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摘要

背景:我们之前已经证明hsa-miR-520d-5p可以通过去甲基化过程和P53上调将未分化的肝癌细胞转化为多能干细胞或间充质干细胞(MSCs)在活的有机体内。在这里，我们检测了miR-520d-5p对三种人胰腺癌(PC)细胞的抗癌作用。

材料和方法:在生成表达gfp的癌细胞后，我们将520d-5p转染到3株PC细胞系(KLM-1、PK-45p和PK-9)中，检测关键基因的表达和恶性特性的变化。此外，我们使用血小板胶原偶联的miR-520d-5p (520d/血小板胶原)检测了520d-5p对KLM-1的治疗作用。

结果:与scramble/ atelocolen (scram/ atelocolen)或单独使用atelocolen相比，520d/ atelocolen每周可抑制肿瘤生长80%以上。有趣的是，520d-5p诱导PK-9细胞转化并伴随凋亡，转化为胰腺腺泡细胞一样的良性转化，具有分泌胰腺酶(脂肪酶或淀粉酶)的功能，无恶性性质。

结论这是我们首次证实520d/胶原蛋白对PC细胞有抗癌作用或良性转化的报道在活的有机体内研究。对该载体的优化开发有望提高进入每个肿瘤细胞的效率，并为miRNA药物提供一种新的治疗方式。

关键字

胰腺癌(pc)，胶原，mir-520d-5p，异种移植模型，重编程

介绍

成熟的mirna是内源性的、小的、非编码RNA (ncRNA)分子，长度为18-23个核苷酸，由RNA聚合酶II转录，作为转录后基因调控因子，在许多细胞过程中控制基因表达[1,2]或介导细胞分化、重编程和人类癌症的发生和进展[3-5]。miRNA表达水平的改变通过调控调控肿瘤细胞凋亡或增殖的靶基因的功能表达来影响肿瘤生长[6]。mirna在肿瘤发生过程中的核心作用已在不同类型的肿瘤中被研究，包括黑色素瘤、肝癌、脑肿瘤、乳腺肿瘤等[7-9]。

我们之前发现了一种RNA基因(RGM249可能通过诱导双链(ds)、小干扰(si)和短发夹(sh) rna间接调节未分化癌细胞系中hTERT(人类端粒酶逆转录酶)的表达。该基因的调控功能似乎与未分化癌症的细胞发育、细胞分化、抗炎作用和细胞生长有关[10]。我们的报告显示，三种sirna为一种小rna衍生自ncRNA在活的有机体内影响了肿瘤的转移或增殖能力在活的有机体内肿瘤生长[11]。

核糖核酸为基础的治疗方法已经发展到应用于癌症治疗。例如，已经对病毒载体、非病毒试剂或纳米颗粒进行了临床前或临床测试，以克服诸如不稳定性之类的问题在活的有机体内对器官或肿瘤组织的靶向不准确[12-18]。

我们也报道了明胶水凝胶微球或atelocolen用于皮下注射和精胺- pululan或atelocolen用于静脉注射的药物传递系统(dds)的安全性、有效性和特异性[19-23]。因此，我们阐明了mirna样分子的生理功能RGM249以及它们在癌变、分化和多能性中的作用，并研究它们在抗肿瘤治疗或再生医学中的潜在用途在活的有机体内。

miRNA的靶向是通过miRNA的5 '端与miRNA靶向基因的转录形式的编码区和/或非翻译区(UTRs)内的碱基对相互作用来实现的;3 ' UTR中的靶点导致更有效的翻译功能障碍[24,25]。由于一个miRNA通常靶向至少数百个mrna，因此被认为极难阐明miRNA的调控途径[26]。在miR-520d-5p可以将未分化的肝癌细胞转化为良性或正常状态的情况下在活的有机体内[27]，根据现有的生物信息学，有超过1000个可预测的靶基因。因为miR-520d-5p不仅对癌细胞有作用，对正常细胞也有作用，阐明了miR-520d-5p无毒性，无致瘤性在活的有机体内研究[28,29]中，我们在此检测了520d-5p与间胶原结合作为DDS载体对三种不同类型的PC细胞系的抗癌作用，包括治疗作用在活的有机体内研究。

