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摘要gydF4y2Ba

异种抗体对多种内皮细胞具有特殊的反应性。在大多数情况下，这种交叉反应性被认为可以忽略不计，并且在测定抗内皮细胞抗体时不考虑异种抗体。然而，也有证据表明，异种抗体可能导致几种内皮细胞凋亡。在这项研究中，我们在非人类灵长类动物中检测了针对非半乳糖a1,3-半乳糖(Gal)抗原的抗猪异种抗体的特征，这些抗体通过暴露于猪红细胞(PRBC)和用GAS914消耗抗Gal抗体而增强。抗非半乳糖抗体的产生与第10天IgM和IgG抗体对L35(猪淋巴母细胞)的反应性增强相关。在第20天和第30天，IgG抗体与猪内皮细胞(AOC-40)的结合增加，与人微血管内皮细胞(HMEC-1)的结合平行。这些抗体分别通过两种不同的途径引起AOC-40和HMEC-1细胞的凋亡，分别有和没有DNA片段化。抗非gal抗体的Western blotting显示，与注射PRBC前的样品相比，AOC-40和HMEC-1裂解物中几个蛋白条带的强度增加，并且瞬时检测到一些新的条带。在一只动物中使用环磷酰胺治疗导致与AOC-40和HMEC-1蛋白结合的抗非半乳糖抗体几乎消失，而不改变细胞表面抗体的反应性或这些细胞的凋亡。因此，狒狒暴露于PRBC会增加与猪淋巴母细胞以及猪和人内皮细胞结合的异种抗体。 The xenoantibodies caused apoptosis of porcine and human endothelial cells by apparently targeting non-protein antigens. This study substantiates a cross-reactivity of xenoantibodies to endothelial cells from different species, which may be particularly relevant if there is a xenogeneic exposure. In this setting, disregarding these antibodies may impair the proper assessment of the prevalence and role of anti-endothelial cell antibodies in human and animal disorders.

关键字gydF4y2Ba

异种抗体，抗内皮细胞抗体，交叉反应抗体，内皮细胞，异种移植gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

猪器官的异种移植目前还不是临床实践，因为迄今为止可用的工具无法控制人类和非人灵长类动物的异种移植物引发的体液免疫反应。最初，针对低聚糖半乳糖a1,3-半乳糖(Gal)的抗体被发现是猪移植物移植到人类和非人类灵长类动物的超急性排斥反应的原因，也是急性体液异种移植物排斥反应(AHXR)的主要原因[1-3]。然而，通过含有多个Gal表位的聚合物和使用缺乏该表位的猪的移植物(a1,3半乳糖转移酶敲除;Gal-KO)证明非gal抗原抗体在非人灵长类动物猪器官AHXR中起主要作用[4-6]。这种排斥反应的特征是由内皮细胞的活化、增殖和凋亡引起的血栓性微血管病变[7]，这表明非半乳糖抗体对这些细胞具有特殊的反应性[8]。gydF4y2Ba

分别用人和鼠内皮细胞免疫小鼠和家兔，可产生与多种内皮细胞交叉反应的IgG异种抗体[9,10]。这些抗体引起内皮细胞凋亡，从而产生抗血管生成和抗肿瘤作用[9,10]。因此，通过注射人内皮细胞产生的异种抗体同样对人和小鼠内皮细胞和肿瘤产生影响。小鼠内皮细胞免疫后出现相同的反应。暴露于异种内皮细胞产生的异种抗体的交叉反应性归因于不同种类内皮细胞共享的蛋白质抗原。然而，异种抗体反应是物种限制的，不是细胞特异性的，除了内皮细胞外，暴露于其他细胞上的异种抗原也会产生针对不同物种内皮细胞的交叉反应性抗体[11]。gydF4y2Ba

内皮细胞包括多种抗原和抗内皮细胞抗体(AECA)，在人类和动物的结缔组织疾病、血管炎和其他炎症性疾病中都有报道[12,13]。AECA可引起不同的病理生理作用，包括直接或间接的细胞毒性、内皮细胞活化和凋亡[14]。然而，AECA也包括异种抗体，这些异种抗体被认为可以忽略不计，并且在用于检测AECA和其他抗体的免疫测定中会造成干扰，导致假阳性结果[15,16]。因此，在测定AECA之前，建议采用其他物种动物蛋白的抗体吸收步骤去除异种抗体[16]。gydF4y2Ba

