细胞增殖。注射NMDA, 3 d后再进行TSC1处理，非增殖巢蛋白阳性细胞数量略多，而非增殖巢蛋白阳性细胞数量略多通过增殖达到40%左右。数值表示为平均值±SEM;*p<0.01治疗组与对照组(未治疗组)比较。
图6。TSC1诱导侧脑室SVZ内巢蛋白表达细胞的“觉醒”。为了评估NSC的“觉醒”和迁移，我们使用7月龄巢蛋白绿色荧光蛋白(GFP)小鼠300 μ m厚度的新鲜脑切片进行区分di新生GFP-nestin表达式。使用TSC1治疗的冠状面脑切片显示侧脑室在115分钟内呈单一聚焦平面。注意在暴露于TSC1几分钟内室壁和室下区域明显增厚。我们观察了gfp巢蛋白表达细胞的动态行为。一些阴性区域(黄色矩形)在处理后1分钟开始被巢蛋白-GFP强烈标记，从11分钟开始逐渐可见(开放箭头)，并在109分钟(1h 49分钟，实箭头)继续显示100%的SVZ光。与此同时，SVZ在第0时刻表达强烈到中等绿色荧光的区域逐渐变为阴性，直到第88分钟(1h 28分钟)未检测到GFP。有趣的是，同样的区域在100分钟后开始再次亮起，并在9分钟后被强烈标记，此时侧脑室的全视图为GFP阳性。伴随这些现象的发展，单双极细胞从SVZ迁移到邻近的薄壁组织(箭头)。最初，只有几个细胞可见，但随着时间的推移，垂直于SVZ的细胞行被观察到(小箭头)。值得注意的是，加入TSC1 11分钟后，巢蛋白阴性区域变为阳性，而该区域下方则相反。17min后，同样的区域关闭，在TSC1加入组织切片后的33min再次变为绿色。 Starting at 17 min green cells appeared to have moved beyond the SVZ into the brain parenchyma. This region of the SVZ was the most active as it went gradually on (at 33 and 100 min) and off (at 17 and 73min). The complete SVZ became nestin-GFP positive at 109 min. Migrating cells had increased in number with time and of the SVZ took place during the first 33 min.
图7。在SVZ中，雌激素- r将GME的定位从血管转移到星形胶质细胞。双免疫荧光检测雌激素受体α(雌激素- r α)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。A-D盐水处理小鼠P40时，雌激素r α只存在于血管中，而不存在于星形胶质细胞中。相比之下，NMDA受体35d PI (d = days;雌激素R与GFAP共定位主要在星形胶质细胞的细胞体中，也在血管中强烈表达。星形胶质细胞变大，呈纤维状，具有明显的强表达GFAP (E-H)的过程。有趣的是，在NMDA+TSC-1处理的小鼠(I,J,K,L)中，大多数但不是所有的星形胶质细胞仍然增大，它们的细胞体明显标记有GFAP。其他星形胶质细胞胞体和突起较小，无反应性，数量较少，只有少数星形胶质细胞共表达ER-α。标签沿纤维而不是星形胶质细胞胞体弥漫性分布。雌激素- r不通过巢蛋白- gfp前体(插入体)表达。
图8。胼胝体矢状面。双免疫荧光检测雌激素受体(ER-α)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。胼胝体(CC)显示，未治疗动物(a - d) ER-α主要存在于血管和少数星形胶质细胞中。相比之下，NMDA注射小鼠(E-F) ER-α与GFAP共定位主要在细胞体中，并在血管中强烈表达。星形胶质细胞反应性强，标记性强，呈纤维状。有趣的是，在NMDA+TSC-1处理的小鼠(H,I,J,K)中，星形胶质细胞似乎没有反应，它们的数量较少，细胞体较小，GFAP标记的细胞突起也较小，它们的数量较少，只有少数共同表达ERα。ERα几乎不存在于血管中，表达ERα的细胞和GFAP分布在纤维中，而不是在细胞体中。ERα不由巢蛋白- gfp前体表达。插入物显示，在与GFAP/ ERα共标记细胞相邻的巢蛋白表达细胞中，ERα标记缺失。
图9。在兴奋毒性期间或之后，由TSC1产生的差异神经保护作用．对照组小鼠注射生理盐水(A-D)。A). SVZ和心室壁部分区域有巢蛋白阳性细胞。B) SVZ及邻近薄壁组织中也存在O4表达细胞。C)注射生理盐水的小鼠不表达Caspase 9。D)三个标记的合并视图。单独使用NMDA (E - h)的小鼠在心室壁(E)显示出强烈的巢蛋白标记祖细胞(E) = SVZ中几乎没有，而在邻近的薄壁中有大量的单细胞。F)毛细胞过程中O4阳性细胞很少。G)这些O4阳性细胞共表达caspase 9。单细胞的突起也较少。 In addition, the full area surrounding the lateral ventricle of the injected hemisphere showed caspase intense staining as “puncta”. These puncta seemed to be predominant in comparison to the extent of O4 labeled puncta. H) Very few nestin positive cells co-expressed caspase 9. When NMDA was injected simultaneously with TSC1 (I–L), nestin-labeled cells were seen across the wall of the ventricle, SVZ and adjacent parenchyma (I). There was much more O4 expressed in small size OLPs; some could be seen as bipolar cells with long processes than in mice injected with NMDA alone. More O4 labeled puncta were observed (J). In these mice, some but not all, nestin-expressing cells co-expressed caspase 9 (L). The delayed administration of TSC1 3 days after NMDA injection resulted in a spongy-like tissue M–P). Nonetheless, both the expression of nestin (M) and O4 (N) were preserved and O4 positive cells were negative for caspase 9 (O). It also appeared as if caspase 9 was labeling cells other than nestin-expressing and O4 labeled cells, in which cases caspase 9 seemed to label flatter cells (O).
图10。NMDA在早期诱发多动行为。最初，未接受治疗的小鼠和9天前注射TSC1的小鼠有相似的行为，小的差异并不显著。相比之下，单独注射NMDA或注射NMDA + TSC1的动物表现为多动，与对照组(未治疗)小鼠相比差异显著。治疗27天后，所有组的行为相似，但与未治疗的小鼠相比，nmda治疗小鼠的差异显著。相比之下，TSC1组和N-TSC1组小鼠的行为基本相同，差异不再显著。