材料与方法

Atelocollagen

Atelocollagen是一种经胃蛋白酶处理的高纯度I型小牛皮肤胶原蛋白(KOKEN Co.， Ltd, Tokyo, Japan)。

RNA制备

合成的20-nt rna以去保护、脱盐和退火的形式从KOKEN购买。我们制备的hsa-miR-520d-5p序列为5'-cuacaaagggaagcccuuuc-3';3“-uugauguuucccuucgggaaag-5”。非特异性对照miRNA双工也购自HSS (Sapporo, Japan)，重组序列为5'-gaguccgccucuauagacaa-3'。

miRNA/间胶原复合物的形成

根据制造商的说明书(KOKEN)，按照以下方法制备mirna和胶原蛋白复合物。简单地说，将等体积的1.0%的胶原蛋白[在pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中]和miRNAs溶液(PBS)混合，在4°C下旋转(4转/分)20分钟，然后在4°C下离心(10,000转/分)1分钟。该复合物用于接种免疫缺陷小鼠(KSN/Slc) (Shimizu Laboratory Supplies Co.， Ltd, Kyoto, Japan)。体内皮下注射和腹腔注射的终浓度(0.5%)分别为10 μM和40 μM。

siRNA/间胶原复合物的稳定性

在0.1 mg/ml RNase A (NipponGene, Tokyo, Japan)存在下，等量的0.9 mg mirna和0.5%间胶原复合物在37°C下孵育0、5、15、30、45和60分钟。然后用苯酚和苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)提取溶液。用乙醇沉淀mirna, 3.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙啶染色显示[29]。

细胞系和免疫缺陷小鼠

人PC细胞系(未分化型:KLM-1;中混型:PK-45p;高分化型PK-9)分别来自日本东北大学。在罗斯威尔公园纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 1640培养基(WAKO, Tokyo, Japan)中加入10%热灭活胎牛血清(FBS)， 37°C, 5% CO的湿化气氛中维持₂。共计5×10⁷收集细胞并使用26号针皮下、腹腔或静脉注射到小鼠体内。六周龄免疫缺陷小鼠接种在活的有机体内转染miR-520d-5p进行研究。使用免疫缺陷的KSN/Slc小鼠检测miR-520d-5p的抗转移作用或miR-520d-5p向正常状态的转化。腹腔注射戊巴比妥100 mg/kg麻醉小鼠。所有动物都在鸟取大学(Yonago, Japan)实验动物科学部饲养，并按照日本实验动物护理认证协会批准的协议进行饲养，动物研究和处理严格按照联邦机构动物护理和使用委员会的指导方针进行。本研究中报告的所有实验都得到了机构委员会(#13-Y-37， #18-2-41， #h27-074)的批准，并遵循了ARRIVE指南。

此外，利用人系膜细胞系293FT (Invitrogen Japan K.K.， Tokyo, Japan)生产表达gfp的慢病毒颗粒。简单地说，293FT细胞在添加10%胎牛血清、0.1 mM MEM非必需氨基酸溶液、2 mM l -谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养。我们将KLM-1、PK-45p和PK-9的6种重组物(重组物或520d-5p-重组物)分别缩写为scram/KLM-1、520d/KLM-1、scram/PK-45p、520d/PK-45p、scram/PK-9和520d/PK-9。

慢病毒载体的构建及肿瘤细胞报告基因的标记

为了检验miR-520d-5p过表达的影响，我们转染了pMIRNA1-miR-520d-5p/GFP (20 mg;System Biosciences, Mountain View, CA, USA)制成293FT细胞(5 x 10⁶细胞/ 10cm培养皿)。为了获得病毒颗粒，将细胞在17万g(120分钟，4°C)离心。收集病毒颗粒，用lentit - xtm qRT-PCR滴定试剂盒(Clontech, Mountain View, CA, USA)检测病毒拷贝数。对于感染到KLM-1细胞，1 × 10⁶每10厘米培养皿使用慢病毒拷贝数。目的评价表达GFP的慢病毒载体(pMIRNA1/GFP: 20 μg;System Biosciences, Mountain View, CA, USA)，使用EVOS FL细胞成像系统检测PC细胞中GFP的表达。在培养上清中不含病毒颗粒的转染物用于体内肿瘤形成。