在本研究中，我们通过暴露于猪红细胞(PRBC)诱导非人灵长类动物产生针对非gal抗原的抗猪异种抗体，并比较了这些抗体在猪和人内皮细胞或淋巴细胞上的反应性和作用。更好地表征异种抗体对不同种类内皮细胞的反应性可能与异种移植有关。然而，了解异种抗体在人类和动物疾病中评估AECA的检测中的潜在作用可能更为重要。我们选择了PRBC而不是猪内皮细胞，因为在人类和动物中接触异种内皮细胞的情况都很少见。相比之下，暴露于其他类型细胞中的异种抗原，比如食物中的异种抗原，可能会发生得更频繁。gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

动物gydF4y2Ba

共有5只狒狒(gydF4y2BaPapio导引亡灵之神;gydF4y2Ba本研究使用Consort Bioservices, Steyming, UK)。这些重达10至15公斤的动物被安置在西班牙环境部长和加利西亚农业部批准和认可的设施中。2头hDAF转基因猪(Novartis Pharma A.G. Basel, Switzerland)被用作PRBC的来源。gydF4y2Ba

道德gydF4y2Ba

调查符合gydF4y2Ba实验动物的护理和使用指南gydF4y2Ba由美国国立卫生研究院出版(美国国立卫生研究院出版物第85-23号，1996年修订)gydF4y2Ba欧洲实验用脊椎动物保护协定gydF4y2Ba(86/609)，并获得inibic - complexjo Hospitalario Universitario Coruña研究委员会的批准。gydF4y2Ba

PRBC注射，狒狒血样和副作用gydF4y2Ba

狒狒接受静脉注射PRBC (6-6.5 x 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/ml)，目标是实现抗非半乳糖溶血性抗猪抗体(HAPA)的持续水平高于抗半乳糖抗体。三只狒狒(C79, D29和D33)接受单次注射50 ml PRBC。D29在第一次接种后60天再注射5 ml。另外两只狒狒每天注射5次10ml (C54)或10次5ml (C63)进行免疫(表1)。在首次注射PRBC后的第5、7、10、15、20和30天获得狒狒血液。动物D29在第65、67、70、75、80、90和120天额外抽血)(表1)。只有一只动物(D29)注射PRBC有副作用，在最初注射50毫升时出现轻度呼吸功能不全。在9个月的随访中，没有观察到任何动物出现不合理的自身免疫迹象。gydF4y2Ba

表1。gydF4y2Ba动物鉴定，血型，注射，取样和治疗方案gydF4y2Ba

狒狒gydF4y2Ba	狒狒血型gydF4y2Ba	猪gydF4y2Ba	猪血型gydF4y2Ba	PRBC注射剂(体积和天数)gydF4y2Ba	狒狒血样(天)gydF4y2Ba	GAS914行政管理(天)gydF4y2Ba	环磷酰胺gydF4y2Ba
C54gydF4y2Ba	ABgydF4y2Ba	a - 751gydF4y2Ba	0gydF4y2Ba	10cc天0至5gydF4y2Ba	5 0、5、7、10、15、20、30gydF4y2Ba	每天-5到15天gydF4y2Ba QOD天数16 ~ 30天gydF4y2Ba	没有gydF4y2Ba
C63gydF4y2Ba	BgydF4y2Ba	a - 750gydF4y2Ba	0gydF4y2Ba	5cc天0至10gydF4y2Ba	5 0、5、7、10、15、20、30gydF4y2Ba	每天-5到20天gydF4y2Ba QOD第21天至第30天gydF4y2Ba	50 mg/kg第20、21、22、23天gydF4y2Ba
C79gydF4y2Ba	BgydF4y2Ba	a - 750gydF4y2Ba	0gydF4y2Ba	50cc day 0gydF4y2Ba	5 0、5、7、10、15、20、30gydF4y2Ba	每天-5到10天gydF4y2Ba QOD第11天至第30天gydF4y2Ba	没有gydF4y2Ba
D33gydF4y2Ba	一个gydF4y2Ba	a - 751gydF4y2Ba	0gydF4y2Ba	50cc day 0gydF4y2Ba	5 0、5、7、10、15、20、30gydF4y2Ba	每天-5到10天gydF4y2Ba QOD第11天至第30天gydF4y2Ba	没有gydF4y2Ba
D29gydF4y2Ba	ABgydF4y2Ba	a - 751gydF4y2Ba	0gydF4y2Ba	50cc day 0gydF4y2Ba 5cc day 60gydF4y2Ba	5、0、5、7、10、15、20、30、40、50、60、65、67、70、75、80、90、120gydF4y2Ba	每天-5至10天和55至70天gydF4y2Ba QOD第11 ~ 54天和第71 ~ 120天gydF4y2Ba	没有gydF4y2Ba