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)基因表达分析

用mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion, Austin, TX, USA)从培养细胞或匀质小鼠组织中提取总RNA，包括小RNA部分。用Mir-X™miRNA qRT-PCR SYBR定量成熟miRNA (miR-520d-5p: 25 ng/μL)^®试剂盒(Takara Bio, Tokyo, Japan)。凝胶在相同的实验条件下运行。采用BioFlux LineGene (Toyobo, Nagoya, Japan)进行PCR和数据收集分析。为了分析RT-PCR结果，所有数据归一化到β-肌动蛋白内控。U6小核RNA也被用作内参。总RNA (25 ng/μl)逆转录扩增KAPA SYBR FAST一步定量rt - pcr试剂盒(NIPPON Genetics Co, Ltd, Tokyo, Japan)RNA定量通过测序确认，重复性高。补充表1显示了用于mRNA或miRNA定量的引物序列。数据采用单因素方差分析(ANOVA)或Mann-Whitney进行统计学分析U*: P < 0.05， **: P < 0.01。

补充表1本研究使用的引物如下图所示

本研究使用的引物
基因	感觉	反义	产品尺寸(bp)
东航	CGCATACAGTGGTCGAGAGA	GGCCAGTTGCTTCTTCATTC	131
喀斯特	ACGGTCATCCAGTGTTGTCA	TTGATTTGTCAGCAGGACCA	114
Oct4	CGGAAAGAGAAAGCGAACCA	CGGACCACATCCTTCTCCAG	135
Nanog	CAGAAGGCCTCAGCACCTAC	ACTGGATGTTCTGGGTCTGG	145
AICDA	CGTAGTGAAGAGGCGTGACA	TGTAGCGGAGGAAGAGCAAT	102
DNMT1	GCCTCAATGTTACCCTGGAA	CAGCAGATGGTGCAGTAGGA	120
HDAC2	AAATGGGGGTAACTCCTGCT	AGAATCAATGTGGGCCTGAC	130
Sin3A	TTTTTATGCGACTGCACCAG	CGTTCCCATTCTCTCTCTCG	105
MBD3	TGTCCCAGCTCCTTGAGACT	CAAAACTACGCCTCCAGACC	106
CD133	TGGCAACGTAGTGACTCAGG	ACAGGAAGGGAGGGAGTCAT	133
CD44	AAGGTGGAGCAAACACAACC	GCTTTTTCTTCTGCCCACAC	158
P53	GCTTCGAGATGTTCCGAGAG	TTATGGCGGGAGGTAGACTG	133
hTERT	GTGCACCAACATCTACAAGATCC	GTTCTTCCAACTTGCTGATGAAAT	144
原癌基因	GCCAGAGGAGGACGAGCTA	TGGACGGACAGGATGTATGC	125
RGM249	AGAGAATGGGTGTCCAAGAGG	GGTCATGTTCAGCTTCCCTTT	114
β肌动蛋白	ACCTGACTGACTACCTCATG	GCAGCCGTGGCCATCTCTTG	146
mir - 520 d - 5 - p	TCTACAAAGGGAAGCCCTTTCTG

结果

正如我们之前报道的[27]，我们提供了新的证据，证明miR-520d-5p可以通过干细胞介导的过程将HLF细胞转化为良性或正常状态。在本研究中，我们评估了对PC细胞的肿瘤抑制作用在体外并尝试使用间胶原作为DDS载体的生物材料来检测miRNA对三种细胞系(KLM-1、PK-45p或PK-9)的治疗效果，尽管它完全渗透到由肿瘤组织组成的所有肿瘤细胞中，导致活细胞或多或少地保留。我们将520d-5p慢病毒转染到PC细胞在体外并证实了球体样群体的形成，这些群体表达报告基因(GFP)(图1)，多能标记Nanog和Oct4, P53, HDAC和CD105(图1)，通常在转染物中表达。我们确认miR-520d在其中表达后(图1)，用流式细胞术分析它们的DNA含量，结果发现它们在S期呈均匀增殖状态，在g1前期呈凋亡细胞群状态(图2和3)。与模拟/KLM-1或KLM-1细胞不同，520d/KLM-1细胞在迁移实验中没有穿过纤维连接蛋白膜(图3)。