GAS914和环磷酰胺(CyP)治疗gydF4y2Ba

所有动物从第5天(相对于第一次PRBC注射)皮下注射GAS914 (Novartis Pharma, A.G. Basel, Switzerland) 1 mg/kg/天至最后一次注射后10天[4]。之后，每隔一天给药1 mg/kg GAS914，直到第一次注射的第30天。动物D29接受两次猪血注射，间隔60天，在120天内注射GAS914，从第5天至第10天、第55天至第70天每天注射一次，其余天每隔一天注射一次(表1)。gydF4y2Ba

在首次PRBC注射后第20天，用200 mg/kg CyP治疗狒狒C63，持续4天。选择CyP的剂量是因为它在很大程度上消除了成熟的免疫系统，导致抗体和自身抗体水平大幅降低，同时保持造血前体完整(表1)[17]。gydF4y2Ba

抗gal和HAPA测定gydF4y2Ba

如前所述[18]，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗gal抗体和猪红细胞和兔补体进行溶血试验，测量抗gal和HAPA。gydF4y2Ba

细胞系gydF4y2Ba

L35(猪淋巴母细胞系)，HMEC-1(人微血管内皮细胞系)gydF4y2Ba，gydF4y2BaJurkat E6.1(人白血病T细胞母细胞系)来自American Type Culture Collection (Rockville, MA, USA)。AOC-40(猪内皮细胞系)是Rodriguez-Barbosa博士，Leon，西班牙赠送的礼物[19]。gydF4y2Ba

流式细胞术测定细胞表面抗体反应性gydF4y2Ba

细胞系(AOC-40、HMEC-1、L-35和Jurkat E6.1)置于96孔v型底板(丹麦NUNC)，尺寸为2.5x10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba-3.5 x10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba用FACS缓冲液冲洗两次(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)。然后，用50ml测试血清(1:5稀释FACS缓冲液)在4ºC下孵育40分钟，然后用FACS缓冲液洗涤三次。用抗人IgM (m链特异性)或IgG异硫氰酸荧光素(FITC)偶联(丹麦DAKO)(1:20稀释)作为二抗，在4ºC黑暗孵育30分钟。用FACS缓冲液冲洗三次后，用CellQuest程序(BD Biosciences)在FACScan细胞仪上分析5000个细胞/管，在表示FL1的直方图中进行分析。仅用二抗孵育的细胞作为阴性对照。gydF4y2Ba

膜联蛋白V (AnV)/碘化丙啶(PI)测定gydF4y2Ba

AOC-40和HMEC-1细胞5x10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞/孔在24孔板中加入100µl狒狒血清(在无血清培养基中稀释1:2)培养24小时。然后，使用胰蛋白酶- edta (Life Technologies, CA, USA)分离细胞，并用An V-Fluos标记试剂(Roche Applied Science, Germany)(1:50)和PI溶液(1:1000)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)按照制造商的方案进行染色。gydF4y2Ba

DNA片段的测定gydF4y2Ba

采用APO BrdU Kit Assay (BD Biosciences)评估AOC-40和HMEC-1细胞的DNA片段。为此，5x10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞/孔用100µl狒狒血清(在无血清培养基中稀释1:2)在24孔板中培养24小时。然后，使用胰蛋白酶- edta (Gibco)分离细胞，并根据制造商的方案进行染色。gydF4y2Ba