图1所示。PC细胞系表型(520d/KLM-1:左;520 d / PK-45p:中间;520d/PK-9:右)具有代表性(放大x100倍)。球状细胞包括小尺寸的细胞群(左上)。通过有效诱导(99%以上)，我们证实了GFP在转染物中的表达(放大x100)(右上)。表型变化不足以评估其是良性还是恶性。520d-5p在520d-转染株中有显著表达(*:Mann-Whitney检验P<0.01)U测试)(底部)。分别显示520d/KLM-1、520d/PK-45p和520d/PK-9中基因表达和miR-520d与模拟转染物的表达关系。所有表达数据均标准化至β-actin表达水平

图2。FACS分析有代表性地显示，gfp阳性的520d/KLM-1细胞(上中)在S期的DNA含量高于gfp阳性的模拟细胞/KLM-1细胞(左)。520d/KLM-1在g1期前有我们在模拟转染中找不到的细胞组分(右下)

图3。使用纤维连接蛋白膜(5 μg/ml)进行迁移实验，评估miR-520d-5p (520d/KLM-1)处理的KLM-1和模拟转染的KLM-1 (sram ./KLM-1)的侵袭能力。大多数520d/KLM-1细胞不能穿过细胞膜(左下)。同样，在PK-45p(分别为左上或中下)或PK-9(分别为右上或右下)中进行FACS分析或迁移试验。520d/PK-45p和520d/PK-9分别诱导均质增殖伴或不伴凋亡期(左上或右上)。迁移实验显示PK-45p或PK-9不能通过膜(中下或右下)

我们进行了在活的有机体内在确认了GFP和520d-5p的强烈表达后，我们使用520d-5p偶联的atelocolen (520d/ atelocolen)来评估对癌症组织的主题效应(图4)。将KLM-1细胞皮下接种到裸鼠体内(图4)，在肿瘤大小达到5- 8mm后(相当于接种后约3-4周)，每周注射一次520d/ atelocolen。记录皮下注射520d/ atelocolen后的平均荧光强度，如图4所示。皮下注射的KLM-1肿瘤被显著抑制，直到14周，随后复发肿瘤快速生长(图4)。

图4。我们使用慢病毒构建生成表达GFP的KLM-1 (KLM-1/GFP)细胞后，通过随后注射520d/ atelocolcollagen检测其治疗效果

1. 测量肿瘤的平均荧光强度，我们代表性地显示它们直到第八周(每个底部)。观察期间维持GFP表达。虚线表示对照的肿瘤生长情况。
2. 概述的在活的有机体内520d/ atelocolen在异种移植模型中的研究(下)。与对照组相比，520d/血小板胶原复合物组的肿瘤体积明显受到抑制。*: Mann-Whitney标准P<0.01U测试。13W ~ 17W(牺牲点)肿瘤虽给予间胶原结合药物，但生长迅速。↓:注射复合物(每周1次)，▲:单独使用胶原蛋白，●:scramble/胶原蛋白，■:miR-520d-5p/胶原蛋白(生长抑制组)，□:miR-520d-5p/胶原蛋白(肿瘤消失组)，*:小鼠死亡，CI:置信区间。

对于KLM-1肿瘤，皮下模型中肿瘤大小、腹腔模型和全身模型(转移)的平均抑制率分别为89.0%、75.0%(6/8)和100%(8/8)(表1)。miR-520d-5p对皮下肿瘤或转移的抑制作用是根据周数据或牺牲结果计算的。25.0%(2/8)表达GFP的KLM-1细胞接受520d-5p (520d/KLM-1/GFP)后，信号逐渐减弱，在520d-5p后消失^th但75.0%(6/8)的肿瘤在大约14周后出现类似的肿瘤缩小，随后肿瘤开始生长(图4和5)，而表达GFP的KLM-1细胞接受争夺(争夺/KLM-1/GFP)，显示GFP信号摄取并逐渐生长(图5)。切除肿瘤、注射部位或主要器官(包括血管)后检查组织学变化。观察期结束时切除的可见肿瘤不再抑制生长，我们观察到切除的肿瘤被白色的间胶原占据。此外，本研究还评估了不良反应和毒性。在6个月的时间里，25%(2/8)的肿瘤接种小鼠可以观察到，它们的活动保持正常，没有体重减轻或厌食，也没有因输注胶原蛋白而发生毒性反应(如栓塞)。

图5。520d-5p/胶原蛋白的治疗效果在活的有机体内成像系统具有代表性。各接种部位有25.0%(2/8)的肿瘤消失，520d-5p组肿瘤生长明显受到抑制，其余小鼠肿瘤转移能力完全被抑制。520d/KLM-1/GFP细胞(520d-5p转染和GFP表达的KLM-1)或scram的时间过程。/KLM-1/GFP细胞(重组转染表达GFP的KLM-1)被描绘(上或下，具有代表性)

1. 1-2毫米突出但未生长的肿瘤病变
2. 牺牲后对注射部位进行宏观观察。病灶完全被间胶原蛋白占据，呈白色，镜下未见活的肿瘤细胞。

表1。在KLM-1细胞中，与对照组相比，皮下模型的肿瘤体积抑制率(%)，腹膜模型的治疗效果，或尾静脉注射的抗转移效果。我们观察到89%的肿瘤抑制效果，75%的治疗效果和100%的抗转移效果

miR-520d-5p/血小板胶原复合物在异种移植模型中的治疗效果总结
	抑瘤作用		治疗效果		转移抑制作用
癌症细胞	皮下模型 (每组n=8) 8周，平均%		腹膜模型 (每组n=8) %(有效/总数)		尾静脉模型 (每组n=8) %(有效/总数)
KLM-1(未分化PC细胞)	89		75.0 (6/8)		100 (8/8)

有效/总数:肿瘤消失小鼠数/被检查小鼠总数。

8周，平均%:8周观察期间，与对照组相比，每周肿瘤抑制率的平均值。

此外，当我们腹腔注射520d-5p转染的胰腺导管腺癌细胞(PK-9)时(n=8)，我们未观察到肿瘤形成(50.0%;4/8)，无肿瘤的出血性腹水(25.0%;2/8)，腹壁注射部位良性囊肿形成(25.0%;2/8)，尽管模拟转染的PK-9在腹腔内产生了许多肿瘤结节。箭头表示腹膜内结节(图6)和三种表型，包括未形成肿瘤(图6)、出血性腹水(图6)和20mm囊肿形成(图6)。我们检查出血性腹水是否含有癌细胞，但显微镜下未检出肿瘤细胞。因此，我们假设由520d-5p转化的胰腺细胞产生的消化液破坏了腹腔组织。结果，液体中含有脂肪酶和淀粉酶，另一方面，虽然最初的癌细胞产生了微弱的胰蛋白酶，但没有检测到胰蛋白酶。碘-淀粉反应表明，与小鼠#4(图6)不同，小鼠#1和#2在出血性腹水中含有少量淀粉酶，而小鼠#3在囊肿内容物中含有淀粉酶(图6)。在本研究中，在转染物中从未见过恶性表型。

图6。尽管老鼠接受了scram。/PK-9细胞腹腔内产生多发肿瘤结节(左上，箭头)，520d/PK-9细胞未形成肿瘤(右上)，诱导出血性腹水(左下)，或形成20mm囊肿(右下)。未见恶性肿瘤形成

1. 由于在出血性腹水中观察到癌细胞与我们的猜测相反，我们检查了碘-淀粉反应作为胰腺相关特性的代表。在腹水中检测除脂肪酶外的微量淀粉酶(下中图:小鼠#1、#2)。在一个囊性肿瘤(右上:小鼠#3)中检测到与对照组(左上)相似量的淀粉酶。

讨论

以核糖核酸为基础的药物传递载体经历了多次改进。由于RNA分子在生物技术处理或应用时具有不稳定性，因此开发其配方或优化分子本身的修饰是一个紧迫的问题在活的有机体内研究评估有用性[31-33]。越来越多的证据表明，mirna与包括肿瘤发生或肿瘤进展在内的许多生物学过程密切相关[34-36]。纳米颗粒[37]、阳离子聚合物[38]、反义[31]或模拟RNA[39]、病毒[13,40]和人工病毒[41]的改进被大力加入，以获得更高的质量。胶原蛋白也是一种DDS载体，用于化妆品或整形和重建手术。这种生物材料扩展了在癌症治疗中腹腔或全身给药以及皮下注射的可能性[23,42-45]。