Western blot分析gydF4y2Ba

采用裂解缓冲液制备AOC-40和HMEC裂解物，其中含有50 mM Tris-base (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)， 155 mM NaCl (Sigma)， 2mm EDTA (Sigma)， 0.2% Triton X-100 (Sigma)， 0.3% NP-40 (Sigma)， 0.1 mM PMSF (Sigma)，在4°C下放置1小时。裂解物在10000℃下离心澄清gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟后，用Bio-Rad检测试剂盒(Bio-Rad)检测上清蛋白浓度。然后将样品与5倍样品缓冲液和1% b-巯基乙醇(Bio-Rad)混合，在100℃下加热5分钟，将30µg/µl的裂解物装在10% sds -聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)上，转移到免疫印迹聚偏二氟乙烯膜(Immobilón-P)上gydF4y2Ba^S-QgydF4y2Ba(Millipore, Billerica, MA, USA)转移后，将膜在5%脱脂干乳中封闭1小时，洗涤，与适当稀释的狒猴样本血清(1:100)在4℃下孵育过夜，洗涤，与二抗(稀释1/8000 - 1/6000)抗人IgG (γ链特异性)或抗人IgM(µ链特异性)过氧化物酶偶联(Sigma)在室温下孵育1小时，洗涤。使用ECL系统(GE Healthcare Biosciences, Little Chalfont, UK)在数码相机CCD as -3000 (Fuji-Film, Tokyo, Japan)上对蛋白质进行可视化。用二抗膜孵育(不含狒狒血清)作为阴性对照。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

诱导抗非gal HAPAgydF4y2Ba

在注射PRBC之前，删除anti-Gal抗体GAS914导致血统的完全消失在所有的狒狒(图1)。PRBC注入随着GAS914管理与代anti-non-Gal HAPA从第五天,7和10天之间达到顶峰的初始接种反应(图1)。一个相同的模式也观察到在第二次注射在狒狒D29和狒狒C54和C63收到5每天注射10毫升5或10每天注射分别毫升。在狒狒D29(图1C)和C54或C63(图1D和E)第二次注射后观察到，HAPA的最高水平是抗gal抗体水平的2至4倍。在首次PRBC注射后的第20天，狒狒C63也被注射了200 mg/kg的CyP，持续4天。由于CyP处理毒性，动物于第32天死亡，第30天抗非gal HAPA水平未发生变化(图1E)。gydF4y2Ba

图1所示。gydF4y2Ba猪血免疫狒狒抗gal IgM(圆形)、IgG(三角形)和HAPA(方形)水平。免疫方案在材料和方法中描述。箭头表示注射猪血的天数。A)狒狒C79;B) D33;C) D29;D) C54;C63 E)。gydF4y2Ba

抗非gal HAP的反应性gydF4y2Ba

用GAS914去除抗gal抗体与IgM和IgG抗体与AOC-40和L35的结合显著减少相关(图2A和B)，而与人细胞系HMEC-1和Jurkat E6.1的结合仅观察到轻微的影响。在注射PRBC并诱导抗非gal抗体后，所有动物在第10天都有与GAS914治疗前相似的IgM和IgG抗体结合AOC-40，而抗L35的抗体明显更高(图2A和B)。在第20和30天，IgM和IgG对L35和IgM对AOC-40的反应性下降，而IgG对AOC-40的结合性增强。在动物C63和D29中观察到最高的反应活性，后者在第二次注射PRBC后，与去除抗gal抗体和注射PRBC前第0天检测到的结合相比，增加了2到9倍。gydF4y2Ba

图2。gydF4y2Ba流式细胞术序列检测狒狒抗体与AOC-40、HMEC-1、L-35和Jurkat E6.1的结合。A) C54、C63、C79和D33在-5、0、10、20和30天以及D29在-5、0、10、60、70和120天IgM和IgG抗体结合模式。数据是两个独立实验的代表。B) IgM和IgG抗体在狒狒C63中的结合模式。值为第-5天(GAS914给药前)的中位荧光强度;第0天(注射猪血第一天);第10天(最后一次猪血注射);第20天(CyP治疗第一天);第30天(CyP启动后10天，动物死亡前2天)。数据是两个独立实验的代表。gydF4y2Ba