在本研究中，我们首先尝试通过皮下注射胶原组织来检测miR-520d-5p的抑瘤作用。由于该DDS载体不能渗透到所有的癌细胞中，肿瘤组织中仍有活的癌细胞存在，根据先前的报道，IV级前列腺腺癌细胞中有游离胶原的积累[46]，我们利用我们建立的检测系统优化注射条件[29]。每周肿瘤大小均明显抑制肿瘤生长。在KLM-1细胞中，当肿瘤大小不超过8mm时，我们开始向皮下肿瘤注射520d/ atelocolcollagen。P53、Nanog上调，AICDA下调，与其他未分化的癌细胞(胶质母细胞瘤、PC、间变性甲状腺癌)均有相同的表达。在体外与亲代或扩增转染的细胞相比，实验不能明显证实小鼠在瘤内的表达。虽然大多数小鼠体内没有充分生长出任何肿瘤结节，但最突出的效果是抑制转移。只有当我们不是在肿瘤内注射药物，而是从肿瘤周围包裹肿瘤时，具有肿瘤抑制作用的小鼠即使在肿瘤周围组织中也没有出现任何(微)转移的发现。在本研究中我们不能忽视的另一个结果是，在PC细胞中，与分化类型无关，转染microRNA后可能观察到细胞凋亡，尽管在未分化型肝癌细胞(HLF)中观察到的不是细胞凋亡，而是转染物的转化。因此，我们假设P53上调先于PC细胞的去甲基化过程(图7)。如果去甲基化过程先于P53上调，则转染主要被诱导转化，正如我们之前在HLF中报道的那样[27]。因此，我们推测这两种诱导过程中哪个过程先于哪个过程取决于细胞类型的分子反应。此外，只有实现520d转染的高效率，PC细胞才有可能通过重编程过程转化为恶性肿瘤的丧失。

这种现象可能与间胶原具有预防免疫刺激不良反应[46]和免疫反应抑制作用有关[27]。因此，520d/胶原蛋白作为DDS载体可能是一个值得研究的分子，其作用机制和药效学有待进一步研究。

因此，520d/间胶原可能是一种有效的生物材料，作为治疗药物的可选候选。由于将这种偶联材料引入靶细胞或靶组织的效率尚不清楚，因此需要进一步仔细的研究，以研究其在人体中的应用。

图7。在PC细胞中，我们观察到凋亡部分和合成增殖，包括体内良性转化。混合表型可能由两个分子因素解释。当P53上调先于去甲基化过程时，凋亡诱导可能主要出现。当去甲基化过程先于P53上调时，重编程(恶性肿瘤的丧失)可能被诱导而不发生细胞凋亡。黑色箭头(向下或向上)分别表示细胞死亡或存活状态。黄色箭头和三角形表示去甲基化过程，蓝色箭头和三角形表示P53上调过程

结论

综上所述，本研究为520d-5p/血小板胶原载体是一种有用的生物材料提供了第二个证据在活的有机体内异种移植物模型或临床应用于抗癌治疗。此外，520d/ atelocolen可以作为一种新的抗癌药物，既可以诱导细胞凋亡，也可以诱导细胞转化。

致谢

我们感谢Satoshi Kuwamoto博士和Junichi Hasegawa博士协助进行病理检查并为本研究提供环境。

作者的贡献

作者对其贡献作了如下声明:NM构思和设计实验，YI和KM进行实验，KM分析数据，YI和YM提供试剂/材料/分析工具。YI, NM和KM撰写了手稿。

资金

这项工作得到了技术种子促进研究资助B(发展型)、武田科学基金会、高松公主癌症研究基金(11-24313)和日本科学技术振兴机构(JST)通过目标驱动研发(探索性研究)的适应性和无缝技术转移计划的支持。

数据和材料的可用性

支持本文结论的数据集包含在本文中。任何数据和材料的要求都可以发送给通讯作者。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

所有动物实验方案均经鸟取大学伦理委员会(机构动物护理和使用委员会)批准。

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