与HMEC-1结合的IgG抗体在第20天和第30天增强了狒狒IgG抗aocc -40的反应性，在C63和D29分别增强了27倍和3倍(图2A和B)。抗非gal抗体未检测到IgM对HMEC细胞的反应性变化。此外，没有IgG抗体与Jurkat E6.1结合，尽管存在一些IgM反应性(图2A和B)。在狒狒C63中使用CyP对IgM和IgG抗体与猪和人细胞系结合的影响很小。gydF4y2Ba

抗非gal HAPA在AOC-40和HMEC-1细胞中的作用gydF4y2Ba

将AOC-40和HMEC-1暴露于狒狒血清中，用AnV和PI染色，观察异种抗体是否能诱导这些细胞凋亡。AOC-40细胞与去除抗半胱氨酸抗体前收集的狒狒血清孵育，显示出AnV-/PI+(坏死)模式，在首次PRBC注射含有抗非半胱氨酸抗体的狒狒血清10天后也观察到这种模式(图3A和B)。在第一次PRBC暴露后的第20天和第30天，这种模式转变为AnV+/PI+(凋亡)模式(图3A和B)。暴露于含有抗非gal抗体的狒狒血清后，AnV-/PI+水平显著升高(图3A和B)。在C63和D29动物的血清中，AOC-40和HMEC-1中AnV-/PI+标记水平最高(图3A和B)。gydF4y2Ba

图3。gydF4y2BaAOC-40和HMEC-1细胞与狒狒血清孵育后膜联蛋白V和PI染色。样本识别与图2中描述的相同。A)用C63动物血清培养24h的AOC-40和HMEC-1细胞，采用FITC-annexin V和PI染色，流式细胞术分析。B) AOC-40和HMEC-1与狒狒C63和D29血清样品孵育后AV(黑色柱)和PI(白色柱)的中位荧光强度。数据是两个独立实验的代表。gydF4y2Ba

为了进一步表征细胞死亡的原因，我们还研究了DNA断裂，这是细胞凋亡的一个特定指标。与含有抗gal抗体的狒狒血清孵育的AOC-40细胞显示出最小的DNA片段。然而，这种现象出现在超过50%的细胞暴露于抗非半乳糖抗体。将HMEC-1细胞暴露于含有抗gal或抗非gal抗体的狒狒血清中，不会导致这些细胞的DNA断裂。在C63和D29动物的血清中检测到AOC-40细胞中最高水平的DNA片段，后者是在第二次注射PRBC后检测到的(图4A和B)。CyP治疗并没有改变C63狒狒中AnV/PI标记AOC-40和HMEC-1的模式，也没有改变抗非半乳糖抗体引起的AOC-40的DNA片段。gydF4y2Ba

图4。gydF4y2BaAOC-40和HMEC-1细胞与狒狒血清孵育后的BrdU染色。样本识别与图2中描述的相同。A)用C63动物血清培养24h的AOC-40和HMEC-1细胞用fitc标记的抗brdu染色，流式细胞术分析。M1对应阴性对照，M2对应染色细胞。B) AOC-40(黑色柱)和HMEC-1(白色柱)细胞暴露于C63和D29血清样本后BrdU阳性细胞的百分比。数据是两个独立实验的代表。gydF4y2Ba

AOC-40和HMEC-1细胞中抗非gal HAPA的蛋白识别gydF4y2Ba

为了研究抗非半乳糖抗体是否靶向猪和人内皮细胞中的特异性蛋白，我们用这两种细胞类型的裂解物和狒狒C63和D29的血清进行了Western blots。由于缺乏足够的血清样本，无法对其他动物进行评估。用含有抗gal抗体的狒狒血清进行印迹孵育，在AOC-40和HMEC-1裂解物中产生多个条带(图5A和B)。去除抗gal抗体降低了大多数AOC-40蛋白的反应性强度，而在HMEC-1中没有观察到这种影响(图5A和B)。gydF4y2Ba

版权所有OAT。版权所有gydF4y2Ba

图5。gydF4y2Bawestern blot检测C63和D29狒狒血清对AOC-40和HMEC-1细胞裂解物的反应性样本识别与图2中描述的相同。A)在AOC-40和HMEC-1裂解物中，用D29血清IgG检测到一条32.0 kDa的新条带。此外，C63 IgG在第10天仅在HMEC-1裂解物中短暂反应到106.9 kDa的新条带。CyP治疗(第63天第30天)与IgG对AOC-40和HMEC-1裂解物的反应性显著降低相关。B)在检测第70和90天的D29血清时，在AOC-40和HMEC-1裂解物中检测到IgM反应性在57.7 kDa的新条带上。在AOC-40裂解液中，C63在第10天也观察到该条带。在D29第70和90天的AOC-40和HMEC-1裂解物中也检测到两个新的反应带，分别为120.7和127.6 kDa。用CyP治疗(C63天30)表明IgM与AOC-40和HMEC-1裂解物的结合完全消失。gydF4y2Ba

在评估暴露于PRBC后获得的样本时，与免疫前血清的结果相比，检测到一些新的条带，尽管它们在每只狒狒中有所不同(图5A和B)。因此，对应于第70天和第90天的D29血清IgG在aac -40和HMEC-1裂解物中显示出对32.0 kDa的新条带的反应性。此外，C63 IgG在第10天短暂检测到106.9 kDa的新条带(仅在HMEC-1裂解物中)。AOC-40和HMEC-1裂解液与第70和90天的D29血清孵育时，分别在57.7、120.7和127.6 kDa的新条带上观察到IgM的反应性，而仅在第10天的AOC-40裂解液中也检测到57.7 kDa的C63条带。gydF4y2Ba

在AOC-40和HMEC-1细胞溶解物的western blots中观察到，CyP在C63动物体内处理后，IgG抗体检测到的所有条带强度显著降低，与IgM抗体反应的条带几乎消失(图5A和B)。这与使用相同的血清样本和靶细胞使用流式细胞术检测CyP处理后细胞表面抗体反应性和细胞毒性的显著检测形成对比。总之，这些结果表明抗非gal HAPA与AOC-40和HMEC-1交叉反应包括不靶向这些细胞上的蛋白抗原的抗体。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

在本研究中，我们通过暴露于PRBC在狒狒中产生抗非gal IgG异种抗体，该抗体与猪AOC-40和L35细胞系以及人HMEC-1细胞系反应，导致猪和人内皮细胞凋亡。这证实了异种抗体对不同种类内皮细胞的特殊反应性，这至少部分与异种抗原有关，而不仅仅是内皮细胞抗原[9]。免疫原性能力是否局限于与发育密切相关的内皮细胞和血细胞上的异种抗原[20]，或者可能扩展到其他细胞类型，如上皮细胞，目前的研究还不能回答。然而，啮齿类动物的异种移植研究表明，皮肤异种移植也可能增强或降低对其他物种内皮细胞的反应性[11]。gydF4y2Ba

注射PRBC后，AOC-40细胞暴露于狒狒抗非gal抗体，通过AnV/PI染色和DNA片段检测细胞凋亡。在移植到狒狒体内的Gal-KO猪心脏的AHXR处也发现了内皮细胞凋亡的异种抗体[7]。相比之下，主要由IgM抗体介导的转人补体蛋白移植到非人灵长类动物的野生和猪器官的AHXR未观察到凋亡[21]。在我们的研究中，抗gal抗体，主要是IgM，引起AOC-40细胞的最小凋亡，坏死是由这些抗体触发的主要死亡途径，即使没有添加外源补体来检测。经GAS914处理和注射PRBC后，狒狒血清样品中抗非gal IgG抗体普遍存在，导致AOC-40细胞凋亡。此外，这些抗体引起人内皮细胞凋亡，但不包括DNA断裂，表明凋亡模式与猪内皮细胞不同。即使DNA断裂被阻止，细胞凋亡也会发生[22]。此外，最常用的细胞凋亡分析方法An V/PI结合试验[23]发现，细胞凋亡的最大程度比DNA片段化检测早8小时[24]。这反映了细胞凋亡的高度动态过程，在此过程中，细胞中的特征形态和生化标志物只能在有限的时间内观察到。这些周期的持续时间取决于细胞类型、细胞周期状态以及凋亡诱导剂的类型和浓度。 Moreover, cells of the same population are not uniform in their susceptibility to an apoptosis inducer and may initiate apoptosis at different times of the exposure [24]. In our study is unclear whether the apoptosis of human endothelial cells induced by baboon anti-porcine antibodies included a lack or delay of DNA fragmentation.

PRBC暴露后，来自AOC-40和HMEC-1细胞的新蛋白同时被靶向，尽管两种动物的模式不同。这些结果与将转人补体蛋白的猪器官移植到非人灵长类动物或将Gal-KO移植到非人灵长类动物后观察到的结果相似。其中包括与移植前样本相比，移植后缺乏新的反应性，或者检测到几个新的条带，其模式与每次移植不同，并且没有不同移植共有的免疫优势靶点[6,25]。我们研究中观察到的一些新条带，如32.0 kDa，与小鼠异种内皮细胞免疫后检测到的条带和移植了Gal-KO猪心脏的狒狒的抗非gal抗体反应相似[6,9]。gydF4y2Ba

CyP治疗10天后，与AOC-40和HMEC-1蛋白结合的IgM抗非gal抗体几乎消失，IgG反应性显著降低。与fas分析在AOC-40和HMEC-1细胞上检测到大量抗体形成对比的是，抗非gal抗体缺乏蛋白结合。虽然只对一只动物进行CyP治疗是一个缺点，不能得出一般性的结论，但结果表明，部分与猪和人内皮细胞交叉反应的抗非半乳糖抗体针对的是其他抗原，而不是蛋白质。碳水化合物被认为是猪异种移植非人灵长类动物后抗非半乳糖抗体的潜在抗原，尽管还不可能与AHXR相关联[26]。尽管如此，CyP在抗非Gal IgG交叉反应异种抗体上的有效性不足，这与我们之前针对Gal抗原的抗体所证明的情况相似[18]。碳水化合物被认为是与t细胞无关的抗原，针对碳水化合物的抗体是由寿命较长的浆细胞产生的，它们比寿命较短的浆细胞更能抵抗辐射或免疫抑制。Neu5Gc唾液酸已被认为是暴露于动物细胞、组织和食物的人体内异种抗体的潜在靶点[27-29]。然而，狒狒表达Neu5Gc，缺乏针对该抗原的抗体[26]，这表明我们在研究中观察到的抗非gal IgG抗体与人内皮细胞的反应性是由其他抗原引起的。gydF4y2Ba

人类被例外地移植了其他动物物种的器官、组织或细胞(异种移植)[30,31]。然而，失活的动物组织，包括心脏瓣膜、皮肤和肌腱，通常被植入患者体内[32,33]。此外，重要的猪皮也被用作烧伤敷料[29,34]。在这些条件下暴露于动物抗原的患者显示出抗半乳糖等异种抗体的适度增加，以及高且持续的抗非半乳糖IgG反应，这与我们在非人类灵长类动物中描述的结果相似[29]。此外，动物和人类通过食物不断接触到其他动物抗原。因此，红肉可能将Neu5Gc等免疫原性分子传递到人体内皮，导致抗体和补体依赖性激活，并可能导致动脉粥样硬化等血管病变[28]。如果先前用动物血清吸收血清，则在此环境中观察到的人类异种抗体与内皮细胞的结合被废除，类似于在测定AECA抗体之前的抗体吸收。因此，如果以前接触过异种抗原，在AECA试验中考虑异种抗体作为干扰并吸收它们可能是不准确的。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究表明，在狒狒中，PRBC免疫与抗半乳糖抗体的消耗一起诱导了对猪和人内皮细胞有反应的抗非半乳糖IgG异种抗体。这些异种抗体通过两种不同的途径引起猪和人内皮细胞的凋亡，显然对非蛋白抗原起反应。本研究的发现证实了异种抗体对不同种类内皮细胞的特殊反应性，并挑战了异种抗体在AECA检测中是假阳性结果的观点。在异种抗原暴露后(可能比我们认为的要频繁得多)，忽视这些抗体可能会损害对AECA在不同人类动物疾病中的患病率和作用的正确评估。gydF4y2Ba

利益冲突声明gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

这项工作得到了西班牙卫生部卡洛斯三世卫生研究所的“卫生研究基金会”(FIS) PI10/01727和PI13/01098资助，以及欧盟委员会第七框架计划Health - f1 -2013-603049 TRANSLINK合作项目的支持。gydF4y2Ba

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